耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的耐藥機制研究進展

榮 芳, 吳 峰, 周 俊

(1. 揚州大學附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科, 江蘇 揚州, 225000;2. 大連醫(yī)科大學研究生院, 遼寧 大連, 116044)

肺炎克雷伯菌(KP)為腸桿菌屬，根據(jù)毒力特點的不同，可分為普通型肺炎克雷伯菌(cKp)和高毒力肺炎克雷伯菌(hvKp)[1-2]。cKp屬于一種常見的醫(yī)院內(nèi)感染病原體，是引起嚴重呼吸道感染的重要病原菌之一，容易引發(fā)消化道、皮膚、泌尿道、血液等部位感染[3], 在長期使用抗菌藥物、侵入性治療、留置導管等原因?qū)е聶C體免疫力低下的人群中，機會性感染概率更高[4-5]。而hvKp在社區(qū)相關(guān)感染中更常見，壞死性肺炎、化膿性肝膿腫、內(nèi)源性眼內(nèi)炎、腦膜炎、脾膿腫等社區(qū)常見疾病的發(fā)生與hvKp感染有關(guān)[6]。

近年來，抗菌藥物的泛用和濫用，使得KP對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等臨床上使用頻率較高的抗生素均產(chǎn)生了不同程度的耐藥，多重耐藥菌成為臨床亟需攻克的難題[7]。碳青霉烯類抗生素是臨床治療多重耐藥菌的重要武器，但隨著抗菌藥物的不合理使用, KP對多種抗生素均出現(xiàn)了耐藥[8]。隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床上的推廣使用，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)的分離率逐年上升，其感染控制難度大，病死率高[9]。替加環(huán)素(TGC)作為一種極少數(shù)對多重耐藥菌有良好效能的藥物，上市后不久就發(fā)現(xiàn)了耐藥菌株，給臨床治療和院感防控帶來了挑戰(zhàn)，本文就TGC耐藥CRKP菌株(T-CRKP)的耐藥機制研究情況展開綜述，以期為預防與控制該菌的傳播和流行提供依據(jù)。

1 CRKP的流行現(xiàn)狀

臨床上投入使用碳青霉烯類藥物以來，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)在世界范圍內(nèi)的暴發(fā)和流行越來越多被報道。流行病學調(diào)查顯示，CRKP是國內(nèi)外最常見的CRE, 而且由CRKP造成的患者血流感染病死率非常高。美國疾控中心(CDC)數(shù)據(jù)[10]顯示, 2001—2011年美國CRE比率從1.2%增至4.2%, CRKP分離率從1.6%增至10.4%, 2016年歐洲CDC報告顯示，歐洲國家的CRKP分離率浮動為0～66.9%。2005—2018年中國KP對碳青霉烯類的耐藥率呈持續(xù)上升趨勢，其中KP對亞胺培南和美羅培南的耐藥率從3.0%和2.9%分別上升到25.0%和26.3%; 2019年和2020年KP對碳青霉烯類的耐藥率雖然呈連續(xù)下降趨勢，但其檢出率仍超過23.0%[11], 以上數(shù)據(jù)表明中國耐藥菌株的控制情況不容樂觀。目前中國臨床CRKP流行克隆處于動態(tài)進化之中，但是在穩(wěn)定遺傳情況下出現(xiàn)向高毒力和高耐藥方向進化的端倪，并已在全國許多地區(qū)播散，需引起高度重視。

2 CRKP對替加環(huán)素的耐藥現(xiàn)狀

TGC是一種半合成苷氨酰環(huán)素，為米諾環(huán)素的衍生物之一，是在米諾環(huán)素D環(huán) C-9位置上加了側(cè)鏈，穩(wěn)定性更強，不僅克服了制約四環(huán)素類抗菌療效的常見耐藥機制，還能應對多重耐藥菌的感染[12]，2005年被美國食品和藥物管理局(FDA)批準使用[13], 2019年經(jīng)中國國家藥品監(jiān)督管理局批準上市后投入臨床使用。體外研究[14]表明TGC對產(chǎn)KPC酶和金屬酶的腸桿菌科的抗菌效能達到100%。TGC不僅對腸桿菌科細菌具有廣譜高效的抗菌效能，而且對大多數(shù)革蘭陰性菌尤其是耐藥菌均具有顯著的抗菌活性，被認為是應對革蘭陰性菌多重耐藥的最后一道屏障[15-16]。

目前臨床上多以TGC、多黏菌素作為CRKP感染治療的保底用藥, 2015年由FDA批準上市的頭孢他啶/阿維巴坦也可以用來治療CRKP患者[17]。但是由于多粘菌素、頭孢他啶/阿維巴坦臨床治療費用較高, TGC仍是目前臨床治療CRKP感染的第一選擇，其應用給CRKP感染的治療帶來了顯著效果。但作為治療CRKP的最后手段, TGC的用量亦在逐步攀升，與此同時帶來的耐藥問題也日益凸顯，其上市投入臨床后不久就出現(xiàn)了耐藥菌株[18]。雖然全球各地的耐藥案例統(tǒng)計結(jié)果不盡相同，但總體上耐藥率呈逐年上升趨勢，使得KP感染幾乎陷入無藥可治的困境。

3 CRKP對TGC的耐藥機制

自TGC上市應用以來，臨床上發(fā)現(xiàn)的T-CRKP菌株逐漸增多。T-CRKP耐藥機制復雜多樣，近年來關(guān)于T-CRKP菌株已有相關(guān)研究，但其具體耐藥機制目前尚未明確?；仡檱鴥?nèi)外相關(guān)研究，可大致分為以下幾類。

3.1 RND型外排泵過表達

外排泵是位于細菌內(nèi)膜的一種主動轉(zhuǎn)運體，細菌可以借助這個轉(zhuǎn)運體將進入胞內(nèi)的抗菌藥物主動泵出細胞，通過降低抗菌藥物濃度達到耐藥的效果，其在KP中普遍存在且分布廣泛。腸桿菌科中報道較多的耐藥機制是AcrAB-Tolc和 OqxAB的過表達以及新發(fā)現(xiàn)的KpgABC外排泵的過表達。

AcrAB-Tolc外排泵在RND型外排泵中最常見，由外排轉(zhuǎn)運蛋白AcrAB、通道蛋白Tolc、膜融合蛋白AcrA 3個部分組成，本質(zhì)上是一個質(zhì)子依賴型的多藥耐藥泵，以消耗質(zhì)子動力的方式將抗菌藥物從菌體排出。關(guān)于AcrAB-Tolc外排泵的研究也比較透徹，在大腸桿菌、沙門氏菌的研究中已對其機制進行了明確闡述，其作為一種抗菌藥物外排泵，對進入細菌胞內(nèi)的氯霉素類、四環(huán)素類以及在漿液中發(fā)揮抗菌活性的β-內(nèi)酰胺類抗生素均具有良好的識別與外排作用。先前研究[19]表明, AcrAB-Tolc外排泵中ramA、mraA、soxA、rob等調(diào)控基因表達的產(chǎn)物屬于AraC/XylS調(diào)控蛋白家族，可起到上調(diào)acrAB-tolC基因表達的作用，而acrR基因編碼的蛋白可下調(diào)acrAB-tolC的表達[20]。在AcrAB-Tolc外排泵的間接調(diào)控作用中,ramR、marR、soxR調(diào)控基因分別與ramA、marA、soxS的轉(zhuǎn)錄抑制因子一一對應，通過抑制acrAB-tolC上調(diào)基因的表達進而阻止外排泵AcrAB的合成來發(fā)揮負性調(diào)控作用[21]。若ramR發(fā)生基因突變、RamR表達量減少或下降，其對ramA基因產(chǎn)生的抑制效能就會降低, RamA的表達量會增加, AcrAB-TolC也會因此過表達。外排泵的過表達使得TGC難以進入細菌體內(nèi)發(fā)揮作用，從而產(chǎn)生了耐藥性。

同屬于RND 家族的OqxAB外排泵，是一種由質(zhì)粒編碼的蛋白產(chǎn)物，最早研究發(fā)現(xiàn)與喹諾酮類耐藥相關(guān)，現(xiàn)經(jīng)研究證實與腸桿菌科細菌發(fā)生多重耐藥(MDR)也有一定關(guān)系。OqxAB同樣有其表達調(diào)控基因rarj與oqxR等, OqxAB的過表達可使進入菌體內(nèi)多種藥物的敏感性降低，如替加環(huán)素、喹諾酮類、呋喃妥因和氯霉素等[22], 從而產(chǎn)生耐藥效果。

KpgABC外排泵是RND家族新成員，于2014 年被NIELSEN L E等[23]首次發(fā)現(xiàn)，之后JUAN C H等[24]在KP菌血癥患者中發(fā)現(xiàn)kpgABC基因的過表達會提升替加環(huán)素的耐藥率，且通過克隆轉(zhuǎn)化等實驗證明不需要其他外排泵的輔助也可獨立發(fā)揮排菌作用，雖然沒有達到EUCAST判斷標準，但KP對替加環(huán)素的MIC明顯增加。這一發(fā)現(xiàn)對T-CRKP的耐藥性研究有了新的進展，但是目前關(guān)于KpgABC外排泵的其他研究還十分有限。

3.2 四環(huán)素耐藥相關(guān)基因突變

TGC是新一代四環(huán)素類抗菌藥物，最早研究發(fā)現(xiàn)可有效地克服四環(huán)素類傳統(tǒng)耐藥機制，而AKIYAMA T等[25]研究發(fā)現(xiàn)沙門菌攜帶的tetA基因不僅對四環(huán)素耐藥，也會使替加環(huán)素對細菌的敏感性降低。后來有研究發(fā)現(xiàn)在大腸埃希菌中的Tet蛋白均可以通過突變對替加環(huán)素產(chǎn)生抗性。其中，TetA和TetX對替加環(huán)素產(chǎn)生高水平抗性，而TetK和TetM對其產(chǎn)生低水平抗性。研究[26]表明TetX能夠表達一種依賴于黃素的單加氧酶，這種酶可對替加環(huán)素進行羥基化修飾，使得替加環(huán)素在弱酸環(huán)境中失去穩(wěn)定性而喪失抗菌活性，但是有關(guān)該基因的作用機制還未在KP中有所報道。外排泵TetA、核糖體保護蛋白TetM、以及MFS外排泵編碼基因tetL, 也被證實在一些細菌中對替加環(huán)素產(chǎn)生了耐藥，但是在KP中未有發(fā)現(xiàn)。目前僅發(fā)現(xiàn)T-CRKP的耐藥性與變異型和外排泵表達有關(guān)[27]。

3.3 結(jié)合位點突變

TGC的抗菌機制是通過可逆性結(jié)合細菌核糖體的30S亞基，干擾16S rRNA的A位點，從而阻斷tRNA進入核糖體A位點，終止氨基酸進入肽鏈，抑制翻譯過程，最終抑制細菌蛋白質(zhì)的合成[28]。研究[29]發(fā)現(xiàn)30S亞基中的S10蛋白由rpsj基因表達，若rpsj基因發(fā)生改變就會使TGC的靶向作用位點缺失，細菌與抗菌藥物的結(jié)合位點發(fā)生改變從而產(chǎn)生耐藥。rpsj基因突變導致的細菌耐藥不同于主動外排泵耐藥機制，具有高度特異性，是多種細菌對替加環(huán)素耐藥的靶點[30]。之后HE F等[31]通過轉(zhuǎn)化互補實驗不僅證實了rpsj基因突變是導致替加環(huán)素耐藥的主要機制，而且為該基因的突變造成CRKP感染患者在使用替加環(huán)素治療期間產(chǎn)生耐藥首次提供直接的體內(nèi)證據(jù)。

3.4 細菌細胞膜變異

細菌細胞膜主要由糖脂、磷脂和蛋白質(zhì)3種物質(zhì)構(gòu)成?？咕镔|(zhì)進入細菌體內(nèi)主要是通過細菌膜上的膜孔蛋白，當膜孔蛋白基因發(fā)生突變時，膜孔蛋白的編碼數(shù)量就會減少或其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細胞的通透性降低，抗菌物質(zhì)因難以進入細菌體內(nèi)發(fā)揮作用從而產(chǎn)生耐藥[32]。但在大多數(shù)情況下，膜孔蛋白變異不會單獨產(chǎn)生耐藥菌株，往往與其他耐藥機制共同發(fā)揮作用。此外，催化磷脂合成的酶PlsC是一種跨膜蛋白，具有滲透作用[33]。PlsC基因突變會使磷脂合成受限，細菌細胞膜的通透性降低，從而使得細菌對抗生素的敏感性減弱產(chǎn)生耐藥[34]。

4 CR-hvKP對替加環(huán)素的耐藥機制

與cKp的高耐藥率相比, hvKp對抗菌藥物的耐藥性相對較低。目前關(guān)于hvKp菌株及其耐藥性的研究相對較少，其流行病學特征及致病性存在許多不確定性。綜合目前相關(guān)研究, CR-hvKP菌株的耐藥機制大致分為以下2類: hvKp菌株獲得性耐藥或其耐藥性通過獲得耐藥質(zhì)粒產(chǎn)生，相關(guān)機制尚未完全明確。有研究表明, AcrB外排泵介導的耐藥在hvKp菌株中也得到了證實。HUANG Y H等[35]研究發(fā)現(xiàn)，hvKp菌株的外排泵基因acrB及其調(diào)控基因ramA過表達，并且由于ISKpn26序列插入AcrB的負調(diào)控基因acrR和ramR中，使得acrR和ramR發(fā)生錯義突變，導致hvKp對替加環(huán)素產(chǎn)生耐藥。

5 小結(jié)與展望

近年來由于細菌對廣譜抗菌藥物耐藥性的增加，曾被作為控制感染最后防線的碳青霉烯類抗生素用藥比例大幅度上升。上述關(guān)于T-CRKP耐藥機制的研究，可以為臨床防治T-CRKP提供一定的參考價值。但是新型抗生素的研發(fā)上市遠遠比不上細菌耐藥性的進展速度，因此抗生素的合理使用非常重要。臨床治療中應根據(jù)藥敏結(jié)果針對不同個體采取不同的用藥措施，做到有針對性的治療，且臨床醫(yī)師和感控人員應強化無菌觀念，盡量減少有創(chuàng)操作，做好全方位的感染防控工作，如加強手衛(wèi)生、定期監(jiān)測耐藥菌感染，并實時上報、做好感染者的隔離防護等，避免院內(nèi)交叉感染的發(fā)生。目前T-CRKP的耐藥機制研究尚未完全明確，需進一步探究，治療上當前可選用的抗生素包括磷霉素、慶大霉素和多黏菌素等，以及新型復合型抗生素如頭孢他啶、阿維巴坦等。相信隨著研究聯(lián)合臨床調(diào)查的深入，會出現(xiàn)更有效的抗生素來應對T-CRKP感染。