褪黑素減輕高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制

劉婉卿，但章勇，周 青，汪 淵，王 怡，朱華慶

褪黑素(melatonin, MLT)是一種主要由人和哺乳動(dòng)物松果體合成分泌的一種吲哚類激素，其化學(xué)名是N-乙?；?5-甲氧基色胺，又稱為松果體素[1]。在體內(nèi)，MLT發(fā)揮著抗炎抗氧化、清除自由基、抗細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能[2-3]。血管內(nèi)皮由一層薄薄的扁平細(xì)胞所組成，它形成血管的內(nèi)壁，是血管管腔內(nèi)血液及其他血管壁(單層鱗狀上皮)的接口。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭等[4]。糖尿病常并發(fā)大血管或微血管病變，導(dǎo)致糖尿病心肌病、糖尿病腎病、視網(wǎng)膜并發(fā)癥等，這些病理過(guò)程常與血管內(nèi)皮損傷緊密相關(guān)[5]。在本實(shí)驗(yàn)中，用高糖環(huán)境模擬人體糖尿病條件，探究人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)在MLT干預(yù)下?lián)p傷與修復(fù)的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑 MLT(南京都萊生物技術(shù)有限公司)；DMEM低糖培養(yǎng)基和胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(美國(guó)Sigma公司)；Hoechst 33342/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；葡萄糖(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；胰酶、青鏈霉素、蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液、活性氧檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；anti-GRP78、anti-ATF4、anti-CHOP、anti-IRE1α、anti-PERK、anti-ATF6α、anti-NLRP3、anti-cleaved caspase-1、anti-IL-1β抗體(美國(guó)CST公司)；anti- GAPDH、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 ZHJH-C1112C型超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司)；HERA CELL VIOS 160 i型恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；-80 ℃超低溫冰箱(日本SANYO電器股份有限公司)；電泳儀及電泳槽(北京六一儀器廠)；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(上海歐翔公司)；TDZ4-WS低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；磁力攪拌器(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；pH儀(上海雷磁儀器廠)；CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECKMAN COULTER公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1HUVEC細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC細(xì)胞購(gòu)自于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，傳代至第三代，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h換液，待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)傳代，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸，以200 μl/孔(2×103個(gè)細(xì)胞)接種于96孔板中，分為10組：對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、模型組、治療組(MLT濃度分別為10、20、40、60、80、100、160 μmol/L)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)上清液，PBS洗滌3次后分別給予正常完全培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)、含與治療組等量的二甲基亞砜的正常完全培養(yǎng)基、高糖完全培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為30 mmol/L)、含相應(yīng)濃度的MLT的高糖完全培養(yǎng)基處理。作用48 h后每孔加入20 μl(5 mg/ml)的MTT，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，振蕩溶解后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度(A490)值。

1.2.3LDH釋放量檢測(cè) 將HUVEC細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、模型組和治療組。細(xì)胞均勻接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組用5.5 mmol/L葡萄糖濃度的普通培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，模型組用30 mmol/L葡萄糖濃度的高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，治療組用含有100 mmol/L MLT的30 mmol/L葡萄糖濃度的高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。處理48 h后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的釋放量。

1.2.4細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平檢測(cè) 將細(xì)胞種于6孔板中，同1.2.3項(xiàng)處理 48 h后收集各組處理后的細(xì)胞，并用無(wú)血清培養(yǎng)基以1 ∶1 000稀釋DCFH-DA。以每孔800 μl的體積重懸細(xì)胞，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，每隔5 min顛倒混勻1次，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5Hoechst 33342/PI雙染 將細(xì)胞種于玻底培養(yǎng)皿中，同1.2.3項(xiàng)處理48 h后棄去培養(yǎng)上清液，用PBS洗滌2次。取100 μl試劑C加900 μl無(wú)菌純水稀釋，混勻即成1×染色緩沖液工作液，每皿加入1 ml工作液，再加入10 μl Hoechst 33342染色液A，輕輕混勻后4 ℃避光孵育10 min。在每皿加入10 μl PI染色液B，輕輕混勻后4 ℃避光孵育10 min。PBS洗滌細(xì)胞后用共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果。

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞消化后以相同的量接種于100 mm直徑的細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待完全貼壁后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3次，同1.2.3項(xiàng)處理48 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，每皿加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上充分裂解細(xì)胞，14 000 r/min 4 ℃離心20 min。吸取上清液，根據(jù)BCA法測(cè)定的蛋白濃度，以4 ∶1的比例加入相應(yīng)體積的總蛋白和5×蛋白上樣緩沖液，振蕩混勻后在100 ℃水浴中煮沸15 min使蛋白完全變性，冷卻后置于-80 ℃冰箱中保存。電泳時(shí)每泳道加入20 μg的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。TBST洗滌3次，TBS洗滌1次，每次5 min，分別孵anti-GRP78、anti-ATF4、anti-CHOP、anti-IRE1α、anti-PERK、anti-ATF6α、anti-NLRP3、anti-cleaved caspase-1、anti-IL-1β、anti-GAPDH一抗(1 ∶1 000),置于4 ℃冰箱搖床孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，TBS洗滌1次，每次5 min。孵二抗羊抗兔(1 ∶5 000)、羊抗鼠(1 ∶3 000)，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗滌3次，TBS洗滌1次，每次5 min，加ECL顯影液顯影。以GAPDH作為內(nèi)參，用Quantity One軟件分析結(jié)果，蛋白表達(dá)水平以目的蛋白/GAPDH的平均灰度值比值表示。

2 結(jié)果

2.1 MLT對(duì)高糖刺激下的HUVEC細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組HUVEC增殖水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.484；P<0.001)。與模型組相比，治療組HUVEC的增殖水平升高，并且在MLT濃度為 100 μmol/L時(shí)細(xì)胞增殖水平最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.328；P<0.001)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用100 μmol/L作為治療組MLT濃度。溶劑對(duì)照組與對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 高糖及MLT干預(yù)48 h后細(xì)胞培養(yǎng)圖片 ×200A：對(duì)照組；B：模型組；C：治療組

表1 不同濃度MLT對(duì)高糖刺激的HUVEC增殖的影響

2.2 MLT對(duì)高糖刺激的HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH釋放量的影響根據(jù)測(cè)量所得結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組培養(yǎng)上清液中LDH釋放量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.785，P<0.05)；與模型組相比，在MLT干預(yù)下，治療組培養(yǎng)上清液中LDH釋放量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.144，P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 MLT對(duì)高糖刺激的HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH釋放量的影響(n=3)1：對(duì)照組；2：模型組；3：治療組；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.3 MLT對(duì)高糖刺激的HUVEC細(xì)胞中ROS生成的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組HUVEC細(xì)胞中ROS水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，治療組HUVEC細(xì)胞中ROS水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 MLT對(duì)高糖刺激的HUVEC細(xì)胞中ROS生成的影響(n=3)1：對(duì)照組；2：模型組；3：治療組；與對(duì)照組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.01

2.4 MLT對(duì)高糖刺激的HUVEC細(xì)胞中Hoechst 33342/PI染色變化的影響共聚焦顯微鏡拍攝結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組HUVEC細(xì)胞中藍(lán)色熒光和紅色熒光增加；與模型組相比，治療組HUVEC細(xì)胞中藍(lán)色熒光和紅色熒光減少。見(jiàn)圖4。

圖4 MLT對(duì)高糖刺激的HUVEC細(xì)胞中Hoechst 33342/PI染色變化的影響 ×200

2.5 MLT對(duì)高糖刺激的HUVEC細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、ATF4、CHOP、IRE1α、PERK、ATF6α表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組HUVEC細(xì)胞中GRP78、ATF4、CHOP、IRE1α、PERK、ATF6α蛋白相對(duì)表達(dá)水平均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，治療組HUVEC細(xì)胞中GRP78、ATF4、CHOP、IRE1α、PERK、ATF6α蛋白相對(duì)表達(dá)水平均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖5 MLT對(duì)高糖刺激的HUVEC細(xì)胞中GRP78、ATF4、CHOP、IRE1α、PERK、ATF6α蛋白表達(dá)的影響1：對(duì)照組；2：模型組；3：治療組；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

2.6 MLT對(duì)高糖刺激的HUVEC細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組HUVEC細(xì)胞中NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)水平均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，治療組HUVEC細(xì)胞中NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)水平均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖6。

圖6 MLT對(duì)高糖刺激的HUVEC細(xì)胞中NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)的影響1：對(duì)照組；2：模型組；3：治療組；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

3 討論

高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷一直是心血管疾病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在糖尿病病程中，內(nèi)皮細(xì)胞顯著受損，內(nèi)皮功能發(fā)生障礙。但在此過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與修復(fù)機(jī)制一直尚未明確。本實(shí)驗(yàn)以HUVEC為例，以含高濃度葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)基模擬體內(nèi)糖尿病環(huán)境，MLT為干預(yù)藥物，探究了高糖刺激導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷及MLT對(duì)其調(diào)控機(jī)制是否與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞焦亡有關(guān)。經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)證明，高糖誘導(dǎo)下內(nèi)皮細(xì)胞的增殖水平下降，胞膜完整性被破壞，經(jīng)MLT干預(yù)后內(nèi)皮細(xì)胞增殖水平升高，胞膜完整性的破壞得到一定緩解。ROS是分子氧的活性中間體，當(dāng)活性氧生成和抗氧化防御之間失去平衡時(shí)，內(nèi)皮功能就會(huì)發(fā)生障礙，在代謝性和動(dòng)脈粥樣硬化疾病中導(dǎo)致血管損傷[6]。因此，可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS生成的變化來(lái)判斷內(nèi)皮損傷的程度。在本實(shí)驗(yàn)中，高糖刺激下的內(nèi)皮細(xì)胞中ROS生成量增加，MLT干預(yù)后ROS生成量相對(duì)下降。上述實(shí)驗(yàn)表明MLT可以減少內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，從而緩解高糖刺激對(duì)內(nèi)皮功能的損傷。Hoechst 33342可以穿透細(xì)胞膜，染色后凋亡細(xì)胞藍(lán)色熒光會(huì)比正常細(xì)胞增強(qiáng)。PI不能穿透細(xì)胞膜，對(duì)于壞死細(xì)胞，其細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，PI可以進(jìn)入壞死細(xì)胞對(duì)核染色，使細(xì)胞紅色熒光增強(qiáng)。在本實(shí)驗(yàn)中，高糖刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中藍(lán)色熒光和紅色熒光增加，MLT干預(yù)后的內(nèi)皮細(xì)胞中藍(lán)色熒光和紅色熒光減少，表明MLT在此過(guò)程中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了一定的保護(hù)作用。

當(dāng)機(jī)體發(fā)生低氧、錯(cuò)誤折疊、突變蛋白積累或者處于高糖誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)水平升高[7]，將導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction，UPR)。UPR的主要功能是恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生理活性，調(diào)控細(xì)胞凋亡和其他適應(yīng)性反應(yīng)。有研究[8]表明，ERS是糖尿病、肥胖、脂肪肝、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化等代謝綜合征發(fā)病的重要因素。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊和防止蛋白質(zhì)聚集，是UPR信號(hào)的主啟動(dòng)子。非ERS 狀態(tài)下，GRP78與蛋白激酶RNA樣ER激酶(PERK)、肌醇酶1α(IRE1α)和轉(zhuǎn)錄激活因子6(ATF6)結(jié)合，以復(fù)合物的形式存在。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞損傷時(shí)，ERS 啟動(dòng)，GRP78 從復(fù)合物狀態(tài)中解離并激活[9]，通過(guò)PERK、ATF6、IRE1α 三條途徑，激活下游的eIF2α、CHOP、ATF4等通路[9-10]，加速蛋白質(zhì)折疊和降解，重新建立ER穩(wěn)態(tài)。

NLRP3炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物，識(shí)別PAMPs或損傷相關(guān)分子模式(DAMP)，并招募和激活炎癥蛋白酶caspase-1[11]。在細(xì)胞焦亡過(guò)程中，活化的cleaved caspase-1將pro-IL-1β和pro-IL-18切割形成成熟形式IL-1β、IL-18，同時(shí)切割GSDMD的N端序列，在細(xì)胞膜上形成孔道，細(xì)胞膜完整性破壞，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外，細(xì)胞崩解死亡。有研究[12]表明， UPR時(shí)IRE1α-XBP1軸的選擇性激活可以刺激NLRP3的活化。同時(shí)有證據(jù)[13]表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與炎癥小體誘導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，它們之間的復(fù)雜相互作用是炎癥疾病潛在的治療靶點(diǎn)。

在既往的研究[14]中，MLT可以通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路來(lái)抑制高糖誘導(dǎo)下的成骨細(xì)胞凋亡。另有研究[15]表明，MLT可以通過(guò)抑制鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠神經(jīng)元細(xì)胞焦亡和自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但在內(nèi)皮細(xì)胞中，MLT是否可以通過(guò)相似的調(diào)控方式減輕高糖帶來(lái)的內(nèi)皮損傷還尚不明確。該研究中，高糖刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中GRP78、ATF4、CHOP、IRE1α、PERK、ATF6α蛋白表達(dá)水平提升，在MLT干預(yù)后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，推測(cè)MLT的調(diào)控過(guò)程與ERS有關(guān)；同時(shí)高糖刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)水平提升，MLT干預(yù)后同樣出現(xiàn)下降趨勢(shì)，推測(cè)MLT可能是通過(guò)抑制細(xì)胞焦亡對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。但在此過(guò)程中，這兩種調(diào)控機(jī)制之間是否存在關(guān)聯(lián)，以及關(guān)聯(lián)的具體靶點(diǎn)還仍需進(jìn)一步探索。

糖尿病心血管并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病病死率增加及影響糖尿病患者生活質(zhì)量的重要因素。該研究結(jié)果表明，MLT可以減輕高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞焦亡有關(guān)。該研究或許為糖尿病等代謝類疾病的治療提供了新的思路，為后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供了有力的佐證。