1型糖尿病食蟹猴左心室心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化

滕夏虹，陳 帥，鄒春林，杜可晨，曹津津，宋 瓊

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種獨(dú)立的、特異的心肌疾病，也是糖尿病致死的主要原因之一。青少年糖尿病患者發(fā)生心血管并發(fā)癥如急性心肌梗死的平均年齡在14.6歲[1]。有研究[2]表明，1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)青少年患者更容易出現(xiàn)嚴(yán)重的心肌損傷，并且男性心肌順應(yīng)性低于女性。目前關(guān)于T1DM引起心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變的研究較少。由于非人靈長類動物在解剖結(jié)構(gòu)、遺傳、生理和病理等方面與人類近似，能較好地模擬人類疾病發(fā)生發(fā)展的過程。該研究擬通過建立T1DM食蟹猴模型，初步探索長期高血糖條件下心肌組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗動物及分組 選用6只3歲雄性食蟹猴(廣西瑋美生物科技有限責(zé)任公司提供[編號：SCXK桂2007-0002])，并飼養(yǎng)于廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司的靈長類實(shí)驗室[編號：SYXK桂2004-0003],隨機(jī)分為2組：①模型組(T1DM組)：通過靜脈注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)構(gòu)建T1DM食蟹猴模型，其編號分別是M1、M2、M3；②對照組：正常食蟹猴, 其編號分別是C1、C2、C3。在實(shí)驗操作中按3R原則給予實(shí)驗動物人道主義關(guān)懷，嚴(yán)格按照國際實(shí)驗動物評估和認(rèn)可管理委員會規(guī)定和要求對實(shí)驗動物進(jìn)行日常的飼養(yǎng)和管理，實(shí)驗中所有涉及動物的實(shí)驗方案均得到了廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司實(shí)驗動物關(guān)懷與使用倫理委員會的批準(zhǔn)(編號：W00013)。

1.1.2儀器與試劑 樂康全2型血糖儀和優(yōu)越血糖試紙購自羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司；胰島素筆式數(shù)顯注射筆(諾和筆)購自諾和諾德(天津)生物技術(shù)有限公司；精蛋白生物合成人胰島素注射液(諾和靈50R胰島素筆芯)購自諾和諾德(中國)制藥有限公司；H-7650型透射電子顯微鏡購自日本日立公司；UC7型超薄切片機(jī)購自德國徠卡公司。STZ購自Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司；檸檬酸和檸檬酸鈉購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；0.9%氯化鈉注射液購自購自安徽豐原藥業(yè)股份有限公司；硫酸阿托品注射液購自上海禾豐制藥有限公司；鹽酸氯胺酮注射液購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1T1DM食蟹猴模型的誘導(dǎo) 模型組3只雄性食蟹猴禁食12～15 h后，予以10 mg/kg氯胺酮和0.04 mg/kg阿托品麻醉后，靜脈注射STZ 68 mg/kg (用0.1 mmol/L、pH 4.5檸檬酸緩沖液和0.9%氯化鈉注射液配成5 mg/ml濃度)；對照組靜脈注射等體積的溶劑混合液。靜脈注射STZ后第1周每天監(jiān)測空腹和非空腹血糖，自第2周開始每周2次監(jiān)測空腹和非空腹血糖，當(dāng)模型組動物血糖升高至11.1 mmol/L以上，需使用皮下注射胰島素維持代謝穩(wěn)定及長期存活。

1.2.2T1DM食蟹猴模型皮下注射胰島素的原則 T1DM模型組動物在每天早上喂食前測量空腹血糖。當(dāng)血糖小于11.1 mmol/L范圍內(nèi)時，無需進(jìn)行胰島素皮下注射；當(dāng)血糖在11.1～16.6 mmol/L范圍內(nèi)時，需要皮下注射1～2 U胰島素；當(dāng)血糖在16.6～22.2 mmol/L范圍內(nèi)時，需要皮下注射2～4 U胰島素；當(dāng)血糖大于22.2 mmol/L，需要皮下注射4～6 U胰島素。注射胰島素后隨時觀察動物活動行為和監(jiān)測血糖，防止因胰島素過量而導(dǎo)致低血糖性休克，并控制血糖在11.1 mmol/L以上。

1.3 組織制備和檢測指標(biāo)

1.3.1電鏡標(biāo)本制備和觀察 T1DM食蟹猴模型造模成功4年后，對T1DM模型組和對照組實(shí)驗動物進(jìn)行安樂死，迅速取材，取左心室前壁心肌組織并切成體積大約為1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，用3%戊二醛4 ℃固定過夜，1%鋨酸室溫固定1 h，逐級乙醇-丙酮脫水，用Epon 812環(huán)氧樹脂包埋、聚合，利用徠卡UC7超薄切片機(jī)切成70 nm超薄切片，經(jīng)2%醋酸雙氧鈾染色和6%檸檬酸鉛染色雙重染色后，于日立H-7650透射電子顯微鏡(電壓80 kV，放大倍率在5 000～70 000倍之間)觀察，在透射電子顯微鏡下，觀測左心室心肌組織超微結(jié)構(gòu)，選擇反差效果好、無污染及損壞的部位，隨機(jī)選取視野進(jìn)行拍照采集圖片。

1.3.2左心室心肌細(xì)胞線粒體和心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞體視學(xué)分析 采用Image-Pro Plus 6.0軟件(美國Media Cybernetics公司)，測定左心室心肌細(xì)胞線粒體數(shù)目、周長和面積，測定左心室心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中吞飲小泡的數(shù)目、內(nèi)皮細(xì)胞基膜厚度。根據(jù)Delesse原理，二維圖像上兩種結(jié)構(gòu)截面的比等于它們在空間結(jié)構(gòu)的體積比，從而計算出線粒體的體積密度、表面積密度、表面積體積比、相對數(shù)量和相對電子密度。體積密度：反映細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體在單位體積細(xì)胞質(zhì)的相對體積；表面積密度：反映單位體積細(xì)胞質(zhì)中的線粒體膜表面積；表面積體積比：線粒體表面積與線粒體體積的比值，反映線粒體形態(tài)。相對數(shù)量:單位體積細(xì)胞質(zhì)中線粒體或單位內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)吞飲小泡的數(shù)量。相對電子密度：單位線粒體面積內(nèi)相對電子密度。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建T1DM食蟹猴模型T1DM模型組編號M1～M3食蟹猴空腹血糖變化如圖1所示，注射STZ后10 d開始T1DM模型組食蟹猴的空腹血糖大于11.1 mmol/L,提示T1DM 食蟹猴模型構(gòu)建成功。

圖1 T1DM食蟹猴模型組空腹血糖A：注射STZ前；B:注射STZ后10 d；C:注射STZ后1年；D:注射STZ后2年；E:注射STZ后3年；F:注射STZ后4年

2.2 對照組左心室心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)心肌細(xì)胞排列整齊，胞質(zhì)充滿大量平行排列的肌原纖維，I帶、A帶、H帶與Z線、M線均形成明暗相間的肌節(jié)結(jié)構(gòu)(圖2A、B)；相鄰細(xì)胞間閏盤呈階梯狀，結(jié)構(gòu)完整、清晰、連續(xù)(圖2C)；胞質(zhì)較豐富，內(nèi)含各種細(xì)胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常，可見豐富的線粒體和糖原，可見少量脂滴；心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體豐富，體積較大為橢圓形或長桿狀，呈線性網(wǎng)狀排列在肌原纖維之間，線粒體核膜完整，線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰，基質(zhì)密度及結(jié)構(gòu)正常，線粒體周圍有糖原分布(圖2A、D)；心肌細(xì)胞核和核仁顯示良好，細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)分布較均勻，未見核裂解及固縮現(xiàn)象(圖2E)；心肌細(xì)胞肌原纖維橫斷面、粗細(xì)肌絲呈六角點(diǎn)陣排列(圖2F)。微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平狀，細(xì)胞核完整，細(xì)胞器較少。

圖2 正常對照組食蟹猴左心室心肌超微結(jié)構(gòu)A：胞質(zhì)內(nèi)肌原纖維 ×15 000；箭頭所示為平行排列的肌原纖維；B：明暗相間的肌節(jié)結(jié)構(gòu) ×30 000；C：閏盤連續(xù)，結(jié)構(gòu)完整 ×30 000；D：線粒體豐富，線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰 ×15 000；E：心肌細(xì)胞核及核仁顯示良好 ×5 000；星形所示為心肌細(xì)胞細(xì)胞核；F：粗細(xì)肌絲呈六角點(diǎn)陣排列 ×70 000

2.3 T1DM模型組左心室心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)心肌細(xì)胞肌絲束斷裂凝聚，肌原纖維排列紊亂，局部溶解斷裂、分離，Z線、M線模糊斷續(xù)，肌節(jié)結(jié)構(gòu)模糊，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張(圖3A、B)；閏盤不連續(xù)、扭曲、模糊，閏盤處細(xì)胞連接不完整，閏盤間隙增寬，中間連接增寬，閏盤處的肌原纖維溶解斷裂(圖3C)；胞質(zhì)內(nèi)含細(xì)胞器較少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體腫脹變形，脂滴數(shù)量增多(圖3E、I)；肌原纖維排列紊亂，呈短片狀，胞質(zhì)疏松、水腫、T管擴(kuò)張，細(xì)胞間質(zhì)膠原纖維增多(圖3F、G)；肌原纖維間線粒體分布不均勻，可見局部堆積大量大小不等、形態(tài)各異的線粒體，線粒體嵴變形、扭曲，局部線粒體基質(zhì)溶解消失，形成空泡區(qū)，細(xì)胞膜下線粒體部分呈髓鞘樣變(圖3A、B、D、E)；心肌細(xì)胞核核膜皺縮變形，細(xì)胞核邊位，染色體固縮，呈多塊聚邊，核膜表面凹凸不平(圖3G)；心肌細(xì)胞橫斷面粗、細(xì)肌絲比例及分布異常(圖3H)。

圖3 1型糖尿病模型組食蟹猴左心室心肌超微結(jié)構(gòu)A：肌原纖維局部溶解斷裂 ×15 000；箭：斷裂的肌原纖維；B：Z線、M線模糊斷續(xù)，局部線粒體溶解消失 ×30 000；箭頭：溶解的線粒體；C：閏盤斷裂、間隙增寬，閏盤處肌原纖維溶解斷裂 ×30 000；箭：閏盤斷裂處；箭頭：斷裂的肌原纖維；D: 線粒體部分呈髓鞘樣變 ×30 000；星：髓鞘樣變的線粒體；E：脂滴數(shù)量增多 ×15 000；星：脂滴；F：肌原纖維局部溶解斷裂，T管擴(kuò)張 ×30 000；箭：斷裂的肌原纖維；箭頭：擴(kuò)張的T管；G：心肌細(xì)胞核核膜皺縮變形，肌原纖維排列紊亂，膠原纖維增多 ×30 000；星：細(xì)胞核；箭頭：肌原纖維；箭：膠原纖維；H: 粗、細(xì)肌絲比例及分布異常 ×70 000；I：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹變形 ×40 000；星：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

2.4 T1DM模型組與對照組左心室心肌細(xì)胞線粒體體視學(xué)比較通過觀察心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)并進(jìn)行體視學(xué)定量分析，結(jié)果顯示，與對照組相比，T1DM模型組左心室心肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量減少(t=3.76，P<0.01)，見圖4A；單位線粒體面積內(nèi)相對電子密度下降(t=5.61，P<0.000 1)，見圖4B；線粒體體積密度下降(t=4.53，P<0.001)，見圖4C；線粒體表面積密度下降(t=2.24，P<0.05)，見圖4D；線粒體表面積體積比、線粒體平均面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4E、F)。

圖4 食蟹猴左心室心肌細(xì)胞線粒體體視學(xué)觀察A：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量；B：單位線粒體面積內(nèi)相對電子密度；C：線粒體體積密度；D：線粒體表面積密度；E: 線粒體表面積體積比；F：線粒體平均面積；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1

2.5 T1DM模型組與對照組左心室心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)體視學(xué)比較為了解心肌微循環(huán)狀態(tài)對心肌細(xì)胞的氧、營養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的交換及能量和信息傳輸?shù)确矫嬗绊?，通過觀察心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)并進(jìn)行定量分析，與對照組相比，T1DM模型組單位內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)吞飲小泡數(shù)量減少(t=11.47，P<0.000 1)，見圖5B、C；基底膜厚度增加(t=23.06，P<0.000 1)，見圖5D。

圖5 食蟹猴左心室心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞體視學(xué)觀察A: 對照組心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞 ×30 000；箭所示為吞飲小泡；箭頭所示為基底膜；B: 模型組心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞 ×30 000；箭所示為吞飲小泡；箭頭所示為基底膜；C:模型組單位內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)吞飲小泡數(shù)量減少；D:模型組內(nèi)皮細(xì)胞基底膜厚度增加；與對照組比較：****P<0.000 1

3 討論

糖尿病是由多種因素所引起持續(xù)性血糖偏高，從而導(dǎo)致糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致多系統(tǒng)、多器官損傷，尤其是對神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、腎臟、視網(wǎng)膜及血管的影響[3-5]。糖尿病所致心肌病變的發(fā)病機(jī)理尚不明確，目前研究[6]表明其病理機(jī)制包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體結(jié)構(gòu)功能改變、細(xì)胞凋亡與自噬、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的異常激活等。目前有關(guān)T1DM患者的心肌組織超微結(jié)構(gòu)的變化，以及T1DM動物模型所致心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化的研究較少。Sugawara et al[7]報道1例心功能不全的T1DM患者心肌細(xì)胞胞質(zhì)中有大量脂滴。Dallak et al[8]研究顯示，STZ誘導(dǎo)建立的T1DM大鼠模型，其左心室心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化：核染色質(zhì)異常，肌原纖維斷裂扭曲，肌絲廣泛分離，脂滴顯著增多；線粒體腫脹、線粒體嵴減少，部分呈空泡狀，閏盤斷裂錯位，肌節(jié)變短，并且肌節(jié)、線粒體損傷的比例升高。但由于大鼠等嚙齒類動物的遺傳學(xué)、病理學(xué)和生理學(xué)與人類相差較遠(yuǎn)，從這些動物模型得出的結(jié)論并不完全適用于人類疾病，非人靈長類動物與人類親緣關(guān)系更加接近,其作為動物模型以研究人類疾病的結(jié)果更加準(zhǔn)確。本研究對T1DM食蟹猴模型的研究結(jié)果顯示左心室心肌細(xì)胞中存在大量脂滴，課題組前期研究[9]表明T1DM食蟹猴脂代謝異常，提示脂代謝異?？赡苁且鹦募〖?xì)胞損傷的原因之一。此外，本研究通過對左心室心肌細(xì)胞線粒體體視學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示線粒體數(shù)量減少，線粒體相對電子密度、體積密度、表面積密度下降，更為具體地反映線粒體損傷情況。線粒體為脂肪酸和葡萄糖代謝的核心細(xì)胞器，通過氧化呼吸鏈實(shí)現(xiàn)氫的電子傳遞，經(jīng)氧化磷酸化生成ATP[10]，線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損導(dǎo)致心肌細(xì)胞ATP供給不足，影響心臟舒縮功能[11]。

目前關(guān)于糖尿病引起的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的研究較少。Radosinska et al[12]研究表明，在自發(fā)型2型糖尿病大鼠模型中，心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞吞飲小泡減少；Schneider et al[13]研究表明，在自發(fā)型糖尿病大鼠模型中，心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜增厚；并且上述兩項研究均未做定量分析。本研究通過對左心室心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)體視學(xué)定量分析，首次報道誘導(dǎo)型T1DM食蟹猴模型左心室心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷特征為吞飲小泡數(shù)量減少和基底膜增厚。其可能原因：一方面，脂代謝異常導(dǎo)致極低密度脂蛋白在體內(nèi)大量蓄積，引起腫瘤壞死因子α表達(dá)升高，促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物在微血管內(nèi)膜、心肌細(xì)胞胞質(zhì)沉積，引起微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和心肌纖維化[14]；另一方面，高血糖促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，經(jīng)糖異生途徑，導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物積累，通過激活蛋白激酶C，進(jìn)而引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷[3]。