抑制喉癌細胞瞬時受體電位M7表達對細胞生物學行為的影響及其機制

王慧敏，崔 粲，王銀鑫，李艷峰，袁東杰，盧振民

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，在頭頸部腫瘤中發(fā)病率居第三位[1]。目前，喉癌的診療已經(jīng)取得了長足進展，對于早期喉癌，手術和放療具有較好的臨床治療效果；但對于大多數(shù)進展期喉癌，臨床上仍缺乏有效的治療方法，患者預后并未獲得顯著改善[2]。瞬時受體電位M7(transient receptor potential melastatin subfamily member 7，TRPM7)為TRPM家族成員，兼有離子通道功能和激酶活性，參與調(diào)控細胞生長、凋亡和發(fā)育[3-4]。已有研究[5]顯示，TRPM7在肺癌組織中表達水平異常升高，并與較晚的臨床分期密切相關；另有研究[6]通過體外實驗證實沉默TRPM7可以抑制卵巢癌細胞的上皮-間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程和遷移。但目前TRPM7與喉癌的關系尚不清楚。本研究旨在通過使用短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)沉默TRPM7基因表達，并探討其對喉癌TU212細胞生物學特性的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器TRPM7-shRNA及shRNA-NC真核質(zhì)粒載體購自上海吉瑪制藥技術有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號：PM150110P)購自武漢普諾賽生命科技有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(貨號：A003-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(貨號：A001-3-1)購自南京建成生物工程研究所；乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH) 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒(貨號：fk-m00605)購自上海樊克生物科技有限公司；Lipofectamine 2000(貨號：11668)購自美國Invitrogen公司；JC-1檢測試劑盒(貨號：M8650)購自北京索萊寶公司；Transwell小室(貨號：3421)購自美國Corning公司；TRPM7、Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin一抗均購自美國CST公司；ABI 7500 RT-PCR系統(tǒng)購為美國Applied Biosystems產(chǎn)品；FACsCalibur流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉染人喉癌細胞系TU212由中國科學院上海細胞庫提供。將TU212細胞株使用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長匯合率達85%以上傳代培養(yǎng)。TRPM7特異性shRNA及陰性對照由上海吉瑪制藥設計，TRPM7-shRNA1、TRPM7-shRNA2、TRPM7-shRNA3靶序列分別為5′-GGTGTTCCCAGAAAGGC AA-3′、5′-AACCGGAGGTCAGGTCGAAAT-3′和5′-AA GCAGAGTGACCTGGTAGAT-3′。采用Lipofectamine 2000分別將TRPM7-shRNA1、TRPM7-shRNA2、TRPM7-shRNA3、shRNA-NC質(zhì)粒載體和空載體轉染TU212細胞，分別記為TRPM7-shRNA1、TRPM7-shRNA2、TRPM7-shRNA3組、shRNA-NC組和Control組。

1.3 RT-PCR檢測TRPM7 mRNA表達收集轉染48 h后各組TU212細胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，測定RNA濃度和純度后，用反轉錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進行擴增，按照試劑盒操作方法檢測各組細胞TRPM7 mRNA表達水平，采用2-ΔΔCt法計算TRPM7 mRNA相對表達量。引物序列如下：TRPM7(F：5′-TCCTCAAATCAGGGCATCTT-3′，R：5′-TCTTCCACAGCAAACCACTG-3′)；β-actin(F：5′-AAGGATTCCTATGTCGGC-3′，R：5′-CTTCATGATGGAGTTGAAGGT-3′)。

1.4 氧化應激標志物MDA、SOD及LDH水平檢測轉染48 h后，收集各組TU212細胞的培養(yǎng)上清液，離心后使用ELISA法檢測上清液中LDH含量水平，使用比色法檢測培養(yǎng)上清液中MDA含量及SOD活性，操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.5 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力轉染48 h后，將各組TU212細胞以含10% FBS的培養(yǎng)基配成單細胞懸液后以100個/孔密度接種于6孔板中，放入溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換新鮮培養(yǎng)基，于培養(yǎng)2周后培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見克隆時，終止培養(yǎng)。依次使用中性甲醇固定、結晶紫染色后拍照，并在顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)。

1.6 JC-1法檢測線粒體膜電位改變轉染48 h后，TU212細胞以不含EDTA的胰蛋白酶消化后離心、PBS沖洗，重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，然后用5 mg/ml JC-1在37 ℃黑暗條件下染色20 min；PBS清洗除去多余游離染料后，使用流式細胞儀上機檢測。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲待各組TU212細胞轉染48 h后，常規(guī)消化后以無血清培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為1×105個/ml，取200 μl細胞懸液加入鋪好Matrigel基質(zhì)膠的上室，24孔板下室內(nèi)加入500 μl含10% FBS的培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后用結晶紫對侵至小室下層的細胞進行染色并計數(shù)。

1.8 Western blot檢測蛋白表達BCA法定量蛋白樣品后，取40 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳轉印至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，以β-actin為內(nèi)參，分別加入TRPM7、Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次；最后加二抗室溫下孵育2 h，ECL法顯色。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1 干涉TRPM7基因序列的篩選和優(yōu)化轉染后，與Control組比較，TRPM7-shRNA1、TRPM7-shRNA2和TRPM7-shRNA3組的TRPM7 mRNA和蛋白表達水平均下降(F=160.10、209.56，P<0.05)，其中以TRPM7-shRNA1組干擾效果最好，因此選擇TRPM7-shRNA1進行后續(xù)功能實驗。見圖1。

圖1 干涉TRPM7基因序列的篩選和優(yōu)化A：RT-PCR檢測shRNA對TU212細胞TRPM7 mRNA表達的干擾效率；B：Western blot檢測shRNA對TU212細胞TRPM7蛋白表達的干擾效率；1：Control組；2：shRNA-NC組；3：TRPM7-shRNA1組；4：TRPM7-shRNA2組；5：TRPM7-shRNA3組；與Control組比較：*P<0.05

2.2 敲低TRPM7對TU212細胞氧化應激水平的影響3組細胞上清液中SOD水平見圖2；與Control組比較，TRPM7-shRNA1組細胞上清液中SOD水平下降(F=19.76，P<0.05)，而MDA和LDH水平均升高(F=19.89、24.10，P<0.05)。

圖2 敲低TRPM7對TU212細胞氧化應激水平的影響A：各組TU212細胞上清液中SOD水平；B：各組TU212細胞上清液中MDA水平；C：各組TU212細胞上清液中LDH水平；1：Control組；2：shRNA-NC組；3：TRPM7-shRNA1組；與Control組比較：*P<0.05

2.3 敲低TRPM7對TU212細胞增殖的影響CCK-8檢測結果顯示，24 h時三組TU212細胞增殖倍數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(F=0.472，P>0.05)，隨著培養(yǎng)時間延長，在48、72、96 h時，TRPM7-shRNA1組細胞增殖倍數(shù)較Control組增加(F=11.84、21.17、20.18，P<0.05)；克隆形成實驗結果顯示，與Control組比較，TRPM7-shRNA1組克隆形成率降低(F=51.32，P<0.05)。見圖3。

圖3 敲低TRPM7對TU212細胞增殖的影響A：CCK-8實驗檢測TU212細胞增殖；克隆形成實驗檢測TU212細胞體外增殖能力；B：平板克隆形成實驗檢測TU212細胞體外克隆形成能力 ×100；a：Control組；b：shRNA-NC組；c：TRPM7-shRNA1組；與Control組比較：*P<0.05

2.4 敲低TRPM7對TU212細胞線粒體膜電位及凋亡相關蛋白表達的影響JC-1法檢測顯示，與Control組比較，TRPM7-shRNA1組線粒體膜電位下降，去極化細胞占比增加(F=227.46，P<0.05)，見圖4。Western blot實驗結果顯示，凋亡標志物c-Myc蛋白表達在TRPM7-shRNA1組下調(diào)(F=39.41，P<0.05)，Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3比值在TRPM7-shRNA1組增加(F=246.22、30.96，P<0.05)，見圖5。

圖4 敲低TRPM7對TU212細胞線粒體膜電位及凋亡相關蛋白表達的影響A：JC-1法檢測TU212細胞線粒體膜電位改變；B：JC-1染紅或綠的細胞百分比直方圖；1：Control組；2：shRNA-NC組；3：TRPM7-shRNA1組

圖5 敲低TRPM7對TU212細胞凋亡相關蛋白表達的影響A：Western blot檢測TU212細胞Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3、c-Myc蛋白表達；B：Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3、c-Myc蛋白表達直方圖；1：Control組；2：shRNA-NC組；3：TRPM7-shRNA1組；與Control組比較：*P<0.05

2.5 敲低TRPM7對TU212細胞侵襲的影響Transwell實驗結果顯示，與Control組比較，TRPM7-shRNA1組細胞侵襲數(shù)減少(F=23.61，P<0.05)；Western blot實驗結果顯示，E-cadherin在TRPM7-shRNA1組表達上調(diào)(F=76.63，P<0.05)，而N-cadherin、Vimentin蛋白表達下調(diào)(F=6.35、45.93，P<0.05)。見圖6。

圖6 敲低TRPM7對TU212細胞侵襲的影響A：Transwell實驗檢測TU212細胞侵襲能力 ×200；B：Western blot檢測TU212細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達；1：Control組；2：shRNA-NC組；3：TRPM7-shRNA1組；與Control組比較：*P<0.05

3 討論

TRPM7是一種非選擇性的離子通道，是調(diào)控細胞內(nèi)Ca2+、Mg2+的關鍵通道。TRPM7廣泛表達于各種類型的組織中，尤其是在心臟、骨骼和脂肪組織中，其在細胞生長、細胞死亡和發(fā)育等眾多生理過程中發(fā)揮重要作用[7]。既往報道[8]中，TRPM7的缺失導致骨髓B細胞和人成骨細胞的生長抑制。另有研究[9]表明，與正常前列腺細胞相比，在前列腺癌細胞中TRPM7的表達增加，通過抑制TRPM7可抑制前列腺癌細胞遷移和侵襲。此外，多項研究[10-12]證實TRPM7基因的表達與包括卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌等在內(nèi)的多種癌癥相關?？紤]到TRPM7在癌變中的重要作用，本研究采用shRNA敲低喉癌TU212細胞的TRPM7基因表達，以觀察下調(diào)TRPM7表達對TU212細胞生物學特性的影響。為了防止脫靶效應，本實驗設計了3對shRNA序列干擾TRPM7表達，轉染后通過RT-PCR和Western blot檢測證實3對shRNA干擾序列均能特異、高效地下調(diào)TRPM7的表達，并在后續(xù)實驗中選擇其中干擾效果最好的TU212-shRNA1進行相關功能實驗。

腫瘤細胞的增殖和凋亡異常使得惡性腫瘤能異常生長[13]。本研究中，敲低TRPM7表達明顯抑制了喉癌TU212細胞的增殖和集落形成能力。以往研究[14]表明，TRPM7在腫瘤的增殖、生長中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其機制可能與TRPM7對胞內(nèi)Ca2+、Mg2+的水平調(diào)節(jié)有關，Ca2+、Mg2+的內(nèi)流進一步激活與增殖、生長相關信號通路進而促進細胞向G1/S和G2/M期過渡。研究[15]表明，TRPM7還與細胞凋亡密切相關，TRPM7過表達的細胞則凋亡更加明顯。細胞凋亡是由凋亡相關基因控制的程序性死亡過程，以線粒體凋亡通路最為經(jīng)典。在線粒體凋亡途徑中，caspase-3、Bax、Bcl-2是重要的凋亡相關蛋白，其中Bax為促凋亡蛋白，而Bcl-2為抗凋亡蛋白，當線粒體通路被氧化應激等細胞凋亡信號激活時，Bax等促凋亡蛋白表達上調(diào)，并通過改變線粒體外膜的通透性，引起膜電位下降及細胞色素C的釋放[16]。此外，細胞凋亡的途徑依賴于caspase-3的激活，其為細胞凋亡的最終執(zhí)行者。本研究中，敲低TRPM7表達后，TU212細胞的氧化應激水平明顯增加，表現(xiàn)為SOD水平下降和MDA、LDH水平升高；另外，通過JC-1法檢測到線粒體膜電位水平顯著下降，與此同時，Western blot檢測到caspase-3剪切體水平和Bax/Bcl-2比值顯著升高。根據(jù)以上結果認為在TU212細胞中敲低TRPM7表達影響了喉癌細胞氧化應激水平和凋亡通路，從而誘導TU212細胞經(jīng)線粒體途徑凋亡。

向正常組織浸潤及侵襲為惡性腫瘤的基本特征，亦為影響預后的關鍵因素。在腫瘤的侵襲和轉移中，EMT為關鍵的起始環(huán)節(jié)，其中調(diào)節(jié)上皮細胞黏附連接的相關分子被一些連接靈活性較大的分子所取代，從而導致細胞分離和運動性增強，腫瘤細胞更易于侵入血管，并穿過血管壁外滲形成繼發(fā)性轉移灶[17]。本研究中敲低TRPM7表達后，TU212細胞表現(xiàn)出的侵襲性明顯減弱；與此同時，TU212細胞的EMT過程被抑制，表現(xiàn)為E-cadherin上調(diào)，而N-cadherin、Vimentin下調(diào)。在卵巢癌的研究[6]中，TRPM7表達上調(diào)與卵巢癌高水平的EMT過程相關，并與卵巢癌患者較短的生存時間相關，并且通過體外實驗證實敲低TRPM7削弱了鈣信號，并抑制PI3K/AKT激活，從而減弱EMT過程。但是TRPM7在喉癌中是否通過同樣的機制調(diào)控細胞侵襲和EMT過程有待進一步研究。

綜上所述，敲低TRPM7增加喉癌TU212細胞氧化應激水平，抑制其增殖、侵襲，并通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。推測TRPM7作為促癌因子在喉癌的惡性生物學行為中具有重要作用，可能是喉癌的潛在治療靶點。