miR-143靶向作用于TFF3抑制前列腺癌細(xì)胞PC3的增殖

郭 亮，肖 峻，陶 陶

前列腺癌(prostate cancer, PC)是男性最常見的惡性疾病，發(fā)病率為3/10 000。由于世界老年化人口不斷增加，預(yù)計(jì)到2030年，PC患者將超過170萬，新增死亡人數(shù)約為49.9萬[1]。目前，分子靶向治療已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。然后，針對已知的PC基因靶點(diǎn)的治療沒有獲得滿意的效果[2]。因此，尋找更有效的分子靶點(diǎn)是當(dāng)前研究PC靶向治療的重要任務(wù)之一。microRNAs(miRNAs)是一類小的非編碼RNA分子，參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、器官發(fā)育、組織再生、衰老，也參與PC的發(fā)病機(jī)制。已有研究[3]證實(shí)miR-143在PC組織的表達(dá)水平低于癌旁組織，表明miR-143與PC存在聯(lián)系。但對于miR-143在PC發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，目前還不清楚。該研究中分析了PC細(xì)胞株P(guān)C3中miR-143的表達(dá)水平，并通過慢病毒建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-143的PC3細(xì)胞，分析miR-143對PC3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。利用生物信息學(xué)分析miR-143的潛在靶基因，并使用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。以期為尋找更有效的PC治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人PC3細(xì)胞購自武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素液、胰蛋白酶-EDTA消化液和Lipofectamine 3000均購自美國Thermo Fisher公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱、TRIzol reagent購自美國賽默飛公司；miScript II RT Kit試劑盒購自德國Qiagen公司；Gene Pharma Hairpin-itTMmicroRNA RT-PCR Quantitation Kit購自上海吉瑪基因公司；聚凝胺、嘌呤霉素、CCK-8檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒購自上海Beyotime Biotechnology公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司；攜帶has-miR-143及其對照(miR-NC)的慢病毒購自上海漢恒生物科技有限公司；包含TFF3 3′-UTR的野生型(WT-pGL3-TFF3)、突變型(Mut-pGL3-TFF3)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和真核表達(dá)質(zhì)粒(pCNDA3.1-TFF3)購自滁州通用生物技術(shù)有限公司；miR-143 mimic及對照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。ABI StepOne Plus系統(tǒng)購自美國Applied Biosystems公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱和NanoDropTM1000微量分光光度計(jì)購自美國賽默飛公司；酶標(biāo)儀購自美國 Biotek公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人PC3細(xì)胞使用含10%FBS和1×青鏈霉素液的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立和實(shí)驗(yàn)分組 慢病毒感染在24孔板中進(jìn)行，每孔接種5×104個PC3細(xì)胞，培養(yǎng)16 h。用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋慢病毒，同時加入終濃度為10 mg/L的聚凝胺，每孔加入2 ml稀釋的病毒液使得感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為20，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后換成新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h，換成含嘌呤霉素的培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)2周，篩選出穩(wěn)定表達(dá)miR-143的PC3細(xì)胞，記為PC3/miR-143組，同時篩選出感染對照慢病毒的PC3細(xì)胞，記為PC3/miR-NC組，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞是否表達(dá)綠色熒光，通過Real-time PCR檢測細(xì)胞中miR-143的表達(dá)水平。以未轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞記為PC3組。使用Lipofectamine 3000將pCNDA3.1和pCNDA3.1-TFF3質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PC3/miR-143組的細(xì)胞，分別記為PC3/miR-143+ pCDNA3.1組和PC3/miR-143+ pCDNA3.1-TFF3組，轉(zhuǎn)染操作步驟按照說明書進(jìn)行。

1.2.3RNA提取和Real-time PCR 細(xì)胞中的總RNA通過TRIzol reagent提取，提取過程參考說明書進(jìn)行?？俁NA的純度和含量通過NanoDropTM1000分光光度計(jì)檢測和計(jì)算260 nm與280 nm處吸光度值的比值，以及260 nm與230 nm處吸光度值的比值來評價。使用 miScript II RT Kit將總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，將1 μg總RNA加入到含12 μl DEPC處理水、2 μl miScript Reverse Transcriptase Mix、2 μl miScript Nucleics Mix和4 μl 5× miScript HiSpec buffer中，在37 ℃孵育60 min后，95 ℃孵育5 min，終止反應(yīng)，凍存于-20 ℃?zhèn)溆谩τ趍iR-143的表達(dá)水平檢測使用Gene Pharma Hairpin-itTMmicroRNA RT-PCR Quantitation Kit在ABI StepOne Plus系統(tǒng)上進(jìn)行，反應(yīng)條件：95 ℃、10 min為預(yù)變性階段條件；95 ℃、12 s，62 ℃、40 s，共40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-143的相對表達(dá)量。對于TFF3 mRNA的定量檢測同樣在ABI StepOne Plus系統(tǒng)上進(jìn)行，反應(yīng)條件為95 ℃、10 min預(yù)變性；95 ℃、5 s，60 ℃、40 s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。擴(kuò)增使用的引物為TFF3 (genbank登錄號: NM_003226)，(F)5′-CCAAGCAAACAATCCAGAGCA-3′，(R)5′-GCTCAGGACTCGCTTCATGG-3′；U6 snRNA (genbank登錄號: NR_004394)，(F)5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，(R)5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH，(F)5′-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3′，(R)5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′。

1.2.4細(xì)胞增殖活力檢測 使用CCK-8試劑盒對不同組細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行分析。將處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞用胰酶消化后用未添加血清的培養(yǎng)基重懸，按照100 μl/孔(2 000個細(xì)胞)接種96孔板，饑餓培養(yǎng)12 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于培養(yǎng)0、24、48、72、96 h時每孔分別加入10 μl CCK-8溶液，孵育1 h后通過酶標(biāo)儀檢測吸光度(A450)值。每組細(xì)胞進(jìn)行6復(fù)孔檢測。

1.2.5細(xì)胞凋亡檢測 細(xì)胞凋亡分析通過AnnexinV-FITC Analysis Kit在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行，操作按照說明書進(jìn)行。具體為各組細(xì)胞在相同的條件下培養(yǎng)48 h后用胰酶消化，2 555 r/min離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取5～10萬重懸的細(xì)胞，2 555 r/min離心5 min，棄上清液，加入195 μl Annexin V-FITC Binding buffer重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色液，室溫避光孵育15 min，避光置于冰浴中，立即進(jìn)行檢測，使用Cell Quest software分析結(jié)果。

1.2.6生物信息學(xué)分析 從Gene Expression Omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) 數(shù)據(jù)庫中獲得2個分析PC中miRNA表達(dá)水平的數(shù)據(jù)集(GSE64333和GSE54516)，分析PC組織和癌旁組織中miR-143的表達(dá)水平。分別使用在線分析軟件miRanda (http://www.microrna.org/)、PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/)和TargetScan7.1(http://www.targetscan.org/)預(yù)測 TFF3 3′-UTR中miR-143的結(jié)合位點(diǎn)，取三者的交集，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2.7雙螢光素酶報(bào)告基因分析 分析miR-143與TFF3 3′-UTR的相互作用，構(gòu)建野生型和突變型TFF3 3′-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-TFF3，以及預(yù)測與miR-143結(jié)合區(qū)域點(diǎn)突變的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒Mut-pGL3-TFF3。將熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒(海腎素?zé)晒?和miR-143同時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。48 h后根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)的說明書操作裂解細(xì)胞，加入發(fā)光液后在多功能酶標(biāo)儀上檢測結(jié)果。利用海腎素?zé)晒庾鳛閮?nèi)參照對結(jié)果進(jìn)行均一化處理。

2 結(jié)果

2.1 miR-143在PC組織中表達(dá)水平對GEO數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)集GSE64333和GSE54516分析顯示，與癌旁組織相比，PC組織中miR-143的表達(dá)降低(P<0.000 1)。見圖1。

圖1 miR-143在PC和癌旁組織中表達(dá)水平分析A：數(shù)據(jù)集GSE64333中miR-143的表達(dá)水平；B：數(shù)據(jù)集GSE54516中miR-143的表達(dá)水平;與癌旁組織比較：****P<0.000 1

2.2 miR-143在不同細(xì)胞中的過表達(dá)通過熒光顯微鏡觀察顯示，在PC3/miR-143組和PC3/miR-NC組中均存在明顯的綠色熒光，而在PC3組中未觀察到熒光信號。Real-time PCR檢測顯示PC3/miR-143組中miR-143的表達(dá)量高于PC3組(t=8.877,P=0.000 9)和感染對照慢病毒的PC3組(t=8.358,P=0.001 1)。見圖2。

圖2 miR-143在PC3細(xì)胞中過表達(dá)的鑒定A：熒光顯微鏡觀察不同組細(xì)胞中EGFP的表達(dá) ×200；B：Real-time PCR檢測不同組細(xì)胞中miR-143的表達(dá)水平；1：PC3組；2：PC3/miR-NC組；3：PC3/miR-143組；與PC3/miR-143組比較：**P<0.01

2.3 miR-143對PC3細(xì)胞增殖的影響通過CCK-8法檢測各組細(xì)胞0～96 h增殖情況，結(jié)果表明，從48 h開始，與PC3組相比，PC3/miR-143組的增殖能力明顯下降(F=167.8，P=0.009 5)；PC3/miR-NC組增殖能力未見改變。提示miR-143能抑制PC3細(xì)胞的增殖，見圖3。

圖3 miR-143對抑制PC3細(xì)胞增殖的影響與PC3組比較：*P<0.05；與PC3/miR-NC組比較：##P<0.01

2.4 miR-143對PC3細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞分析PC3組、PC3/miR-NC組和PC3/miR-143組的凋亡比例分別是(3.6%±0.5%)、(3.2%±0.7%)和(10.4%±1.7%)。PC3/miR-143細(xì)胞的凋亡比例高于PC3組(t=6.647,P=0.003)和PC3/miR-NC組(t=6.783,P=0.003)。提示miR-143在PC3細(xì)胞中具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-143對PC3細(xì)胞凋亡的影響1：PC3組；2：PC3/miR-NC組；3：PC3/miR-143組

2.5 miR-143靶向作用于TFF3 3′-UTR抑制TFF3的表達(dá)情況生物信息學(xué)軟件分析顯示miR-143與TFF3的3′-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)；雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，miR-143能夠靶向作用于TFF3的3′-UTR抑制其表達(dá)，當(dāng)對TFF3的3′-UTR中結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變處理后，miR-143的抑制作用消失(圖5B、C)。Real-time PCR檢測的結(jié)果顯示，在過表達(dá)miR-143的PC3/miR-143組，TFF3的表達(dá)水平低于PC3組(t=6.417,P=0.002)和PC3/miR-NC組(t=6.322,P=0.002)(圖5D)。

圖5 miR-143靶向作用于TFF3 3′-UTR對TFF3表達(dá)的影響A：在線分析軟件預(yù)測TFF3 3′-UTR中miR-143的結(jié)合位點(diǎn)；B：pGL3-TFF3和Mut-pGL3-TFF3熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建的示意圖；C：雙熒光素酶報(bào)告基因分析miR-143與TFF3 3′-UTR的靶向作用；D：Real-time PCR檢測在PC3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-143對TFF3 mRNA的表達(dá)水平的影響；與miR-143組比較：**P<0.01

2.6 TFF3抵消miR-143對PC3細(xì)胞增殖的抑制作用在PC3/miR-143組中轉(zhuǎn)染TFF3真核表達(dá)質(zhì)粒，通過CCK-8法檢測各組細(xì)胞0～96 h增殖情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TFF3后PC3/miR-143組的增殖能力明顯增加(F=120.9，P=0.008 7)，見圖6。

圖6 轉(zhuǎn)染TFF3后miR-143對抑制PC3細(xì)胞增殖的影響與PC3/miR-143組比較：*P<0.05；與PC3/miR-143+pCDNA3.1組比較：##P<0.01

2.7 TFF3抵消miR-143對PC3細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用流式細(xì)胞技術(shù)分析PC3組、PC3/miR-143組、PC3/miR-143+pCDNA3.1組和PC3/miR-143+pCDNA3.1-TFF3組的凋亡比例分別是(4.6%±0.6%)、(11.2%±1.1 %)、(12.1%±1.5%)和(5.1%±1.2%)。PC3/miR-143+pCDNA3.1-TFF3組的凋亡比例低于PC3/miR-143+pCDNA3.1組(t=7.244,P=0.001 9)和PC3/miR-143組(t=5.549,P=0.005 2)。提示TFF3能夠抵消miR-143的促凋亡作用。見圖7。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測TFF3對PPC3/miR-143細(xì)胞凋亡的影響1：PC3組；2：PC3/miR-143組；3：PC3/miR-143+pCDNA3.1組；4：PC3/miR-143+pCDNA3.1-TFF3組

3 討論

近十年來，越來越多的研究[4]證明miRNA在癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中起著重要作用。miRNA表達(dá)水平異常與PC的發(fā)生有關(guān)，miR-9-5p能夠抑制PC的增殖[5]，而miR-34a能夠促進(jìn)PC的轉(zhuǎn)移[6]。在砷誘導(dǎo)獲得癌表型的前列腺干細(xì)胞中，有幾種miRNA的表達(dá)水平發(fā)生改變，其中miR-143的表達(dá)水平下降最明顯[7]。提示miR-143參與了PC的發(fā)生，但其分子機(jī)制還不是很清楚。該研究對GEO數(shù)據(jù)庫中關(guān)于PC miRNA表達(dá)水平的數(shù)據(jù)集GSE64333和GSE54516分析也表明，PC組織中miR-143的表達(dá)下降。本研究分析了PC3細(xì)胞中miR-143的作用，在PC3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-143 mimics能夠抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。生物信息學(xué)分析顯示，miR-143可能靶向作用于TFF3基因的3′-UTR，抑制其表達(dá)。在本研究中Real-time PCR和Western blot的結(jié)果均顯示在PC3中穩(wěn)定表達(dá)miR-143能夠抑制TFF3 mRNA和蛋白的表達(dá)。

TFF3是一種分泌肽，主要在胃腸道黏膜上皮中表達(dá)，參與腸道黏膜損傷后修復(fù)。除了參與黏膜修復(fù)外，TFF3還參與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和抗凋亡信號的激活。在乳腺癌[8]、胃癌[9]、胰腺癌[10]、結(jié)直腸癌[11]和PC[12]中均觀察到TFF3的表達(dá)異常增加。Garraway et al[13]均報(bào)告TFF3在PC組織中高于正常前列腺組織(分別為42%vs10%和47%vs18.8%)，提示TFF3是PC的生物標(biāo)志物。在PC細(xì)胞中過表達(dá)TFF3能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究表明miR-143在PC3中表達(dá)降低，TFF3在PC3中表達(dá)增加。先前的研究提示在多種腫瘤中miR-143的表達(dá)水平均下降。在鼻咽癌中miR-143能夠靶向作用于FMNL1，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[14]；在骨肉瘤中miR-143能夠靶向作用于FOSL2，抑制其肺轉(zhuǎn)移[15]。一項(xiàng)研究[16]顯示，在PC中，姜黃素能夠上調(diào)miR-143的表達(dá)，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展；此外，在去勢治療抵抗的PC細(xì)胞中下調(diào)TFF3的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞侵襲。另一項(xiàng)研究[17]顯示，在PC細(xì)胞中下調(diào)TFF3的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增加放療敏感性。本研究在穩(wěn)定表達(dá)miR-143的PC3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TFF3真核表達(dá)質(zhì)粒，能夠抵消miR-143的作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明在PC中miR-143可能通過靶向抑制TFF3的表達(dá)，發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，該研究表明，在PC3細(xì)胞中過表達(dá)miR-143能夠下調(diào)TFF3表達(dá)，發(fā)揮抑制PC細(xì)胞增殖作用；提示miR-143和TFF3基因是治療PC的潛在靶點(diǎn)。后期還需要進(jìn)行臨床和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確miR-143和TFF3基因在PC中的作用機(jī)制。