紅景天苷抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡減輕心臟缺血再灌注損傷

曹旭東，張 帆，黃明月，陳 軍，陳國安，陳小林

急性心肌梗死是全世界范圍內(nèi)危害人類健康的主要因素[1-2]。再灌注能降低心肌梗死患者病死率，但缺血再灌注(ischemia reperfusion, IR)損傷的存在，使患者仍有發(fā)展為心力衰竭的風(fēng)險[3]。研究[4-5]表明，IR損傷的機(jī)制包括氧自由基、鈣超載、細(xì)胞凋亡、壞死、自噬及內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等。紅景天苷(salidroside, Sal)是從紅景天中提取的生物活性成分[6]。Sal具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗衰老及神經(jīng)和心血管保護(hù)作用[6-7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在蛋白質(zhì)、脂質(zhì)合成和鈣調(diào)控中發(fā)揮作用。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被破壞時，會出現(xiàn)錯誤折疊和未折疊蛋白質(zhì)堆積，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[8]。ERS與多種心血管疾病有關(guān)，如心肌肥大、缺血性心臟病和心力衰竭[9-11]。因此，為了更好地探討心肌IR損傷的機(jī)制并尋找潛在的保護(hù)藥物，該研究采用大鼠離體心臟IR模型，觀察Sal在IR損傷中的作用以及對細(xì)胞凋亡和ERS的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物48只8周齡SPF級雄性SD大鼠購買于南方科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體質(zhì)量280 g左右。在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，所有操作均嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動物使用規(guī)范和要求。

1.2 主要試劑Sal(根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[12]確定其藥物濃度)、氯化三苯基四氮唑(TTC)購買于美國Sigma公司；RIPA購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒購買于南京建成科技有限公司；TUNEL染色試劑盒購買于瑞士Roche公司；B淋巴細(xì)胞瘤2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)及蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X, Bax)、轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)和轉(zhuǎn)錄活化因子6(activating transcription factor 6, ATF6)和GAPDH抗體購買于美國Cell Signaling Technology公司；山羊抗鼠和山羊抗兔二抗購買于武漢proteintech公司。心臟灌注液組分和含量(mmol/L)如下: KCl 4.6，KH2PO41.2，NaCl 120，NaHCO325，CaCl21.5，MgSO41.2，Glucose 11。先用95% O2/5% CO2的混合氣向灌注液中通氣30 min再開始實(shí)驗(yàn)，灌注液pH值7.35～7.45，溫度37 ℃。

1.3 離體心臟模型和實(shí)驗(yàn)分組大鼠腹腔注射水合氯醛(10%, 0.3 ml/100 g)和肝素(500 U/kg)，麻醉后開胸，游離心臟后放入預(yù)冷的灌注液中，并將心臟轉(zhuǎn)移至Langendorff灌流管口，用手術(shù)線固定。灌注液由主動脈口逆行灌注心臟，灌注壓保持10.67 kPa。將含有液體的球囊經(jīng)二尖瓣插入左心室，通過Labchart 7軟件記錄左室收縮峰壓(left ventricular peak systolic pressure, LVSP)和左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)。將各組心臟LVEDP調(diào)為0.67 kPa，使心臟穩(wěn)定10 min。待其平衡后，隨機(jī)分為4組(n=12)：對照(Control)組、Sal處理(Sal)組、缺血再灌注(IR)組和Sal處理缺血再灌注(IR+Sal)組。Control組,正常灌注150 min；Sal組,先用含20 mmol/L Sal的灌注液灌注10 min，再用正常灌注液灌注140 min；IR組,缺血30 min，再灌注120 min；IR+Sal組，用含20 mmol/L Sal的灌注液灌注1 min，缺血30 min，再用含20 mmol/L Sal的灌注液灌注9 min，最后恢復(fù)灌注液灌注110 min。

1.4 心臟功能檢測用Labchart 7軟件實(shí)時監(jiān)測左心室內(nèi)壓力的變化，實(shí)驗(yàn)過程中記錄LVSP和LVEDP變化。LVSP、LVEDP代表心臟收縮、舒張功能。

1.5 心肌梗死面積檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將心臟取下放入-80 ℃冰箱2 h，沿心尖到心底部的縱軸方向?qū)⑿呐K連續(xù)切成2 mm厚的薄片，每個心臟均選擇第5片放入盛有2% TTC溶液的24孔板中，37 ℃避光水浴15 min；將染色完的心肌薄片用4%多聚甲醛避光浸泡2 d；數(shù)碼相機(jī)拍照，死亡心肌組織呈白色，存活心肌組織呈紅色，Image J測量白色區(qū)面積和心臟總面積。心臟梗死面積分?jǐn)?shù)=(白色區(qū)面積/總面積)×100 %。

1.6 LDH活性檢測按照LDH試劑盒說明書操作，收集缺血心臟復(fù)灌前10 min的灌注液，而Control組、Sal組心臟收集穩(wěn)定灌注1 h后10 min內(nèi)的灌注液。采用分光光度計(jì)讀取各組灌注液的吸光度值并計(jì)算LDH活性。

1.7 TUNEL染色再灌注結(jié)束后，將心臟浸泡在4%多聚甲醛中固定；采用常規(guī)脫水、石蠟包埋和切片，并根據(jù)TUNEL染色試劑盒說明書處理標(biāo)本，全程避光；激光共聚焦顯微鏡下觀察染色情況，每張切片隨機(jī)選取10個高倍視野，TUNEL陽性細(xì)胞的細(xì)胞核呈綠色，DAPI染核使細(xì)胞核均呈藍(lán)色；TUNEL陽性率=綠色細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)。

1.8 Western blot法檢測蛋白表達(dá)再灌注結(jié)束后，快速將心臟凍存于-80 ℃冰箱備用。各組心臟稱取相同質(zhì)量的心肌組織，按照質(zhì)量/體積比1 ∶4加入含蛋白酶抑制劑和RIPA的裂解液，冰上研磨并裂解30 min，放入4 ℃離心機(jī)，6 970 r/min離心20 min，取上清液分裝，BCA法蛋白定量；配制SDS-PAGE膠，每孔加30 g蛋白，常規(guī)電泳和濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉120 min，將切好的條帶分別與Bcl-2 (1 ∶1 000)、Bax (1 ∶1 000)、CHOP (1 ∶1 000)、PERK (1 ∶1 000)、ATF6 (1 ∶1 000)和GAPDH (1 ∶5 000)抗體孵育，4 ℃過夜；第2天，1×TBST室溫洗膜3次，每次10 min，用山羊抗鼠和山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)室溫孵育120 min，1×TBST室溫洗膜3次，每次10 min；利用Bio-Rad發(fā)光儀和ECL顯色液檢測，Image J分析軟件進(jìn)行灰度值分析，GAPDH作為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間差異比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組之間的比較采用Tukey檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sal提高大鼠離體心臟IR后LVSP并降低LVEDP大鼠離體心臟左心室壓力統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，Control組和Sal組LVSP和LVEDP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Control組比較，IR組LVSP降低，而LVEDP升高(F=194.6，P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與IR組比較，IR+Sal組LVSP升高，而LVEDP降低(F=185.7，P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 各組大鼠心臟功能的比較A：LVSP統(tǒng)計(jì)圖；B：LVEDP統(tǒng)計(jì)圖；與Control 組比較：##P<0.01；與IR組比較：**P<0.01

2.2 Sal減輕大鼠離體心臟心肌梗死面積和灌注液中LDH活性TTC染色和LDH試劑盒檢測結(jié)果顯示，Control組與Sal組心肌梗死面積分?jǐn)?shù)和LDH活性無明顯差異(P>0.05)；與Control組比較，IR組心肌梗死面積分?jǐn)?shù)和LDH活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=120，P<0.001)；與IR組比較，IR+Sal組心肌梗死面積分?jǐn)?shù)和LDH活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=444.5，P<0.001)。見圖2。

圖2 大鼠心臟梗死面積和LDH活性的比較A：心臟梗死面積圖；B：心臟梗死面積統(tǒng)計(jì)圖；C：LDH活性統(tǒng)計(jì)圖；a：Control組; b：Sal組; c：IR組; d：IR+Sal組；與Control 組比較：##P<0.01；與IR組比較：**P<0.01

2.3 Sal抑制大鼠離體心臟心肌細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，Sal組心肌細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Control組比較，IR組心肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)增加(P<0.001)；而與IR組比較，IR+Sal組心肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)增加，Bax表達(dá)降低(F=212.2，P<0.001)。見圖3。

圖3 大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的比較A：Western blot檢測結(jié)果圖；B：Bcl-2/Bax統(tǒng)計(jì)圖；a：Control組; b：Sal組; c：IR組; d：IR+Sal組；與Control 組比較：##P<0.01；與IR組比較：**P<0.01

2.4 Sal抑制大鼠離體心臟心肌細(xì)胞凋亡率TUNEL染色結(jié)果顯示，與Control組比較，Sal組心肌細(xì)胞TUNEL染色陽性細(xì)胞率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Control組比較，IR組心肌細(xì)胞TUNEL染色陽性細(xì)胞率增加(P<0.001)；而與IR組比較，IR+Sal組心肌心肌細(xì)胞TUNEL染色陽性細(xì)胞率降低(F=109.1，P<0.001)。見圖4。

圖4 大鼠心肌TUNEL陽性細(xì)胞率的比較 ×200a：Control組; b：Sal組; c：IR組; d：IR+Sal組；與Control 組比較：##P<0.01；與IR組比較：**P<0.01

2.5 Sal抑制大鼠離體心臟心肌細(xì)胞ERS蛋白表達(dá)如圖5所示，Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，Sal組ERS蛋白PERK、ATF6和CHOP的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Control組比較，IR組PERK、ATF6和CHOP的表達(dá)增加(F=190，P<0.001)；而與IR組比較，IR+Sal組PERK、ATF6和CHOP的表達(dá)降低(F=88.7，P<0.001)。

圖5 大鼠心肌細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白表達(dá)的比較A：Western blot檢測結(jié)果圖；B：PERK、ATF6、CHOP相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖；a：Control組; b：Sal組; c：IR組; d：IR+Sal組；與Control 組比較：##P<0.01；與IR組比較：**P<0.01

3 討論

及時重建堵塞冠脈的血流是實(shí)現(xiàn)挽救缺血心肌細(xì)胞和減小心肌梗死面積的最有效方法。然而，再灌注是一把“雙刃劍”，除了能提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)恢復(fù)細(xì)胞代謝并清除細(xì)胞代謝副產(chǎn)物外，其本身也會引起新的心肌細(xì)胞死亡，進(jìn)一步加重心肌損傷[4]。到目前為止，臨床上還沒有較好的預(yù)防或治療再灌注損傷的方法和藥物。

Sal作為紅景天的重要活性成分，大量研究[6-7]證實(shí)了其在抗炎、抗氧化、清除自由基、抗衰老及神經(jīng)和心血管保護(hù)中的作用。結(jié)果表明，在大鼠離體心臟IR模型中，Sal能增加LVSP，降低LVEDP，改善心臟功能；同時，Sal還能減小心肌梗死面積和LDH活性，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Sal在心臟IR損傷中具有保護(hù)作用。而細(xì)胞凋亡是心肌IR過程中一種重要的細(xì)胞死亡方式，并且已經(jīng)成為了IR損傷的一個重要病理因素[13]。在細(xì)胞凋亡過程中會出現(xiàn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少、凋亡蛋白Bax表達(dá)增加及DNA片段化現(xiàn)象[14]。本研究結(jié)果顯示，Sal增加離體心臟IR損傷中Bcl-2表達(dá)，降低Bax表達(dá)和TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)，表明Sal可以抑制IR中發(fā)生的細(xì)胞凋亡。

ERS是由蛋白錯誤折疊、Ca2+儲存過量、氧化應(yīng)激、缺血和脂質(zhì)代謝紊亂等病理因素引起的，未折疊蛋白反應(yīng)可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)整合膜蛋白PERK和ATF6，進(jìn)而啟動ERS[8]。另外，ERS蛋白CHOP可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)凋亡蛋白Bax和Bim的表達(dá)[15]。本研究結(jié)果顯示，Sal降低IR中ERS蛋白PERK、ATF6和CHOP的表達(dá)，表明Sal能夠抑制心臟IR觸發(fā)的ERS損傷，提示Sal可能通過抑制ERS減輕心臟IR損傷。

綜上所述，Sal可以改善大鼠離體心臟功能，減小心肌梗死面積，減輕心臟IR損傷，而這一保護(hù)作用可能與抑制細(xì)胞凋亡和ERS有關(guān)。這些結(jié)果表明Sal是一種潛在的臨床防治IR損傷的藥物，并為Sal的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。