ABC亞家族G成員2基因多態(tài)性與小兒急性淋巴細(xì)胞白血病大劑量甲氨蝶呤治療效果及腎功能損傷的關(guān)系

葛一蓉, 饒 媚, 畢 婧, 譚四海, 韓 斌

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 兒童血液消化腎病科, 湖北 恩施, 445000)

甲氨蝶呤(MTX)已被廣泛用作兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的大多數(shù)化療方案中的抗癌劑。盡管MTX在臨床上的應(yīng)用取得了成功，但仍可能會(huì)存在副作用和毒性[1]。MTX的藥代動(dòng)力學(xué)、功效和毒性在不同患者間存在很大差異，這種差異可部分解釋為編碼MTX膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的序列差異[2-3]。MTX通過(guò)三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞中輸出，已知MTX的外向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是ABC亞家族G成員2(ABCG2)[4]。由ABCG2基因編碼的P-糖蛋白在多種組織中既可作為功能屏障，又可作為外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以影響多種抗癌藥物的藥代動(dòng)力學(xué)。研究[5]顯示ABCG2基因中的變體可改變P-糖蛋白的表達(dá)和功能。腫瘤細(xì)胞中P-糖蛋白的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致多藥耐藥性，并且許多抗白血病藥物(例如糖皮質(zhì)激素、蒽環(huán)霉素和長(zhǎng)春新堿)是P-糖蛋白的底物。盡管MTX不被視為P-糖蛋白底物，但MTX單藥治療的研究[6]表明，沉默的ABCG2多態(tài)性可能影響MTX治療后的結(jié)果和毒性。本研究分析ABCG2基因多態(tài)性(rs2231137、rs2231142)對(duì)大劑量MTX(HDMTX)治療效果和毒性的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月—2019年1月在本院新診斷為ALL的患兒193例。納入標(biāo)準(zhǔn): ① DNA樣本和臨床數(shù)據(jù)具有可用性; ② 接受中國(guó)兒童白血病協(xié)作組兒童急性淋巴細(xì)胞白血病2008治療方案(CCLG-ALL 2008)者; ③ 無(wú)唐氏綜合征和既往惡性腫瘤史者。根據(jù)上述條件，本研究排除了26例不符合標(biāo)準(zhǔn)的患兒(19例患兒臨床數(shù)據(jù)明顯缺失, 1例患兒未按照CCLG-ALL 2008方案進(jìn)行治療, 4例患兒在沒(méi)有進(jìn)入鞏固期或完成HDMTX治療時(shí)經(jīng)歷早期復(fù)發(fā)或死亡, 1例患兒出現(xiàn)唐氏綜合征, 1例患兒出現(xiàn)既往惡性腫瘤史)，其余167例患兒隨訪時(shí)間1.0～115.0個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為75個(gè)月。CCLG-ALL 2008治療方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.2 治療方法

根據(jù)年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子畸變、強(qiáng)的松反應(yīng)、誘導(dǎo)治療結(jié)束時(shí)的形態(tài)學(xué)緩解[基于柏林-法蘭克福-明斯特(BFM)臨床試驗(yàn)方案風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)準(zhǔn)]、治療結(jié)束時(shí)的微小殘留病(MRD), 將患兒分為標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)組(SR組)和中間風(fēng)險(xiǎn)組(IR組)，并參照CCLG-ALL 2008中誘導(dǎo)治療和鞏固治療的方案進(jìn)行治療[7]。在化療鞏固階段(第8、22、36、50天)，患兒每2周接受4次HDMTX治療。HDMTX的給藥方式為: 總劑量的10%在0.5 h內(nèi)通過(guò)靜脈內(nèi)輸注完成，剩余的90%在23.5 h內(nèi)使用(SR組的MTX劑量為2 g/m2, IR組的MTX劑量為5 g/m2)。分別在HDMTX輸注開(kāi)始后42、48、54 h, 以15 mg/m2劑量進(jìn)行甲酰四氫葉酸解救治療。48 h后的高血漿MTX水平(>0.25 μmol/L)定義為延長(zhǎng)解救的指示。每天監(jiān)測(cè)血漿中MTX水平，直至低于0.2 μmol/L。連續(xù)輸注MTX 24 h以上，并在48 h收集2 mL的血液樣品。依據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(美國(guó)TDx Abbott Laboratories), 通過(guò)熒光偏振免疫測(cè)定MTX血漿水平。

1.3 毒性和治療效果評(píng)估

從HDMTX輸注結(jié)束到下次HDMTX周期或HDMTX輸注后14 d期間評(píng)估每個(gè)HDMTX周期后的毒性。血液毒性定義為血清血紅蛋白水平降低(貧血)、白細(xì)胞減少和血小板計(jì)數(shù)減少。肝毒性定義為血清谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)或γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)水平升高。腎功能損傷定義為血清肌酐或尿素水平升高。胃腸道毒性定義為存在腹瀉、惡心、嘔吐、腸梗阻、胃腸疼痛等。根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所常見(jiàn)毒性標(biāo)準(zhǔn)4.0版對(duì)毒性進(jìn)行分級(jí)。選擇鞏固期最高等級(jí)的個(gè)體毒性作為所有分析的終點(diǎn)。治療效果通過(guò)事件的發(fā)生情況來(lái)反映，包括任何部位的疾病復(fù)發(fā)、任何原因的死亡或第二惡性腫瘤的發(fā)生。無(wú)事件生存(EFS)定義為從化療首日至事件發(fā)生所經(jīng)歷的時(shí)間。末次隨訪時(shí)，對(duì)最終分析時(shí)沒(méi)有不良記錄結(jié)果的患兒進(jìn)行檢查。

1.4 基因分型

從外周血白細(xì)胞和(或)從存檔的骨髓載玻片中分離基因組DNA。分別采用Qiagen FlexiGene試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)和QIAamp DNA Mini試劑盒(Qiagen)從冷凍全血樣品或骨髓載玻片中提取DNA。使用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)基因分型方法測(cè)定ABCG2基因rs2231137、rs2231142位點(diǎn)的基因型，見(jiàn)圖1。PCR擴(kuò)增在以下條件下進(jìn)行: 初始變性(95 ℃, 10 min), 40個(gè)變性循環(huán)(95 ℃, 15 s), 退火(60 ℃, 1 min), 延伸(72 ℃, 1 min)和延長(zhǎng)(72 ℃, 7 min)。rs2231137引物序列: 正向?yàn)?′-CCCAGAGTCCTTATTCTTAGCC-3′, 反向?yàn)?′-GTGCCTCCTTCACACACAG-3′。rs2231142引物序列: 正向?yàn)?′-TGTTGTGATGGGCACTCTGATG-3′, 反向?yàn)?′-ATCAGAGTCATTTTATCCACAC-3′。擴(kuò)增完成后, 將限制酶HpyCH4IV加入PCR產(chǎn)物中并在37 ℃下孵育4 h, 采用溴化乙錠染色的3%瓊脂糖凝膠電泳分析RFLP。

A: ABCG2 rs2231137位點(diǎn); B: ABCG2 rs2231142位點(diǎn)。圖1 ABCG2不同基因型的代表性PCR-RFLP分析

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 ALL患兒的臨床特征及治療結(jié)果

167例ALL患兒年齡0.5～18.0歲，中位年齡4.9歲; 男80例(47.9%), 女87例(52.1%); 免疫表型包括B細(xì)胞140例(83.8%), T細(xì)胞21例(12.6%), 雙表型2例(1.2%), 未表征4例(2.4%); SR組78例(46.7%), IR組89例(53.3%); 具有延遲的MTX間隙的周期包括0個(gè)周期92例(55.1%), 1個(gè)周期38例(22.8%), 2個(gè)周期24例(14.4%), 3個(gè)周期8例(4.8%), 4個(gè)周期 5例(3.0%); MTX的平均峰濃度(Cmax)為(72.5±54.3) μmol/L; MTX第1、2、3、4周期的平均AUC為(447.2±390.1)、(435.4±353.6)、(366.9±328.4)、(358.9±336.5) μmol/(L·h); 治療結(jié)果為首次緩解133例(79.6%), 發(fā)生事件34例(20.4%)。

2.2 ABCG2基因型分布

通過(guò)PCR-RFLP基因分型方法確定了167例患兒ABCG2的2個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs), 其基因型分布見(jiàn)表1。rs2231137位點(diǎn)和rs2231142位點(diǎn)的基因型分布頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)均在HWE中(P>0.05), 說(shuō)明研究人群具有代表性。

表1 ALL患兒ABCG2基因多態(tài)性的頻率(n=167)[n(%)]

2.3 ABCG2基因型與HDMTX化療毒副作用的關(guān)系

167例ALL患兒接受HDMTX化療的毒副作用以血液毒性(80.8%)為主，其次為胃腸道毒性(36.5%)、口腔黏膜炎(26.9%)、肝毒性(23.4%)和腎功能損傷(17.4%)。進(jìn)一步分析ABCG2的2個(gè)SNPs與HDMTX化療毒副作用的關(guān)系，結(jié)果顯示rs2231137各基因型與HDMTX各類(lèi)毒副反應(yīng)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); rs2231142中(CT+TT)基因型個(gè)體發(fā)生腎功能損傷的風(fēng)險(xiǎn)較CC野生型提高了14.14倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=14.14, 95%CI為1.26～42.37,P=0.032)。見(jiàn)表2。

表2 ABCG2的2個(gè)SNPs與HDMTX化療毒副作用的關(guān)系[n(%)]

2.4 ABCG2基因型與治療效果的關(guān)系

為了確定所選SNPs對(duì)ALL患兒治療結(jié)果的影響，本研究進(jìn)行了單變量和多變量分析，結(jié)果顯示rs2231137中(AG+AA)基因型個(gè)體的72個(gè)月EFS比GG基因型個(gè)體更差, rs2231142中(CT+TT)基因型個(gè)體的72個(gè)月EFS比CC基因型個(gè)體更差，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 ABCG2基因型與治療效果的關(guān)系

3 討 論

HDMTX在改善ALL的治愈率方面起著重要作用。然而, MTX療效存在很大的個(gè)體差異[3]。既往研究[8-9]中涉及MTX轉(zhuǎn)運(yùn)體通路的基因中有多個(gè)SNPs參與了MTX的動(dòng)力學(xué)和效應(yīng)，但部分結(jié)果并不明確。本研究分析ALL患兒MTX的外向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG2基因多態(tài)性與HDMTX相關(guān)毒性的關(guān)系，這些患兒均按照CCLG-ALL 2008方案接受治療，評(píng)估ABCG2基因多態(tài)性對(duì)治療效果的影響，結(jié)果顯示,ABCG2rs2231142 SNPs與腎臟損傷發(fā)生率升高有顯著相關(guān)性。這些結(jié)果與其他研究[9]報(bào)道的ABCG2rs2231142 SNPs對(duì)兒童期ALL治療結(jié)果的影響不一致，該研究并未發(fā)現(xiàn)ABCG2rs2231142 SNPs與MTX毒性相關(guān)。本研究中, MTX相關(guān)毒性在維持階段MTX劑量減少時(shí)評(píng)估，與鞏固階段相比，患兒服用的MTX劑量要低得多。目前，多項(xiàng)研究[9-10]調(diào)查了ABCG2基因多態(tài)性對(duì)HDMTX相關(guān)毒性的影響，但研究結(jié)果卻相互矛盾，造成這種差異的可能解釋是在HDMTX后服用葉酸會(huì)降低HDMTX引起的毒性增加的可能性。

HDMTX誘導(dǎo)的腎損傷發(fā)生在穩(wěn)態(tài)血漿濃度結(jié)束時(shí)或結(jié)束后不久，其誘導(dǎo)腎臟損傷的可能機(jī)制包括腎小管內(nèi)尿液中MTX的pH值依賴(lài)性沉淀，來(lái)自傳入小動(dòng)脈血管收縮的腎灌注減少，或直接毒性導(dǎo)致的腎小管內(nèi)MTX攝取減少[11-12]?；贖DMTX誘導(dǎo)腎臟損傷的發(fā)生時(shí)間，在HDMTX輸注前、輸注中和輸注后進(jìn)行堿化尿液和葉酸補(bǔ)救均能有效預(yù)防HDMTX誘導(dǎo)的腎臟損傷，支持MTX沉淀在這種毒性中發(fā)揮作用的觀點(diǎn)[13]。目前, rs2231142多態(tài)性在HDMTX相關(guān)腎臟損傷中的作用仍未完全明確，但研究[9]表明TT等位基因是HDMTX相關(guān)毒性?xún)A向因子。本研究證實(shí)了rs2231142 TT基因型與HDMTX相關(guān)腎臟損傷發(fā)生概率增加的關(guān)聯(lián)。但是，也有研究[9-10]提示并未發(fā)現(xiàn)rs2231137多態(tài)性與HDMTX相關(guān)毒性之間有任何關(guān)聯(lián)，其原因可能是體外淋巴細(xì)胞酶的活性顯示，rs2231142 TT、TC基因型酶的活性分別為野生型CC活性的70%、40%, 而rs2231137 AA基因型酶的活性約為野生型GG的30%[10]。因此, rs2231142位點(diǎn)變異相較于rs2231137位點(diǎn)變異可能使ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降更為明顯，導(dǎo)致更多的MTX留在胞外，進(jìn)而形成MTX沉淀，誘發(fā)腎臟損傷。

近年來(lái)，多項(xiàng)研究[9-10]調(diào)查了ABCG2基因多態(tài)性對(duì)兒童ALL生存的影響，但結(jié)果存在很多不一致。LIU S G等[9]發(fā)現(xiàn)rs2231142可作為ALL兒童的獨(dú)立預(yù)后因素。CHANG Y H等[14]發(fā)現(xiàn)rs2231142與136例中國(guó)ALL患兒的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)，但T等位基因(TT+TC)患者的60個(gè)月EFS低于CC基因型患者。本研究發(fā)現(xiàn)具有rs2231142 T等位基因(TT+TC)型患者的72個(gè)月EFS較CC基因型患者更差[(81.5±4.6)%對(duì)比(90.2±1.8)%], 但在進(jìn)一步的單變量和多變量分析中并未發(fā)現(xiàn)rs2231142與患兒的EFS具有相關(guān)性。此外，本研究的中位隨訪時(shí)間長(zhǎng)于LIU S G等[9]、CHANG Y H等[14]研究的隨訪時(shí)間，理論上出現(xiàn)復(fù)發(fā)的例數(shù)要增多，因?yàn)閺?fù)發(fā)往往發(fā)生在后期許多低風(fēng)險(xiǎn)的患者中[15]。因此，目前的結(jié)果可能表明ABCG2基因多態(tài)性不是反映ALL兒童存活的有用標(biāo)志物，應(yīng)進(jìn)一步驗(yàn)證rs2231142與EFS的相關(guān)性。

本研究是一項(xiàng)回顧性研究，在MTX轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中僅選擇ABCG2外向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行分析，沒(méi)有包括其他內(nèi)向和外向蛋白，并且樣本量有限。考慮到上述不足，本研究最小化了臨床數(shù)據(jù)收集程序的差異，因?yàn)樗谢颊呔邮芰司哂锌杀容^的CCLG-ALL 2008 治療方案和標(biāo)準(zhǔn)化的支持性護(hù)理，并且患兒的結(jié)果評(píng)估和隨訪是集中進(jìn)行的。此外，本研究沒(méi)有因遺傳異質(zhì)性而產(chǎn)生偏差，因?yàn)樗惺茉囌叨际窃诰哂蟹N族同質(zhì)性的地理區(qū)域招募的。當(dāng)然，未來(lái)仍需要在獨(dú)立隊(duì)列中進(jìn)一步開(kāi)展前瞻性研究以確認(rèn)本研究的結(jié)果。

綜上所述, ALL患兒的ABCG2rs2231142基因多態(tài)性與HDMTX化療毒副反應(yīng)中腎功能損傷相關(guān)，這可能有助于指導(dǎo)和優(yōu)化ALL患兒的MTX治療。