血管生成素1在高同型半胱氨酸血癥大鼠血漿中高表達(dá)及對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

沈童童，周利民，董雙雙，王欣欣，徐小紅，劉 玉，鄭 凡，馬劭博，沈 兵

血管生成素1(angiopoietin 1, Ang 1)由血管壁細(xì)胞、周細(xì)胞和某些其他細(xì)胞生成，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并與其特異性受體型酪氨酸激酶Tie-2的配體結(jié)合[1-2]。Ang 1具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、侵襲和防止?jié)B漏等作用[3-4]。但其在高同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)血癥引起的血管內(nèi)皮功能損傷修復(fù)中的作用未見(jiàn)報(bào)道。

Hcy異常升高被廣泛認(rèn)為是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。過(guò)多的Hcy會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能損傷，引起血管的新生、收縮、通透性等功能改變，其分子機(jī)制復(fù)雜[5]。該研究探討高Hcy飼料喂養(yǎng)的SD大鼠血漿中Ang 1變化及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑與儀器 Ang 1(貨號(hào)：13667-H02H1)購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；Ⅰ型膠原蛋白酶(貨號(hào)：SCR103)、Hcy(貨號(hào)：H4628)購(gòu)自德國(guó)Merck公司；CCK-8試劑(貨號(hào)：A311-01)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司公司；Label-free質(zhì)譜儀Orbitrap Fusion、液相色譜Easy nLC/Ultimate 3000購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；倒置顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；SpectraMax M5讀板儀(美國(guó)Molecular Devices公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。自由進(jìn)食進(jìn)水，飼養(yǎng)室溫維持(22±1)℃。

1.2 方法

1.2.1高Hcy血癥動(dòng)物模型 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各4只SD大鼠，對(duì)照組大鼠采用anAIN93M基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，高Hcy血癥模型組采用同樣基礎(chǔ)飼料，但不含葉酸、維生素B12和維生素B6。兩種飼料都含有1%的磺胺噻唑，可以抑制腸道細(xì)菌形成葉酸。5周后成模，CO2窒息處死后迅速進(jìn)行心臟穿刺取血，采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清Hcy水平。

1.2.2Label-free蛋白質(zhì)譜分析 將大鼠血漿去除中高豐度蛋白后，低豐度蛋白濃縮凍干，復(fù)溶后測(cè)濃度，取60 μg蛋白溶解后加入胰蛋白酶37 ℃降解16 h，樣品經(jīng)過(guò)毛細(xì)管高效液相色譜分離后進(jìn)行質(zhì)譜儀分析，后續(xù)再予以Label-free分析獲得蛋白質(zhì)信息。

1.2.3腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng) 將健康雄性SD大鼠CO2窒息處死，用剪刀解剖大鼠腹部，一次性針筒插入左心室，用無(wú)菌生理緩沖液灌流直至肝臟變白，剝離其腸系膜動(dòng)脈血管，分離多余的脂肪組織，將腸系膜動(dòng)脈血管剪碎，用Ⅰ型膠原蛋白酶消化(37 ℃，10 min)，離心后棄上清液，加入1 ml培養(yǎng)基，吹打混勻，移至培養(yǎng)皿中，1 h后換液。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 用Marker筆在6孔板背后沿著直尺大約每隔0.5 cm劃一道線，橫穿過(guò)孔(每孔5～6條線)，每孔加入約5×105個(gè)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，第2天用200 μl槍頭沿著直尺與標(biāo)記線垂直的方向劃兩條平行線，用無(wú)菌PBS洗去劃掉的細(xì)胞，加入培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)，按0、24 h用倒置顯微鏡觀察，拍照。

1.2.5CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 首先在無(wú)血清的培養(yǎng)基中同步化細(xì)胞，繼而在96孔板中配制100 μl/孔的細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃、5% CO2)。棄除培養(yǎng)基，向培養(yǎng)板加入100 μl/孔不同濃度的Hcy標(biāo)準(zhǔn)品，在培養(yǎng)箱孵育24 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 高Hcy血癥大鼠血漿蛋白改變蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)到對(duì)照組和高Hcy血癥組大鼠血漿中555個(gè)蛋白，其中5個(gè)蛋白(Mmrn1、Tgfb1、Ctsa、Ang 1、Golgb1)在血漿中的表達(dá)量上調(diào)，17個(gè)蛋白(RGD1565617、Psmb1、Psma6、Jchain、Tfrc、Lamp2、Igh-6、LOC103690319、Sell、Cd5l及7個(gè)未知蛋白)表達(dá)量下調(diào)(圖1A)；將兩組出現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行聚類分析，兩組樣本具有較一致的變化趨勢(shì)(圖1B)。

圖1 蛋白質(zhì)譜火山圖和熱點(diǎn)圖A：蛋白質(zhì)譜火山圖；紅色點(diǎn)：上調(diào)的蛋白；綠色點(diǎn)：下調(diào)的蛋白；黑色點(diǎn)：無(wú)顯著性差異的蛋白；B：蛋白質(zhì)譜熱點(diǎn)圖；1～4：實(shí)驗(yàn)組；5～8：對(duì)照組；紅色：上調(diào)；綠色：下調(diào)

2.2 高Hcy血癥大鼠血漿Ang 1蛋白濃度表達(dá)變化高Hcy血癥大鼠血漿Hcy濃度比對(duì)照組升高[(3.72±0.43 )μmol/Lvs(36.82±6.22 ) μmol/L,n=4,t=-5.309,P<0.05]。在蛋白質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果中，對(duì)照組和高Hcy血癥組大鼠血漿Ang 1蛋白含量差異如圖2所示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿中Ang 1蛋白含量升高(t=-3.748,P<0.05)。

圖2 大鼠血漿Ang 1蛋白表達(dá)水平A：兩組大鼠血漿Ang 1蛋白質(zhì)譜結(jié)果熱點(diǎn)圖：1～4：實(shí)驗(yàn)組；5～8：對(duì)照組；B：變化倍數(shù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；與對(duì)照組相比較：*P<0.05

2.3 Ang 1對(duì)Hcy抑制的大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響Ang 1(600 ng/ml)處理內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，血管內(nèi)皮細(xì)胞劃痕后的愈合率增強(qiáng)[(21.76%±1.71%)vs(33.18%±3.61%),n=8,t=-2.859,P<0.05](圖3A)；另一組采用0、10、30、50 μmol/L的Hcy處理內(nèi)皮細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示30、50 μmol/L的Hcy處理組劃痕后的愈合率受到抑制(圖3B、C)；第三組采用0 μmol/L Hcy+溶劑對(duì)照、30 μmol/L Hcy、30 μmol/L Hcy+Ang 1(600 ng/ml)、50 μmol/L Hcy、50 μmol/L Hcy+Ang 1(600 ng/ml)分別處理內(nèi)皮細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示Ang 1阻斷了30 μmol/L Hcy引起的劃痕后愈合抑制效應(yīng)，但Ang 1沒(méi)有阻斷50 μmol/L Hcy引起的劃痕后愈合抑制效應(yīng)(圖3D)。

圖3 Ang 1對(duì)Hcy抑制的腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的阻斷作用A：Ang 1對(duì)腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響(n=8)；與對(duì)照組比較：△P<0.05；B、C：不同濃度Hcy對(duì)腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響(n=8)；與0 μmol/L Hcy組比較：▽P<0.05；D：Ang 1對(duì)不同濃度Hcy抑制的腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的阻斷作用(n=8)；與0 μmol/L Hcy+0 ng/ml Ang 1組比較：*P<0.05；與30 μmol/L Hcy+0 ng/ml Ang 1組比較：#P<0.05

2.4 Ang 1對(duì)Hcy抑制的大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的影響實(shí)驗(yàn)以腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，結(jié)果顯示，0、10、30、50 μmol/L的Hcy處理內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，30、50 μmol/L的Hcy抑制了內(nèi)皮細(xì)胞增殖(圖4A)；另一組采用0 μmol/L Hcy+溶劑對(duì)照、30 μmol/L Hcy、30 μmol/L Hcy+ Ang 1(600 ng/ml)、50 μmol/L Hcy、50 μmol/L Hcy+Ang 1(600 ng/ml)分別處理內(nèi)皮細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示，Ang 1阻斷了30 μmol/L Hcy引起的增殖抑制效應(yīng)，但對(duì)50 μmol/L Hcy抑制的增殖無(wú)阻斷作用(圖4B)。

圖4 Ang 1對(duì)Hcy抑制的腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的阻斷作用A：不同濃度Hcy對(duì)腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響(n=3)；與0 μmol/L Hcy組比較：&P<0.05；B：Ang 1對(duì)不同濃度Hcy抑制的腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的阻斷作用(n=6)，與0 μmol/L Hcy+0 ng/ml Ang 1組比較：*P<0.05；與30 μmol/L Hcy+0 ng/ml Ang 1組比較：#P<0.05

3 討論

美國(guó)心臟協(xié)會(huì)在2014年將Hcy血漿水平>10 μmol/L作為高Hcy血癥的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。2018年修訂版的《中國(guó)高血壓防治指南》中將血漿中Hcy水平修訂為≥15 μmol/L作為診斷高Hcy血癥的臨床標(biāo)準(zhǔn)[6]。血漿中過(guò)高的Hcy可引起血管內(nèi)皮功能損傷，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，從而引起一系列心腦血管疾病[7-9]，因此，闡明高Hcy血癥在高血壓及各種心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義。

研究[10]顯示，Hcy可通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)的活性氧引起線粒體途徑的凋亡，參與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展?？寡趸瘎┛删徑釮cy引起氧化應(yīng)激并激活VEGF-VEGFR-FAK信號(hào)通路導(dǎo)致的內(nèi)皮功能損傷[11]。也有研究[12]報(bào)道補(bǔ)充Hcy代謝調(diào)節(jié)中的葉酸可抑制Hcy引起的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。在Hcy對(duì)血管生成素影響方面，僅有文獻(xiàn)報(bào)道Hcy處理可顯著抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的Ang 1和2的表達(dá)[13]，但血管生成素對(duì)高Hcy引起的內(nèi)皮功能損傷的抑制作用國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。因此，闡述血管生成素對(duì)高Hcy引起的內(nèi)皮功能損傷的調(diào)節(jié)作用具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。蛋白質(zhì)譜檢測(cè)方法可以從一個(gè)樣本中同時(shí)鑒定多種蛋白質(zhì)類型及其表達(dá)水平，是蛋白組學(xué)研究的重要手段[14]，本研究采用蛋白質(zhì)譜方法從動(dòng)物水平研究顯示，高Hcy血癥大鼠血漿蛋白表達(dá)譜出現(xiàn)改變，多個(gè)蛋白出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)，其中Ang 1在高Hcy血癥大鼠血漿中也上調(diào)。而Ang 1具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、侵襲和防止?jié)B漏等內(nèi)皮保護(hù)作用，因此猜測(cè)，在高Hcy血癥大鼠中，Ang 1可能為反射性的升高，從而阻斷高Hcy引起的內(nèi)皮功能損傷，是一種內(nèi)皮保護(hù)性的代償機(jī)制。為證實(shí)該推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)以與血壓形成密切相關(guān)的阻力血管，即腸系膜上動(dòng)脈為研究對(duì)象，通過(guò)原代培養(yǎng)腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，Hcy可濃度依賴地抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖，說(shuō)明一定濃度的Hcy可引起內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷。但是，當(dāng)一定濃度的Ang 1與Hcy共同處理內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，阻斷了低濃度Hcy抑制的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖，但不能阻斷高濃度Hcy引起的內(nèi)皮損傷。說(shuō)明Ang 1只能在一定范圍內(nèi)對(duì)Hcy引起的內(nèi)皮損傷有修復(fù)作用。本研究中的高Hcy血癥大鼠血漿中，Hcy濃度為36.82 μmol/L左右，與本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中Ang 1有效阻斷Hcy引起內(nèi)皮功能損傷的Hcy濃度接近，說(shuō)明Ang 1在高鹽飲食情況下會(huì)起到一定的血管內(nèi)皮功能保護(hù)作用。因此，高Hcy血癥一方面可引起血管內(nèi)皮損傷，另一方面可引起細(xì)胞合成和分泌蛋白增強(qiáng)或減弱。其中，高Hcy反射性引起Ang 1在血漿中含量升高，而升高的Ang 1可在一定程度上阻斷了高Hcy引起的內(nèi)皮功能損傷，可能參與高Hcy血癥時(shí)內(nèi)皮功能的代償機(jī)制。另一方面，該結(jié)果也提示Ang 1在Hcy血癥引起的血管內(nèi)皮功能損傷中也具有潛在治療價(jià)值。但本研究仍未闡明，在高Hcy血癥大鼠血漿中升高的Ang 1通過(guò)何種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路抑制Hcy引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及Ang 1來(lái)自于何種組織細(xì)胞。

綜上所述，高Hcy血癥可顯著影響部分血漿蛋白分泌，且高Hcy血癥模型大鼠血漿中升高的Ang 1可在一定濃度范圍內(nèi)參與阻斷高Hcy引起的血管內(nèi)皮功能損傷。該研究揭示了一種高Hcy血癥血管內(nèi)皮功能代償機(jī)制，也為Ang 1在Hcy血癥引起的血管內(nèi)皮功能損傷治療中提供潛在的新方法和新靶點(diǎn)。