鈦表面載銀的硫酸乙酰肝素/殼聚糖抗菌涂層的構(gòu)建

李嬌嬌，韋章澳，張維波，李向陽(yáng)，陳佳龍

鈦及其合金廣泛用于牙科種植體，但種植體感染相關(guān)并發(fā)癥影響其長(zhǎng)期療效[1]。為解決該問(wèn)題，抗生素被整合在材料表面賦予材料一定的抗菌能力；但抗生素的抗菌譜狹窄、易引發(fā)細(xì)菌耐藥性等問(wèn)題影響其應(yīng)用效果[2]。由于廣譜、高效的抗菌活性和不引發(fā)細(xì)菌耐藥性，銀成為抗生素的潛在替代物[3]，但載銀表面制備成本高、費(fèi)時(shí)、高耗能等缺點(diǎn)制約其應(yīng)用[4]。故亟需尋找制備方法簡(jiǎn)單、抗菌效果優(yōu)異的種植體表面載銀技術(shù)。該研究旨在微納米多孔鈦表面，采用層層自組裝技術(shù)(layer by layer self-assemble technology, LBL)將帶負(fù)電荷的硫酸乙酰肝素(heparin sulfate, HEP)和帶正電荷的殼聚糖(chitosan, CHI)交替吸附在多孔鈦表面，構(gòu)建出具有良好生物相容性的多層膜[5]，再吸附銀離子，構(gòu)建出具有良好抗菌性能的涂層，為鈦基植入材料抗感染表面制備提供可行的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1材料 純鈦(山西寶雞有色金屬有限公司)；聚賴氨酸、硝酸銀、HEP(美國(guó)Sigma Aldrich公司)；丙酮(上海阿拉丁試劑有限公司)；氫氧化鈉、CHI、冰醋酸(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；腦心浸液肉湯(brain heaet infusion broth，BHI，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；活/死細(xì)菌染色試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.1.2儀器 掃描電子顯微鏡(日本日立有限公司)；X射線光電子能譜儀(美國(guó)熱電公司)；接觸角測(cè)試儀(德國(guó)克呂士公司)；電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(美國(guó)熱電公司)。

1.2 材料制備及表征

1.2.1載銀的HEP/CHI聚電解質(zhì)多層膜制備 將直徑10 mm的鈦片用80、120、240、320、500、600、800、1 000、1 200、1 500和2 000目砂紙連續(xù)拋光，然后依次置于丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水中各超聲清洗3次，每次5 min，標(biāo)記為T(mén)i; 然后放入2.5 mol/L的氫氧化鈉溶液中60 ℃活化12 h，取出后用煮沸去離子水超聲清洗5次，每次2 min，之后將鈦片放于煮沸去離子水中浸泡1.5 h，標(biāo)記為pTi；然后浸入2 mg/ml聚賴氨酸溶液(PLL)中12 h，取出鈦片，去離子水中漂洗，吹干，標(biāo)記為pTi-P。將pTi-P依次浸于10 mg/ml的HEP溶液中(預(yù)先調(diào)節(jié)pH=7)和2 mg/ml CHI中(預(yù)先用冰醋酸調(diào)節(jié)pH=4)各15 min。重復(fù)4次，最后一層是HEP，標(biāo)記為pTi-P-LBL。將pTi-P-LBL浸泡在pH為10、濃度為1 mg/ml的硝酸銀溶液中，室溫下浸泡0.5 h，干燥后得到表面載銀的樣品，標(biāo)記為pTi-P-LBL-Ag。制備過(guò)程如圖1所示。

圖1 鈦片上載銀的HEP/CHI聚電解質(zhì)多層膜的制備工藝

1.2.2樣品表征 各組選1個(gè)樣品干燥后噴金30 s，利用掃描電子顯微鏡觀察表面形貌的變化。各組選1個(gè)樣品，利用X射線光電子能譜儀分析表面元素組成和含量。各組選5個(gè)樣品，利用接觸角測(cè)試儀室溫下測(cè)量樣品表面親水性能的改變。各組選1個(gè)樣品利用硝酸/鹽酸(1 ∶3)混合液溶解表面的銀，通過(guò)感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定鈦片表面總載銀量。

1.3 抗菌性能評(píng)價(jià)為評(píng)價(jià)制備材料的抗菌能力，使用BHI培養(yǎng)基將金黃色葡萄球菌制成濃度為1×107CFU/ml的細(xì)菌懸液，進(jìn)行以下評(píng)價(jià)。

1.3.1抑菌圈法評(píng)價(jià) 取100 μl細(xì)菌懸液均勻涂在瓊脂固體培養(yǎng)基上，每組取1個(gè)樣品正面朝下放置在培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，拍攝記錄各個(gè)樣品周圍抑菌環(huán)的大小。

1.3.2濁度法評(píng)價(jià) 每組取3個(gè)滅菌樣品放入24孔板，每孔加入2 ml菌液，37 ℃培養(yǎng)，分別于4、6、8、10、12、24 h吸取150 μl溶液用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)660 nm下的吸光度，通過(guò)濁度法評(píng)價(jià)材料抗菌能力。

1.3.3活死細(xì)菌染色評(píng)價(jià) 每組取1個(gè)滅菌樣品放入24孔板并加入2 ml菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h，取出樣品,PBS漂洗后，活/死細(xì)菌試劑盒染色10 min，熒光顯微鏡觀察各樣品表面細(xì)菌黏附數(shù)量及活死細(xì)菌比例。

1.3.4涂板法評(píng)價(jià) 每組取1個(gè)滅菌樣品放入24孔板中并加入2 ml菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h，取出樣品PBS漂洗后，置于5 ml離心管并加入3 ml PBS，超聲3 min，渦旋震蕩3 min，將樣品表面的細(xì)菌分散在PBS中，取100 μl涂板，37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 樣品表征

2.1.1表面形貌 各步反應(yīng)后表面形貌的掃描電子顯微鏡照片顯示：堿熱處理形成均勻的納米孔，并有大量的桿狀物(圖2A)；PLL沉積后，桿狀物增粗(圖2B)；靜電層層自組裝后，多孔結(jié)構(gòu)的孔隙被填充、孔徑明顯縮小，說(shuō)明多層膜成功組裝在表面(圖2C)；載銀后，表面孔隙進(jìn)一步縮小，出現(xiàn)形狀不規(guī)則的顆粒，證明載銀表面構(gòu)建成功(圖2D)。

圖2 各樣品的表面形貌 ×100 000A: pTi; B: pTi-P; C: pTi-P-LBL; D: pTi-P-LBL-Ag

2.1.2元素分析 圖3是各步反應(yīng)后表面元素變化的X射線光電子能譜全譜圖，如圖所示，聚賴氨酸沉積后(pTi-P)，Ti 2p峰的減少和N 1s峰的出現(xiàn)，證明PLL已成功吸附到多孔鈦表面上；HEP/CHI組裝后(pTi-P-LBL)，Ti 2p峰消失和S 2p峰出現(xiàn)，證明了層層組裝成功；硝酸銀浸泡后(pTi-P-LBL-Ag)，Ag 3d峰出現(xiàn),證明了銀已成功裝載到材料表面。

圖3 各組樣品表面 X射線能量色散譜全譜

X射線光電子能譜元素高分辨檢測(cè)獲得表面各元素的原子百分比，結(jié)果顯示：隨著反應(yīng)進(jìn)行，表面鈦原子百分含量持續(xù)下降，表明鈦基底逐漸被覆蓋；含有大量氮原子的PLL修飾后，表面N原子含量大幅上升；HEP和CHI中氮原子含量較PLL低、且HEP含有硫元素，因此，層層組裝表面(pTi-P-LBL)氮含量降低和硫元素出現(xiàn)以證明HEP和CHI被組裝在鈦表面；硝酸銀浸泡后表面銀原子含量顯著提高，證明銀成功裝載在涂層上。見(jiàn)表1。

表1 不同樣品表面各元素原子百分含量(%)

2.1.3水接觸角 通過(guò)接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)量監(jiān)控涂層制備過(guò)程，見(jiàn)表2。Ti、pTi、pTi-P 的水接觸角分別為(59.79±2.50)°、(8.46±1.57)°、(11.76±0.95)°，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明堿熱活化和聚賴氨酸沉積成功實(shí)現(xiàn)。層層組裝過(guò)程中，由于CHI比HEP更疏水，所以HEP組裝表面的水接觸角顯著低于CHI組裝表面，且呈現(xiàn)鋸齒形波動(dòng)，每次組裝后表面水接觸角與前一步有顯著性差別(P<0.05)，證明多層膜組裝成功。與HEP/CHI組裝膜相比，載銀表面水接觸角顯著增加到(35.45±2.74)°，親水性變差，間接證明銀裝載成功。以上結(jié)果表明多層膜和銀已成功地結(jié)合在多孔鈦表面。

表2 各組樣品靜態(tài)水接觸角

2.1.4銀定量 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀檢測(cè)涂層表面載銀量，結(jié)果顯示表面載銀總量34.24 μg，表明銀成功裝載到自組裝涂層上。

2.2 抗菌評(píng)價(jià)

2.2.1抑菌環(huán) 抑菌圈試驗(yàn)測(cè)試樣品對(duì)周圍的金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)影響，見(jiàn)圖4，只有載銀樣本周圍出現(xiàn)透亮的抑菌環(huán)，表明載銀表面可以通過(guò)釋放銀離子以抑制或殺死周圍細(xì)菌。

圖4 各組樣品抑菌環(huán)結(jié)果A: pTi；B: pTi-P-LBL；C: pTi-P-LBL-Ag；黑色虛線：抑菌圈

2.2.2濁度法 通過(guò)濁度法測(cè)量溶液體系中細(xì)菌數(shù)量，見(jiàn)圖5。吸光度值與溶液中細(xì)菌的數(shù)量呈正相關(guān)，樣品在與細(xì)菌共培養(yǎng)24 h后，只有pTi-P-LBL-Ag組吸光度值無(wú)增長(zhǎng)，證明載銀表面可以完全抑制或殺死周圍細(xì)菌。

圖5 濁度法檢測(cè)溶液中細(xì)菌增殖結(jié)果

2.2.3活/死細(xì)菌熒光染色 原位活/死細(xì)菌熒光染色法直接檢測(cè)材料表面抗菌能力，如圖6所示，細(xì)菌在pTi、pTi-P-LBL表面快速和廣泛黏附，表面綠色面積大于紅色，表明細(xì)菌活力良好；pTi-P-LBL-Ag表面細(xì)菌附著量較未裝載銀的表面少，且死細(xì)菌占比高，表明載銀表面具有較好的抗菌和殺菌性能。

圖6 各樣品表面原位活/死細(xì)菌熒光染色結(jié)果 ×100A: pTi; B: pTi-P-LBL; C: pTi-P-LBL-Ag；綠色：活菌；紅色：死菌

2.2.4涂板法 樣品表面黏附細(xì)菌重新分散于溶液后，采用涂板法直觀顯示細(xì)菌數(shù)量，結(jié)果如圖7所示，pTi和pTi-P-LBL組的培養(yǎng)皿中幾乎長(zhǎng)滿細(xì)菌，而pTi-P-LBL-Ag組沒(méi)有菌落。結(jié)果表明載銀表面具有良好的抑菌/殺菌性能。

圖7 樣品表面黏附細(xì)菌涂板照片A: pTi; B: pTi-P-LBL; C: pTi-P-LBL-Ag

3 討論

鈦及其合金已經(jīng)廣泛用于牙科種植體并取得良好的臨床效果，但細(xì)菌所致種植體相關(guān)并發(fā)癥是導(dǎo)致愈合延遲、種植體失敗和再次手術(shù)的主要因素[2,6]。研究[7]表明，口腔作為人體第四大菌庫(kù)，細(xì)菌種類約700多種，其中部分菌種會(huì)在植入手術(shù)后，快速黏附于種植體表面且促進(jìn)其它細(xì)菌定植和生物膜成熟。黏附細(xì)菌形成生物膜可以保護(hù)細(xì)菌免受抗生素和人體免疫系統(tǒng)的攻擊[8]，是細(xì)菌所致種植體并發(fā)癥治療困難的主要因素[9]，所以構(gòu)建抗菌涂層可以減少細(xì)菌的初始黏附和隨后的生物膜形成，有效地預(yù)防該類并發(fā)癥的發(fā)生[5]。

LBL是一種通過(guò)靜電相互作用使多聚陰離子和多聚陽(yáng)離子連續(xù)吸附在材料表面的技術(shù)。該技術(shù)具有工藝簡(jiǎn)單、制備條件溫和、厚度可控的特點(diǎn)，適用于構(gòu)造復(fù)雜醫(yī)療裝置的表面修飾[6]。HEP是一種硫酸化的糖胺聚糖，在聚合物鏈中有高含量的硫酸基團(tuán)，從而可形成高負(fù)電荷的聚合物[10]。CHI是一種天然甲殼素多糖生物高分子材料，具有成本低、無(wú)毒、可降解性高、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)[5]；同時(shí)，由于活性羥基和氨基官能團(tuán)的存在，CHI表現(xiàn)出獨(dú)特的成膜特性和高正電特征[11]。因此，可以將CHI與HEP通過(guò)靜電組裝修飾在材料表面形成平滑的涂層。Zhou et al[5]將HEP和CHI進(jìn)行交聯(lián)形成聚電解質(zhì)多層膜并進(jìn)行小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示多層膜能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞在鈦表面的分化和增殖。然而，很多種植體并發(fā)癥都與細(xì)菌侵入有關(guān)，僅在表面上制備聚電解質(zhì)多層膜無(wú)法避免細(xì)菌所致并發(fā)癥，故裝載抗菌物質(zhì)以賦予材料抗菌性能，可以有效降低細(xì)菌所致并發(fā)癥的發(fā)生率[5]。

銀具有廣譜抗菌性，且不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥[3]。目前，銀抗菌機(jī)制主要分為兩種：釋放殺菌和接觸殺滅[12]。釋放殺菌是指銀及其化合物在液體環(huán)境中產(chǎn)生Ag+以破壞細(xì)菌并抑制細(xì)菌繁殖。接觸殺滅是指當(dāng)細(xì)菌直接接觸載銀表面而被殺死?？谇恢写罅恐虏【鷷?huì)導(dǎo)致種植體周圍軟硬組織炎癥，進(jìn)而引發(fā)種植體周圍軟組織封閉能力下降和周圍骨的吸收，最終導(dǎo)致治療失?。涣硗?，細(xì)菌黏附在種植體表面并形成生物膜是細(xì)菌所致并發(fā)癥難以根治的主要原因，故抑制或殺死種植體表面黏附的細(xì)菌和抑制種植體周圍細(xì)菌增殖是保障種植體長(zhǎng)期療效的有效手段[13]。金黃色葡萄球菌對(duì)鈦金屬親和力高，可以快速黏附且介導(dǎo)其它細(xì)菌在種植體表面定植和促進(jìn)生物膜成熟[7]，是導(dǎo)致種植體周圍炎癥尤其是化膿性感染的重要致病菌[14]，故本研究采用金黃色葡萄球菌評(píng)價(jià)修飾表面的抗菌能力。通過(guò)抑菌圈法和濁度法證明載銀表面具有對(duì)周圍細(xì)菌的殺滅能力，活死細(xì)菌染色和細(xì)菌涂板證明載銀表面可以防止細(xì)菌黏附和生物膜形成。故載銀表面可以顯著降低由細(xì)菌引起并發(fā)癥的發(fā)生率，是鈦基植入材料表面改性的有效手段。

綜上所述，該實(shí)驗(yàn)采用層層自組裝技術(shù)在鈦材的多孔表面構(gòu)建聚電解質(zhì)多層膜并進(jìn)一步裝載納米銀，實(shí)現(xiàn)了種植體周圍抗菌和種植體表面抗菌，且對(duì)種植體感染和相關(guān)并發(fā)癥有很好的防治效果。該表面技術(shù)在增加鈦基種植體的抗菌性能方面有良好的應(yīng)用前景。