刺梨葉提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

劉丹 丁小艷

摘 要：目的：比較不同極性部位提取物抗氧化能力和成分類型，為刺梨葉所含成分進一步研究提供參考方向。方法：通過正交實驗優(yōu)化刺梨葉供試液提取工藝，將提取液分別依次用乙酸乙酯和水飽和正丁醇依次萃取，得到醇層、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層，以DPPH自由基清除率和總抗氧化力為評價指標，比較不同層提取物抗氧化能力。結(jié)果：提取條件最佳組合為料液比1∶30、超聲時間60 min、乙醇濃度60%。正丁醇層提取物的抗氧化能力最強。結(jié)論：刺梨葉中富含多酚黃酮類物質(zhì)，正丁醇層提取物具有更強的抗氧化能力。

關(guān)鍵詞：總黃酮;總多酚;提取工藝;抗氧化活性

Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Active Substance from Rosa Roxburghii Leaves

LIU Dan1， DING Xiaoyan2

（1.Guizhou Institute for Food and Drug Control， Guiyang 550004， China; 2.Guizhou Material Industry Technology Research Institute， Guiyang 550016， China）

Abstract： Objective： The antioxidant capacity and component types of extracts from different polar parts were compared to provide a reference direction for the further study of the components contained in Rosa roxburghii leaves. Method： The extraction process of the test solution from Rosa roxburghii leaves was optimized by orthogonal experiment. The extract was extracted with ethyl acetate and water saturated n-butanol in turn to obtain alcohol layer， ethyl acetate layer， n-butanol layer and water layer. The antioxidant capacity of the extracts from different layers was compared with DPPH free radical scavenging rate and total antioxidant capacity. Result： The best combination of extraction conditions was solid-liquid ratio 1∶30， ultrasonic time 60 min and ethanol concentration 60%. N-butanol extract has the strongest antioxidant ability. Conclusion： Rosa roxburghii leaves are rich in polyphenols and flavonoids， and n-butanol layer extract has stronger antioxidant capacity.

Keywords： total flavonoids; total polyphenols; extraction process; antioxidant activity

實驗中所用刺梨葉，被2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》收錄，是藥食同源植物，在貴州省等地分布較為廣泛，目前在貴州多地有種植基地，為貴州的優(yōu)勢經(jīng)濟作物[1-3]。近年來，刺梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展得到了貴州省委、省政府的高度重視，大力支持相關(guān)的科學研究。

刺梨葉中的成分對自由基有清除作用。刺梨中的多酚類、黃酮類成分，已被研究證明具有很好的抗氧化作用[4-6]。在近年來的研究中發(fā)現(xiàn)刺梨葉有α-葡萄糖苷酶抑制活性，對2型糖尿病大鼠脂代謝也起一定的治療作用[7-11]，這都與刺梨葉的抗氧化機制相關(guān)，說明刺梨葉中的抗氧化活性物質(zhì)值得被深入研究，可制成茶葉等飲品，具有廣闊的食品、保健食品應(yīng)用前景。本實驗優(yōu)化刺梨葉活性成分提取工藝，再比較刺梨葉不同極性部位提取物的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨葉樣品為薔薇科薔薇屬植物繅絲花的干燥葉;Folin-Ciocalteu試劑（F-C試劑，自制）;沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110831-201204）;蘆丁對照品（成都曼斯特生物有限公司，批號MUST-11040302）;水為去離子水;試劑均為分析純。

CARY100-Bio紫外-可見分光光度計（美國瓦里安中國有限公司）;DY-H4-型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）;KQ-500DB超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;ACCULAB型萬分之一電子天平（深圳市郎普電子科技有限公司）;高速中藥粉碎機（上海精宏試驗設(shè)備有限公司）;高效液相色譜儀（美國沃特世中國有限公司）;ALC-210.4電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）;GZX-GFC-101-2-BS型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博泰實驗設(shè)備有限公司）;80-2臺式低速離心機（上海醫(yī)療器械集團有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液制備

（1）提取工藝優(yōu)化供試品溶液制備。刺梨葉干燥后粉碎，過篩，得刺梨葉供試品。稱取適量刺梨葉供試品，加入10倍量的石油醚浸泡達24 h脫色后，過濾，用石油醚洗滌，干燥后稱取1 g樣品于50 mL錐形瓶中，精密稱定，設(shè)置60%乙醇超聲提取，

3 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋后待測。

（2）對照品溶液制備。①蘆丁標準溶液的配制。準確稱取蘆丁對照品116.84 mg置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋并定容至刻度，制得2.29 mg/mL對照品儲備液。精密吸取2.5 mL對照品儲備液于25 mL

容量瓶中，60%乙醇稀釋至刻度，制得229.0 μg/mL蘆丁標準液[12]。②沒食子酸標準溶液配制。精密稱取沒食子酸對照品50.0 mg于50 mL容量瓶中，去離子水溶解定容至50 mL，得質(zhì)量濃度為0.899 mg/mL沒食子酸儲備液。精密吸取該儲備液5 mL于50 mL容量瓶中并用去離子水定容至刻度，制得89.9 μg/mL的沒食子酸標準溶液[13]。

（3）抗氧化活性比較供試液制備。精密稱取1.2.1項下脫色并干燥后的刺梨粉20 g，60%乙醇溶液，料液比1∶10（g∶mL），超聲提取60 min，提取2次，過濾。精密吸取濾液50 mL，為醇層，其他濾液減壓蒸發(fā)回收乙醇，剩余水溶液分別采用極性增大的乙酸乙酯和水飽和正丁醇依次萃取，最后為水相部位。

1.2.2 正交實驗

根據(jù)前期的單因素實驗，各條件最佳點為液料比25∶1，超聲時間30 min，乙醇濃度60%。以各最佳點為中心設(shè)計正交實驗。以目標函數(shù)確定達到總黃酮和總多酚的最佳提取條件，選擇加權(quán)綜合評分法，以總黃酮和總多酚各占50%來確定最佳提取工藝[14]，因素水平見表1。

1.2.3 總抗氧化力和DPPH自由基清除率測定

（1）總抗氧化力測定。精密稱取不同極性部位提取物于25 mL容量瓶中，制成濃度為2.6 mg/mL的樣品液，將樣品液稀釋10倍，則制得待測液。分別加入待測液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL和4.5 mL于10 mL具塞試管中（空白不加樣液，以同體積超純水代替），加超純水至體積為1.5 mL，加入0.6 mol/L的H2SO4溶液1 mL，28 mmol/L的Na3PO4溶液1.5 mL，4 mmol/L的鉬酸銨溶液1.5 mL，再加超純水至總體積為10 mL，搖勻后置于95 ℃恒溫水浴中1.5 h，取出，冷至室溫，在695 nm波長處測定吸光度。每個樣品平行3次實驗。

（2）DPPH自由基清除率測定。將上述總抗氧化力測定中制成的樣品液稀釋100倍則制得待測液，分別取0.7 mL、1.0 mL、1.3 mL、1.6 mL、1.9 mL和2.2 mL待測液，加超純水至4 mL，再加0.25 mmol/L的DPPH乙醇溶液2 mL，置暗箱中反應(yīng)30 min，于517 nm處測定吸光度。對照不加供試液。每個樣品平行3次實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實驗優(yōu)化

由表2可知，極差分析結(jié)果顯示，提取條件中對測定結(jié)果影響程度由大到小的順序為乙醇濃度、料液比、超聲時間;由k值得，最優(yōu)組合為A1B3C2，得分為664.20分，低于正交實驗表中的最佳組合A3B3C2（684.89分）。因此當料液比1∶30、超聲時間60 min，乙醇濃度60%時，綜合評分最高，提取工藝最佳。

2.2 刺梨葉不同極性部位抗氧化力比較

由表3可知，刺梨葉不同部位的抗氧化能力大小均為水飽和正丁醇層>乙酸乙酯層>醇層>水層。

3 結(jié)論

刺梨葉的藥理活性與其抗氧化機制有關(guān)，可開發(fā)相關(guān)的保健食品。實驗前期研究中發(fā)現(xiàn)刺梨葉有很高的抗氧化活性，對刺梨葉的各個極性部位提取物的抗氧化活性進行對比，發(fā)現(xiàn)刺梨葉中起抗氧化作用的物質(zhì)主要在正丁醇層，其次乙酸乙酯層，研究結(jié)果表明有必要對抗氧化能力強的極性部位進行深入研究。

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