諾卡酮對(duì)抑郁樣行為和海馬中PKA/CREB/BDNF信號(hào)通路的影響

王凱新，王三旺，翟慶齡，趙 娣，劉 晶，孟凡濤，李 晨，陳金波

抑郁癥是一種發(fā)病率較高且容易復(fù)發(fā)的精神疾病，其特征是情緒低落、快感缺乏、思維遲緩等，嚴(yán)重者可有自殺傾向，近年來(lái)抑郁癥的患病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。傳統(tǒng)抗抑郁藥物一般需要幾周到幾個(gè)月的治療周期，并且近50%的抑郁癥患者治療反應(yīng)差或沒(méi)有反應(yīng)[2]。諾卡酮(nootkatone)是一種天然存在的倍半萜烯類，是有益智作用的中草藥提取物[3]。研究[4]表明諾卡酮具有改善認(rèn)知功能損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，但是其對(duì)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)抑郁表型的影響作用和機(jī)制尚不明確。海馬神經(jīng)再生受損與抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，許多抗抑郁藥物通過(guò)增加海馬神經(jīng)再生起到治療抑郁癥的作用[5]，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作為抑郁癥的重要致病基因在腦內(nèi)廣泛分布，尤其是海馬腦區(qū)[6]。該研究用慢性不可預(yù)知應(yīng)激(chronic unpredictable stress，CUS)建立小鼠抑郁模型，研究諾卡酮對(duì)小鼠抑郁表型的影響，同時(shí)檢測(cè)海馬腦區(qū)神經(jīng)再生和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)/環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein，CREB)/BDNF信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，以探討諾卡酮的抗抑郁作用及其機(jī)制，為新型抗抑郁藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性24只SPF級(jí)C57BL/6小鼠(20～25 g，8周齡)，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[許可證號(hào)：SYXK(魯)20190003]。每籠飼養(yǎng)5只，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃、相對(duì)濕度(55±5)%、12 h/12 h光暗循環(huán)的環(huán)境,動(dòng)物可以自由獲取食物顆粒和水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物處置均符合濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器諾卡酮(nootkatone)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：C5724；RNA組織提取試劑盒購(gòu)于廣州Omega公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于大連Takara公司；RIPA裂解液及Tween-20購(gòu)自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購(gòu)自于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；鼠抗β-actin、兔抗CREB、兔抗磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein，p-CREB)，兔抗PKA均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；兔抗BDNF、免疫熒光雙皮質(zhì)素(doublecortin，DCX)抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；驢抗鼠二抗IR Dye680LT、羊抗兔二抗IR Dye800CW購(gòu)自美國(guó)Li-COR公司；ALexafluor 546驢抗兔熒光二抗購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；小鼠自主活動(dòng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Any-maze軟件分析，購(gòu)自于美國(guó)Stoelting公司。雙紅外激光成像系統(tǒng)Odyssey Sa 購(gòu)自美國(guó)Li-COR公司；共聚焦顯微鏡(FV1200)購(gòu)自日本東京奧林巴斯有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟及分組將小鼠隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組、CUS 組、CUS+諾卡酮組。CUS組、CUS +諾卡酮組小鼠連續(xù)給14 d CUS，同時(shí)，每天在應(yīng)激之前腹腔注射等劑量的0.9%氯化鈉溶液或10 mg/kg諾卡酮，對(duì)照組僅每天腹腔注射等劑量的0.9%氯化鈉溶液。CUS是按照實(shí)驗(yàn)室先前研究報(bào)道的步驟進(jìn)行[7]，應(yīng)激包括束縛1 h、搖晃和擁擠1 h、夾尾20 min、24 h光照、8 ℃冷水中游泳5 min、濕盒4 h、電擊10 min，每天隨機(jī)給予小鼠任意一種上述應(yīng)激，以確保實(shí)驗(yàn)的不可預(yù)測(cè)性。第15天進(jìn)行蔗糖偏好試驗(yàn)，第16天進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)，第17天進(jìn)行自主活動(dòng)試驗(yàn)。第18天將部分小鼠斷頭處死，在冰盤上取腦，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后，將小鼠左右側(cè)海馬迅速剝離取出，并放入液氮速凍，儲(chǔ)存在-80 ℃中備用。部分小鼠進(jìn)行灌注固定，取腦進(jìn)行免疫熒光。

1.4 糖水偏好試驗(yàn)在整個(gè)CUS過(guò)程中，給予對(duì)照及實(shí)驗(yàn)小鼠雙瓶純水適應(yīng)，小鼠可以自由選擇飲水，以免小鼠對(duì)飲水位置偏好導(dǎo)致結(jié)果偏差；實(shí)驗(yàn)前禁水4 h，測(cè)試時(shí)小鼠單籠飼養(yǎng)，一側(cè)給予一瓶純水，另一側(cè)放置一瓶1%(w/v)蔗糖溶液，使小鼠可以自由選擇純水或蔗糖溶液；在測(cè)試結(jié)束時(shí)，通過(guò)稱重來(lái)計(jì)算攝入量。根據(jù)以下公式計(jì)算蔗糖偏好值：蔗糖攝入量/(蔗糖攝入量+水?dāng)z入量)。

1.5 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)小鼠被放在裝有新鮮自來(lái)水(溫度：24 ℃±1 ℃，高度：15 cm)的圓柱形玻璃容器(高25 cm，直徑10 cm)中測(cè)試6 min游泳，前2 min內(nèi)記錄小鼠首次出現(xiàn)靜止不動(dòng)狀態(tài)的時(shí)間即潛伏期，后4 min中記錄小鼠不動(dòng)狀態(tài)的總持續(xù)時(shí)間。小鼠在水面漂浮或只有維持呼吸和漂浮的必要輕微運(yùn)動(dòng)被定義為不動(dòng)狀態(tài)。

1.6 自主活動(dòng)試驗(yàn)小鼠在單籠適應(yīng)4 h后，輕輕放在測(cè)試裝置(40 cm×40 cm×40 cm)的中心位置，小鼠可以自由活動(dòng)。小鼠的運(yùn)動(dòng)通過(guò)安裝在籠子上的紅外光電傳感器進(jìn)行監(jiān)控，記錄小鼠30 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)情況。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)按照Omega公司的組織RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA，然后用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，具體反應(yīng)條件：95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)；相關(guān)引物序列如下：BDNF，(Forward)5′-CCCTGGCTGACACTTTTGAG-3′，(Reverse)5′-TCCAGCAGAAAGAGCAGAGG-3′；β-tubulin，(Forward)5′-AGCAACATGAATGACCTGGTG-3′，(Reverse)5′-GCTTTCCCTAACCTGCTTGG-3′。根據(jù)熒光曲線的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)，按照2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 Western blot用RIPA組織細(xì)胞裂解液從海馬組織中提取總蛋白。用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，隨后加入5×蛋白上樣緩沖液，在100 ℃條件下煮沸8 min。各個(gè)樣品用8%～15%的分離凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)到PVDF膜上，后用TBST溶液(20 μmmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150 μmmol/L NaCl，0.1% Tween-20)配制的5%脫脂奶粉封閉90 min，之后加入一抗(1 ∶1 000)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。之后孵育二抗(1 ∶5 000)，室溫?fù)u床90 min。經(jīng)雙紅外激光成像系統(tǒng)成像并識(shí)別灰度進(jìn)行分析。

1.9 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

1.9.1灌注小鼠 使用4%水合氯醛將小鼠深度麻醉，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)經(jīng)左心室灌注，肝臟變白后更換4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦后，4%多聚甲醛固定過(guò)夜，30%蔗糖溶液脫水。用OCT冷凍切片包埋劑包埋腦組織，冰凍切片，切片厚度為40 μm。

1.9.2免疫熒光染色 取含有海馬區(qū)域的切片進(jìn)行DCX免疫熒光染色。將含有1%牛血清白蛋白、3% Triton X-100、0.3%驢血清的PBS液室溫封閉1 h；兔抗DCX(1 ∶1 000)一抗，4 ℃過(guò)夜; 加Alexa Fluor 546驢抗兔(1 ∶300)，室溫孵育4 h；用抗熒光衰減封片劑封片。在共聚焦熒光顯微鏡下觀察海馬齒狀回染色結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果

2.1 諾卡酮對(duì)CUS誘導(dǎo)的小鼠抑郁行為的影響根據(jù)流程圖(圖1A)進(jìn)行CUS刺激和諾卡酮注射，之后測(cè)定抑郁行為。單因素方差分析顯示CUS刺激和諾卡酮給藥對(duì)糖水偏好值有影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.88，P<0.05)。進(jìn)一步比較分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，CUS組糖水偏好百分比降低(P<0.05)；與CUS組比較，CUS+諾卡酮組糖水偏好百分比增加(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。單因素方差分析顯示CUS刺激和諾卡酮給藥對(duì)強(qiáng)迫游泳潛伏期有影響，對(duì)強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間亦有影響，差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.11，P<0.05；F= 9.46，P<0.05)。進(jìn)一步比較分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CUS組強(qiáng)迫游泳潛伏期降低(P<0.05)和不動(dòng)時(shí)間增加(P<0.05)；與CUS組比較，CUS+諾卡酮組強(qiáng)迫游泳潛伏期增加(P<0.05)和不動(dòng)時(shí)間降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1C。為評(píng)估小鼠運(yùn)動(dòng)活動(dòng)情況，對(duì)小鼠進(jìn)行自主活動(dòng)試驗(yàn)，比較分析結(jié)果顯示各組之間小鼠每2 min的運(yùn)動(dòng)距離(P>0.05)及30 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)總距離差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1D。

圖1 諾卡酮對(duì)CUS誘導(dǎo)的小鼠抑郁行為的影響A：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖；B：糖水偏好試驗(yàn)；C：強(qiáng)迫游泳的潛伏期及不動(dòng)時(shí)間測(cè)試；D：自主活動(dòng)試驗(yàn)；1：對(duì)照組；2：CUS 組；3：CUS + 諾卡酮組；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與CUS 組比較：#P<0.05

2.2 諾卡酮對(duì)CUS模型小鼠海馬BDNF的表達(dá)的影響單因素方差分析顯示，CUS刺激和諾卡酮給藥對(duì)BDNF mRNA和蛋白表達(dá)有影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 9.98，P<0.05；F= 6.58，P<0.05)。進(jìn)一步比較分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，CUS組海馬中BDNF mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與CUS組比較，CUS+諾卡酮組BDNF mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 諾卡酮對(duì)CUS誘導(dǎo)的小鼠海馬腦區(qū)BDNF表達(dá)的影響(n=5)A：BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)水平；B：BDNF蛋白檢測(cè)Western blot圖；C：BDNF蛋白水平統(tǒng)計(jì)圖；1：對(duì)照組；2：CUS組；3：CUS +諾卡酮組；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與CUS組比較：#P<0.05

2.3 諾卡酮對(duì)CUS模型小鼠海馬PKA/CREB信號(hào)通路的影響單因素方差分析顯示，CUS刺激和諾卡酮給藥對(duì)PKA和p-CREB的表達(dá)水平有影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.90，P<0.05；F=11.46，P<0.05)。進(jìn)一步比較分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，CUS 組海馬中PKA和p-CREB表達(dá)水平降低(P<0.05)；與CUS組比較，CUS+諾卡酮組海馬中PKA和p-CREB的表達(dá)水平升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 諾卡酮對(duì)CUS誘導(dǎo)的小鼠海馬腦區(qū)PKA和p-CREB表達(dá)的影響A：PKA和p-CREB蛋白檢測(cè)Western blot圖；B：PKA蛋白定量分析；C：p-CREB蛋白定量分析；1：對(duì)照組；2：CUS組；3：CUS+諾卡酮組；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與CUS組比較：#P<0.05

2.4 諾卡酮對(duì)CUS模型小鼠海馬齒狀回神經(jīng)元再生的影響單因素方差分析顯示，CUS刺激和諾卡酮給藥對(duì)DCX標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量有影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.01，P<0.05)。進(jìn)一步比較分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，CUS組海馬DCX標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)量降低(P<0.05)；與CUS組比較，CUS+諾卡酮組DCX標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)量增加(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 諾卡酮對(duì)CUS誘導(dǎo)的小鼠海馬腦區(qū)DCX標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)量的影響A：DCX免疫熒光圖 ×40；B：DCX陽(yáng)性細(xì)胞定量結(jié)果；箭頭所示：海馬齒狀回；1：對(duì)照組；2：CUS組；3：CUS+諾卡酮組；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與CUS組比較：#P<0.05

3 討論

研究表明，諾卡酮具有多種藥理特性，如殺菌、抗氧化和抗過(guò)敏活性[8]；諾卡酮具有通過(guò)TLR4/NF-κB/NLRP3通路抑制神經(jīng)炎癥而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和改善認(rèn)知功能障礙的作用[9]。最近研究[10]報(bào)道諾卡酮具有通過(guò)激活Keap1/Nrf2/HO-1抗氧化途徑而發(fā)揮抗肝損傷誘導(dǎo)的抑郁和焦慮的活性。因此，該研究在CUS所誘導(dǎo)的小鼠抑郁模型上驗(yàn)證了諾卡酮的抗抑郁活性。結(jié)果顯示，諾卡酮具有明顯的抗抑郁作用，與以前的報(bào)道一致[11]，表明諾卡酮對(duì)多種方式導(dǎo)致的抑郁癥均有治療作用。

BDNF是腦內(nèi)一種非常重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，具有廣泛的神經(jīng)保護(hù)和再生的作用[12]，是抑郁癥發(fā)病和治療的重要標(biāo)志蛋白[13]。該研究結(jié)果顯示，諾卡酮可以明顯改善CUS誘導(dǎo)的抑郁表型的同時(shí)，也明顯改善了CUS誘導(dǎo)的BDNF表達(dá)降低，表明BDNF可能在諾卡酮的抗抑郁活性中發(fā)揮重要作用。研究[14]表明抑郁癥的發(fā)病和一些抗抑郁作用均涉及到PKA/CREB通路的調(diào)控，并且PKA/CREB通路具有明顯的調(diào)控BDNF表達(dá)的活性；該研究進(jìn)一步評(píng)價(jià)了諾卡酮對(duì)PKA/CREB通路的影響，結(jié)果顯示諾卡酮可以顯著增加CUS導(dǎo)致的PKA和p-CREB表達(dá)的降低，提示PKA/CREB通路可能參與了諾卡酮對(duì)BDNF表達(dá)的調(diào)控作用。

情緒的掌控主要由海馬腦區(qū)負(fù)責(zé)，同時(shí)研究[15]證明哺乳動(dòng)物的海馬腦區(qū)中存在一個(gè)最獨(dú)特的現(xiàn)象，即整個(gè)生命過(guò)程中都可以有神經(jīng)再生。而神經(jīng)再生在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，是應(yīng)對(duì)壓力應(yīng)激的關(guān)鍵修復(fù)反應(yīng)。DCX僅出現(xiàn)于神經(jīng)元形成的前3周，是未成熟神經(jīng)元的可靠標(biāo)記。研究[15]表明DCX陽(yáng)性神經(jīng)元主要存在于海馬齒狀回腦區(qū)中，CA1、CA3中沒(méi)有DCX信號(hào)，即神經(jīng)再生主要發(fā)生在海馬齒狀回腦區(qū)，而在CA1、CA3中較少，因此主要通過(guò)檢測(cè)海馬齒狀回的DCX陽(yáng)性神經(jīng)元來(lái)判斷神經(jīng)再生的情況。該研究表明CUS可導(dǎo)致海馬齒狀回神經(jīng)再生障礙，而諾卡酮可以改善海馬齒狀回的神經(jīng)再生，說(shuō)明諾卡酮可能通過(guò)改善神經(jīng)再生而發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上所述，該研究表明諾卡酮可能通過(guò)增加海馬齒狀回神經(jīng)再生及激活PKA/CREB通路增加BDNF的表達(dá)而發(fā)揮抗抑郁活性。諾卡酮可作為抗抑郁藥物研究的新的候選化合物，該研究為新的抗抑郁藥物開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。