基于轉(zhuǎn)錄組測序篩選不同性別C57BL/6J小鼠差異基因及通路

李昱昊，李艷玲，尹雪莉，孫曉梅，張 軍，李名聰,2，劉 莉,3，張素梅，張勝權(quán)

學(xué)習(xí)記憶是多個腦功能區(qū)共同協(xié)調(diào)完成的高級腦電活動，也是神經(jīng)科學(xué)研究的熱點之一。目前研究最清楚的解剖部位是海馬體，它位于哺乳類動物顳葉深部外側(cè)，海馬齒狀回(DG)-CA1-CA3神經(jīng)環(huán)路是記憶形成的關(guān)鍵解剖區(qū)域[1-2]。不同性別的C57BL/6J小鼠行為學(xué)存在差異，在焦慮樣行為測試中，同年齡的雄性小鼠比雌性小鼠表現(xiàn)出更強的抗焦慮行為；在空間學(xué)習(xí)記憶測試中，如Morris水迷宮實驗，同等條件下，雄性小鼠比雌性小鼠能更快地完成學(xué)習(xí)任務(wù)，這種效應(yīng)與年齡無關(guān)[3-4]。因此，在行為學(xué)實驗中，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選出不同性別差異基因并尋找差異信號通路進行比較，能夠為后續(xù)相應(yīng)行為學(xué)測試優(yōu)化實驗方法和進行針對性研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡的C57BL/6J小鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，所有的動物實驗均通過安徽醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑10 ml 4%的戊巴比妥鈉由安徽省立醫(yī)院麻醉科提供；引物購自生工生物上海有限公司；總RNA提取試劑盒與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)染料購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 主要儀器RT-qPCR分析儀購自瑞士Roche公司；脫色搖床購自上海滬析科技有限公司；恒溫水浴鍋購自上海冠森科技有限公司。

1.4 海馬總RNA提取及cDNA文庫的構(gòu)建不同性別的8周齡的C57BL/6J小鼠各被分為2組(每組各3只)。使用4%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠，心臟抽血后處死，迅速完整取出小鼠海馬體，使用液氮將組織研磨成粉末，然后借助試劑盒完成總RNA提取并按說明書完成mRNA的純化。隨后借助逆轉(zhuǎn)錄試劑盒完成cDNA文庫的構(gòu)建。

1.5 有參轉(zhuǎn)錄組測序委托深圳華大基因科技有限公司對所得cDNA文庫進行測序。

1.6 RT-qPCR分析從小鼠海馬組織中提取總RNA，按照試劑盒說明書步驟進行操作。將提取的總RNA和特定引物作為逆轉(zhuǎn)錄原料，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA文庫。使用10 μl SYBR Green熒光染料、400 ng cDNA和0.4 mmol的特定引物，用超純水定容到體積為20 μl的混合體系。使用RT-qPCR儀進行RT-qPCR分析。該PCR步驟為：95 ℃預(yù)變性30 s，然后在90 ℃、20 s的條件下進行40個循環(huán)的擴增，隨后95 ℃變性5 s，在72 ℃退火15 s，最后在95 ℃延伸5 s及60 ℃、1 min的條件下分析熔解曲線。每個反應(yīng)重復(fù)進行3次，使用2-ΔCt方法分析RT-qPCR結(jié)果，然后使用β-肌動蛋白(β-actin)作為標(biāo)準(zhǔn)對照對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.7 差異基因篩選與相互作用使用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫分析不同性別小鼠海馬體轉(zhuǎn)錄組中顯著上調(diào)與下調(diào)的基因，Q≤0.05為存在統(tǒng)計學(xué)意義的閾值。HISAT(Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts)是一款用于RNA-seq read比對參考基因組的軟件(http://www.ccb.jhu.edu/software/hisat)。它采用全基因組和局部基因組兩種索引形式，能迅速地篩選出基于設(shè)定條件下的差異基因。Cytoscape是將所得差異基因數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成網(wǎng)絡(luò)相互作用圖的一個軟件，可以準(zhǔn)確分析指定基因或基因組的相關(guān)性。每個節(jié)點代表一個基因，連線代表基因間相互作用，關(guān)鍵基因用紅色節(jié)點(KDA)標(biāo)出,藍色節(jié)點表示初始基因。將測序所得的數(shù)據(jù)庫結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件進行分析并挖掘聯(lián)系最為緊密的基因。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理使用SOAPnuke軟件過濾原始數(shù)據(jù)。使用Bowtie2軟件將篩選過的數(shù)據(jù)與參考編碼基因組對齊，然后通過RSEM軟件計算基因的表達水平。結(jié)合R語言中的phyper函數(shù)進行富集分析，計算P值，然后對P值進行矯正得到Q值，通過Bonferroni校正方法在Q≤0.05的條件下分析基因的差異表達情況。并基于超幾何測試方法對帶注釋的不同基因表達情況進行了分析。對RT-qPCR數(shù)據(jù),使用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，全部實驗數(shù)據(jù)以2-ΔCt表示，實驗組與對照組采用兩獨立樣本t檢驗進行結(jié)果分析，方差不齊者采用校正t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因?qū)⑻幚砗蟮脑紨?shù)據(jù)進行篩選后顯示，與雄性組相比，雌性組小鼠共有325個差異基因，其中上調(diào)基因233個，下調(diào)基因92個。見圖1。

圖1 不同性別C57BL/6J小鼠差異基因柱狀統(tǒng)計圖a:高表達基因；b:低表達基因；與雄性組比較：**P<0.01

2.2 差異基因GO分析和KEGG分析通過GO數(shù)據(jù)庫篩選，按照從大到小的順序進行排列，分別從細(xì)胞功能(cell function)、細(xì)胞標(biāo)志(cell marker)、生物功能(biological progress)、疾病相關(guān)性(KEGG disease)這幾個方面對差異基因進行分析并繪制表格；結(jié)果顯示，差異基因主要富集在離子通道形成、蛋白質(zhì)結(jié)合、突觸與細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、細(xì)胞黏附、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、I-型膠原組成等生物學(xué)過程。見表1?；贙EGG數(shù)據(jù)庫繪制了不同性別組的差異基因富集氣泡圖，結(jié)果顯示，差異基因較為明顯的富集通路為尼古丁成癮、長時程增強、前額葉皮質(zhì)突觸形成、谷氨酸能突觸形成、GABA氨基丁酸突觸形成、多巴胺突觸形成等過程。見圖2。

圖2 不同性別組差異基因參與的KEGG信號通路聚類熱圖紅色：高表達基因；藍色：低表達基因

表1 相關(guān)基因GO數(shù)據(jù)庫功能分析

2.3 差異基因相互作用網(wǎng)絡(luò)通過HISAT數(shù)據(jù)庫篩選出不同性別的小鼠海馬體中的差異基因，使用Cytoscape軟件算出每個基因的連接程度(degree)，結(jié)果顯示共有362個連接點和1 703個相互作用邊,見圖3。連接程度表示差異基因網(wǎng)絡(luò)中每個基因與周圍基因的關(guān)聯(lián)程度；連接程度越大，表示某一目的基因與之相關(guān)聯(lián)的基因數(shù)量就越多。因此，通過對比得出雌性組與雄性組排名前10的關(guān)鍵基因，分別為賴氨酸脫甲基酶5D(Kdm5d，degree=135)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(Cdkl5，degree=89)、細(xì)胞輸出介質(zhì)(Cle1，degree=189)、多巴胺受體6a3(Slc6a3，degree=201)、盒式轉(zhuǎn)錄因子(Fox，degree=143)、前體mRNA加工因子4B(Prpf4b，degree=189)、甘氨酸受體4(Glur4，degree=243)、鈣離子受體2(Camk2，degree=143)、DNA和RNA結(jié)合蛋白家族(Son，degree=153)、5-羥色胺受體5b(Htr5b，degree=164)，見表2和圖4。

圖3 不同性別的C57BL/6J小鼠海馬體差異基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

表2 實時熒光定量PCR目的基因的引物

圖4 雌雄C57BL/6J小鼠核心基因熒光定量PCR分析結(jié)果a:kdm5d；b:Cdkl5；c:Cle1；d:Slc6a3；e:Fox；f:Prpf4b；g:Glur4；h:Camk2；i:Son；j:Htr5b；與雄性組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

本研究通過對不同性別的C57BL/6J小鼠海馬體進行轉(zhuǎn)錄組測序獲得相關(guān)差異基因，并通過對差異基因進行GO富集分析和KEGG富集分析，對使用不同性別的動物進行行為學(xué)測試優(yōu)化了方法，并為神經(jīng)科學(xué)的研究提供了新的研究思路。

本研究在雌雄小鼠中篩選出325個差異基因，其中上調(diào)基因233個，下調(diào)基因92個。由于差異基因相對過多，因此只列舉了GO富集分析中差異最為顯著的52個差異基因和KEGG中的20條通路；這些生物學(xué)過程主要參與了尼古丁成癮、長時程增強、前額葉皮質(zhì)突觸形成、谷氨酸能突觸形成、GABA氨基丁酸突觸形成、多巴胺突觸形成等過程；在分子功能上這些差異基因主要增強了神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、突觸后電位等過程，減弱了細(xì)胞間連接、神經(jīng)遞質(zhì)活性、鈣離子信號通路和蛋白質(zhì)折疊、神經(jīng)元連接等過程；測序的結(jié)果還表明，這些差異基因減弱了細(xì)胞周期調(diào)控、外泌體分泌等過程，但確切的機制還需要進一步探索。

通過測序?qū)ι鲜龌蜻M行分析，有3種編碼神經(jīng)遞質(zhì)受體相關(guān)基因與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。首先是Slc6a3，它與多巴胺轉(zhuǎn)運密切相關(guān)；多巴胺是大腦中一種兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，參與調(diào)節(jié)大腦信息傳遞速度，提高神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞興奮性和高級哺乳動物情感活動；研究[4-5]表明，多巴胺減少不僅與帕金森綜合征有關(guān)，還與阿爾茲海默病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其次是Htr5b，5-羥色胺參與大腦接收、加工、整合外界信息過程[6-7]。最后是Glur2，該受體主要調(diào)控神經(jīng)元谷氨酸門控離子滲透型通道，能改變通道傳導(dǎo)性，尤其是電壓門控的鈣離子通道，該通道參與神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與修復(fù)過程[8-10]。

近年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，對于學(xué)習(xí)記憶的研究逐漸深入到基因水平[11-15]，但確切的分子機制及神經(jīng)元調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍然不明確；通過轉(zhuǎn)錄組測序找出差異基因和相關(guān)信號通路，目的在于尋找不同性別的動物大腦中與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的差異基因及通路。本研究得到的10個關(guān)鍵基因Kdm5d、Cdkl5、Cle1、Slc6a3、Fox、Prpf4b、Glur4、Camk2、Son、Htr5b或許可以成為新藥開發(fā)的位點，但由于神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性，在神經(jīng)生物學(xué)研究的過程中如何將這些基因與疾病進行聯(lián)系，仍然需要進一步實驗探索。