基于UPLC-QTOF-MS的呼吸道合胞病毒感染鼠盲腸內(nèi)容物代謝組研究

桂紅芽，王姝妹，張曉燕，章孝成，黃升海，何茂章

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染所誘發(fā)的下呼吸道疾病是導(dǎo)致嬰幼兒死亡的重要因素之一，目前RSV致病機(jī)制尚未闡明，且無商品化疫苗[1-2]。研究[3]表明腸道微生物平衡對(duì)肺部健康至關(guān)重要，腸道與肺之間的相互聯(lián)系，現(xiàn)稱之為“腸-肺軸”。腸道微生物種類和代謝產(chǎn)物的改變與免疫反應(yīng)、炎癥以及肺部疾病的發(fā)展有關(guān)[4]。腸道菌群代謝產(chǎn)物可影響肺部穩(wěn)態(tài)，如短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)被證明可通過增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞促進(jìn)白介素-10產(chǎn)生，抑制組蛋白脫乙?；鸵恍透蓴_素從而緩解上、下呼吸道炎癥[5]。除此之外，菌群產(chǎn)生的其他代謝物產(chǎn)物如組胺、12,13-diHOME可通過影響免疫細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞因子水平促進(jìn)肺部炎癥。研究[6]表明，RSV感染后血清膽汁酸譜發(fā)生改變。孟欣 等[7]通過GC-MS代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)尿液和糞便中乳酸和氨基酸類代謝物在Case組與Ctrl組間差異顯著。不同腸道部位菌群數(shù)量和種類具有明顯差異，關(guān)于RSV感染后盲腸代謝物組成研究尚少。因此研究RSV感染后盲腸代謝物的變化可為后期靶向調(diào)控或治療肺部炎癥性疾病提供靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(美國 Gibco 公司)；水合氯醛(上海MACKLIN公司)；色譜級(jí)甲醇、乙腈(美國Thermo公司)；2-氯苯丙氨酸(上海Aladdin公司)；甲酸(美國Merck公司)；甲酸銨(美國Sigma公司)。

1.1.2主要儀器 UltiMate 3000高效液相色譜儀、Q Exactive Focus質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)，H1650-W冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，QL-866混勻儀(鄭州南北儀器有限公司)，KW-100TDV超聲波清洗器(昆山舒美公司)，SCIENTZ-48組織研磨器(寧波新芝公司)。

1.1.3病毒和動(dòng)物模型構(gòu)建 RSV-Long株由筆者單位保存。SPF級(jí)6～7周齡Balb/c鼠(雌性)購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心并飼養(yǎng)在安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院P2動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)(Case)組小鼠經(jīng)10%水合氯醛(200 μl/只)腹腔注射麻醉后經(jīng)鼻滴入50 μl無菌RSV-Long株病毒懸液(n=7)，對(duì)照(Ctrl)組小鼠采用同體積的無菌DMEM液滴鼻(n=6)。感染3 d后，腹腔注射水合氯醛深度麻醉Balb/c小鼠。行75%乙醇溶液擦拭腹部，在超凈工作臺(tái)對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，取下盲腸組織(含內(nèi)容物)裝入無菌凍存管后放入液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1盲腸內(nèi)容物代謝物提取 快速稱取100 mg盲腸內(nèi)容物(±1%)于2 ml EP 管中(置于冰上)，加入提前預(yù)冷的 0.6 ml 2-氯苯丙氨酸(0.004 g/L)甲醇(-20 ℃)，渦旋振蕩30 s；此外，向之前的管子中加入 100 mg 玻璃珠，在高通量組織研磨儀中以60 Hz 頻率研磨 90 s；隨即進(jìn)行室溫超聲 10 min；樣品以12 000 r/min離心10 min(4 ℃)。用0.22 μm膜對(duì)300 μl上清液進(jìn)行過濾并加入到色譜進(jìn)樣瓶中；QC(quality control，用來校正樣品分析結(jié)果的偏差以及由于分析儀器自身原因所造成的失誤)樣品為每個(gè)樣本各取10 μl 混合而成；剩余待測(cè)樣本將根據(jù)每6個(gè)樣本穿插一個(gè)QC樣本的順序進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)檢測(cè)，進(jìn)樣體積為3 μl。

1.2.2液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析

1.2.2.1色譜條件 超高效液相色譜分析采用 Thermo Ultimate 3000系統(tǒng)，色譜柱為 ACQUITY UPLC? HSS T3 1.8 μm(2.1 mm×150 mm)，自動(dòng)進(jìn)樣器和色譜柱溫度分別維持在 4 ℃和40 ℃，流速為0.25 ml/min，進(jìn)樣體積設(shè)定為2 μl并進(jìn)行梯度洗脫，正離子流動(dòng)相為0.1%甲酸水(C)-0.1%甲酸乙腈(D)；負(fù)離子流動(dòng)相為5 mmol/L甲酸銨水(A)-乙腈(B)。樣品的梯度洗脫程序設(shè)定為：0～1 min，2% B/D；1～9 min，2%～50% B/D；9～12 min，50%～98% B/D；12～13.5 min，98% B/D；13.5～14 min，98%～2% B/D；14～20 min，2% D-正模式(14～17 min，2% B-負(fù)模式)。

1.2.2.2質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采集系統(tǒng)使用Thermo Q Exactive Focus，配備電噴霧離子源(ESI)，具有正負(fù)離子掃描模式。電噴霧源參數(shù)設(shè)定如下：毛細(xì)管電壓正、負(fù)離子條件下分別設(shè)定為3.50 kV和2.50 kV；樣本和萃取錐孔電壓分別為40 V和4.0 V。脫溶劑氣流量為800 L/h，溫度為400 ℃，錐孔氣流量為40 L/h，溫度為100 ℃。分辨率為70 000 進(jìn)行數(shù)據(jù)全掃描，數(shù)據(jù)采集范圍為0.08～1 ku，并采用 HCD 進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞電壓為 30 eV，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除不必要的質(zhì)譜二級(jí)碎片信息。

1.2.2.3質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)處理 采用Proteowizard軟件(v3.0.8789)將質(zhì)譜下機(jī)原始數(shù)據(jù)格式raw轉(zhuǎn)換為mzXML格式(此為XCMS軟件的輸入文件格式)；基于R軟件(v3.3.2)的XCMS程序包進(jìn)行如下數(shù)據(jù)處理：峰識(shí)別(peaks identification)、峰過濾(peaks filtration)、峰對(duì)齊(peaks alignment);主要參數(shù)設(shè)定如下：bw=2, ppm=15, peakwidth=c(5, 30), mzwid=0.015, mzdiff=0.01, method=centWave；得到包括質(zhì)荷比(mass to charge ratio, m/z)、保留時(shí)間(retention time, rt)、峰面積(intensity)等信息的三維數(shù)據(jù)矩陣用于后續(xù)生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理首先對(duì)離子強(qiáng)度數(shù)據(jù)表進(jìn)行基于峰面積的批次歸一化處理(batch normalization)。采用SIMCA-P軟件(14.1版本，Umetrics公司)對(duì)經(jīng)過歸一化的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析：如主成分分析(principal component analysis, PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)數(shù)據(jù)分析。單變量統(tǒng)計(jì)分析采用R軟件Wilcoxon Mann-Whitney組間差異檢驗(yàn)。初步篩選符合P<0.05、 OPLS-DA第一主成分變量重要性投影(variable important in the projection，VIP)>1，兩個(gè)條件的代謝物用于進(jìn)一步構(gòu)建二元邏輯回歸模型，篩選能夠預(yù)測(cè)RSV感染的代謝物標(biāo)志物，通過受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)并計(jì)算曲線線下面積(area under the curve，AUC)來表征模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。利用MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca)網(wǎng)站對(duì)鑒定出的差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠盲腸內(nèi)容物代謝輪廓基于UPLC-QTOF-MS平臺(tái)所采集的正、負(fù)離子模式基峰色譜(BPC)圖(圖1)，Case組小鼠盲腸內(nèi)容物圖譜與Ctrl組小鼠有明顯差別。

圖1 Case組模型小鼠和Ctrl組小鼠盲腸內(nèi)容物代謝組學(xué)色譜基峰圖A:正離子模式；B:負(fù)離子模式

QC樣本質(zhì)譜峰變異系數(shù)統(tǒng)計(jì)見圖2，可以看到離子特征峰相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<30%的比例能達(dá)到80%左右，而且PCA圖顯示QC樣本分布集中，說明數(shù)據(jù)穩(wěn)定性和可重復(fù)性良好。

圖2 基于代謝物特征峰的主成分分析圖和QC樣本特征峰RSD分布圖A:正離子模式；B:負(fù)離子模式

2.2 差異代謝物篩選與鑒定正、負(fù)離子模式分別得到33 200、28 405個(gè)前體分子。利用OPLS-DA對(duì)Case組和Ctrl組盲腸內(nèi)容物代謝組學(xué)特征值進(jìn)行差異分析，見圖3。正離子和負(fù)離子模式下Case組和Ctrl組均顯示明顯的分離。

圖3 正離子(A)和負(fù)離子(B)模式下兩組代謝譜OPLS-DA得分圖

RSV小鼠模型建立后盲腸內(nèi)容物差異代謝物以組間P<0.05、VIP>1為過濾標(biāo)準(zhǔn)，分別在正離子模式和負(fù)離子模式下篩選到3 310和2 714個(gè)組間差異代謝物特征值。合并正負(fù)離子后進(jìn)行代謝物的定性分析，代謝物的鑒定首先需獲得精確的代謝物分子量(分子量誤差<15 ppm)，再根據(jù)代謝物的MS/MS模式所得碎片信息在HMDB數(shù)據(jù)庫(http://www.hmdb.ca)、 Metlin數(shù)據(jù)庫(http://metlin.scripps.edu)和massbank(http://www.massbank.jp/)等商業(yè)數(shù)據(jù)庫及自建標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步匹配注釋獲得代謝物準(zhǔn)確信息。根據(jù)注釋結(jié)果得到33個(gè)有確定名稱的組間差異代謝物生物標(biāo)志物并通過熱圖進(jìn)行展示，見圖4。

圖4 經(jīng)注釋后在模型組和對(duì)照組間差異顯著的代謝物熱圖

2.3 隨機(jī)森林篩選預(yù)測(cè)RSV感染的代謝物標(biāo)志物為進(jìn)一步解析盲腸內(nèi)容物代謝物變化與RSV感染的關(guān)系，對(duì)33個(gè)組間差異代謝物進(jìn)一步構(gòu)建隨機(jī)森林分類模型，篩選能用于準(zhǔn)確預(yù)測(cè)RSV感染的代謝物標(biāo)志物。隨機(jī)森林分類模型鑒定到16個(gè)對(duì)模型分32類最重要的代謝物，按照“MeanDecreaseAccuracy”參數(shù)排序后主要有：鵝去氧膽酸甘氨酸耦合物、還原核黃素、dAMP等。ROC曲線分析結(jié)果顯示16個(gè)代謝物能以高穩(wěn)定性和高準(zhǔn)確率將Case組和Ctrl組區(qū)分開來，其中ROC曲線線下面積AUC值為100%，靈敏度為100%，特異性為100%。見圖5。

圖5 隨機(jī)森林分類模型篩選與RSV感染相關(guān)代謝物標(biāo)志物A：采用隨機(jī)森林法對(duì)代謝物進(jìn)行平均精確度下降系數(shù)排序；B：利用隨機(jī)森林模型預(yù)測(cè)Case組和Ctrl組的受試者操作特征曲線

2.4 代謝通路分析將隨機(jī)森林分析鑒定到的16個(gè)代謝物上傳到Metaboanalyst網(wǎng)站進(jìn)行通路分析。KEGG數(shù)據(jù)庫以編碼代謝物的基因和基因組的功能信息為基礎(chǔ)，以代謝反應(yīng)為線索，將可能的代謝途徑及對(duì)應(yīng)的調(diào)控蛋白進(jìn)行串聯(lián)，以圖形化的方式展示細(xì)胞生理生化過程。代謝物的富集分析結(jié)果顯示(圖6)，Case組和Ctrl組盲腸內(nèi)容物的差異代謝物主要富集到賴氨酸分解、半胱氨酸和蛋氨酸代謝和丙酸鹽代謝通路。

圖6 差異代謝物代謝組通路氣泡圖

3 討論

機(jī)體微生物組對(duì)宿主免疫至關(guān)重要，RSV感染刺激機(jī)體抗病毒免疫會(huì)導(dǎo)致腸道菌群紊亂。呼吸道病毒與腸道菌群關(guān)系密切，病毒感染誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)后，改變了固有細(xì)菌代謝能力，此種情況下腸腔內(nèi)代謝產(chǎn)物的數(shù)量和種類與正常穩(wěn)態(tài)情況下差異巨大。盲腸菌群是發(fā)酵宿主難消化膳食纖維的主要場(chǎng)所，產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸如乙酸、丙酸和丁酸，短鏈脂肪酸可發(fā)揮局部和系統(tǒng)影響。研究[8]表明短鏈脂肪酸可以通過激活G-蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮調(diào)控免疫細(xì)胞的激活和功能，此外還可以抑制組蛋白去乙酰化酶活性，維持腸道穩(wěn)態(tài)。已有研究[9]顯示孕婦攝入足量的水果和蔬菜(膳食纖維來源用于產(chǎn)生短鏈脂肪酸)可保護(hù)后代抵御RSV感染。有研究[10]證明給小鼠補(bǔ)充高膳食纖維飲食可通過降低病毒載量和炎癥抵御RSV疾病，該保護(hù)方式依賴于腸道菌群及其產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，其中小鼠和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，乙酸可誘導(dǎo)肺部的β干擾素(interferon , IFN-β)生成、促進(jìn)Ⅰ型IFN應(yīng)答，IFN-Ⅰ受體介導(dǎo)了乙酸對(duì)RSV感染的抵抗作用，該作用還依賴于G蛋白偶聯(lián)受體Gpr43和核因子κB(NF-κB)的活化。

本研究中PCA和OPLS-DA均顯示Case組和Ctrl組小鼠的盲腸內(nèi)容物樣本能夠完全分離，說明兩組盲腸內(nèi)容物代謝譜有明顯差異，提示小鼠感染RSV后盲腸內(nèi)容物代謝發(fā)生紊亂。結(jié)果顯示，Case組小鼠盲腸顯著富集L-絲氨酸、油酸等代謝物和脂質(zhì)分子。Yan et al[11]采用人冠狀病毒229E(HCoV-229E)為模型冠狀病毒研究冠狀病毒感染后宿主細(xì)胞脂質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)24種脂類包括油酸、亞油酸和花生四烯酸等在細(xì)胞感染后顯著上調(diào)。病毒復(fù)制需要特定的細(xì)胞脂質(zhì)成分，任何脂質(zhì)組分的破壞都可能降低病毒復(fù)制的效率。甘氨酸鵝去氧膽酸在Case組顯著富集，而且隨機(jī)森林模型鑒定出甘氨酸鵝去氧膽酸是預(yù)測(cè)RSV感染最重要的代謝物標(biāo)志物(圖5A)，甘氨酸鵝去氧膽酸去耦合作用需要腸道菌群的參與以及RSV感染后甘氨酸鵝去氧膽酸的升高說明膽汁酸的正?！案文c循環(huán)”發(fā)生失調(diào)[12]。上述結(jié)果初步說明RSV感染會(huì)影響盲腸膽汁酸代謝發(fā)生改變。研究表明甲硫氨酸是抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽和牛磺酸的前體物質(zhì)[13], 谷胱甘肽可以通過清除羥自由基及超氧化物來保護(hù)機(jī)體[14], 所以盲腸中甲硫氨酸含量的降低可能是RSV病毒通過“肺-腸軸”誘發(fā)腸道損傷及菌群代謝的潛在原因之一。本研究顯示，隨機(jī)森林分析篩選出16種可將RSV和正常鼠區(qū)分的差異代謝物，說明它們可能是潛在的代謝物標(biāo)志物。代謝物標(biāo)志物的篩選可為RSV的診斷和開發(fā)靶向RSV感染的小分子藥物研究提供線索。