PRRSV-2 NSP7 間接ELISA 檢測方法的建立

趙孟孟，沙惠陽，張 航，黃良宗

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528225）

豬繁殖與呼吸綜合征（俗稱“藍(lán)耳病”）于1975 年首次報道，隨后世界流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-3］。我國于1995 年首次報道［4］，2006 年爆發(fā)了以高致病性豬繁殖與呼吸綜合征毒HPPRRSV 為主要病原的“高熱癥”。PRRSV 持續(xù)變異重組，近年來出現(xiàn)NADC-30 新型變異毒株，PRRSV存在ADE 效應(yīng)［5］，入侵宿主之后在體內(nèi)長時間存在，一直無有效疫苗藥物。

PRRSV 基因組15 kb，屬于套式病毒目（Nidovirales）、動脈炎病毒屬（Arterivirus）。同屬包括馬動脈炎病毒（EAV）、鼠乳酸脫氫酶病毒（LDV）、猴出血熱病毒（SHFV）［6-7］。該病毒基因組包含10 個開放閱讀框（ORF）、ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7、ORF2b、ORF5a［8-11］。ORF1 編碼復(fù)制酶進(jìn)一步水解為16 個非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1 α、NSP1 β、NSP2-6、NSP2N、NSP2TF、NSP7 α、NSP7 β、NSP8-12）。PRRSV 根據(jù)抗原差異分為PRRSV-1 和PRRSV-2 兩種類型，我國主要流行PRRSV-2。

PRRSV NSP7 在不同毒株間高度保守，免疫原性好［11］，目前愛德士商品化PRRSV 抗體檢測針對PRRSV N 蛋白，該方法不能完全反映其他蛋白抗體效價，存在假陽性問題。本文針對NSP7 建立檢測方法，為進(jìn)一步準(zhǔn)確診斷和評估免疫效果奠定基礎(chǔ)。

1 材料

病毒PRRSV-2 XH-GD 株本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌DH5α、BL21、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、Ex Taq、Hind III、BamH I 購自Takara 公司；蛋白純化Ni 柱購自GE Healthcare 公司；TMB、HRP 標(biāo)記山羊抗豬IgG（H+L）、HRP-鼠抗豬IgG（H+L）、Western blot 發(fā)光液購自北京索萊寶生物科技有限公司。

2 方法

2.1 載體構(gòu)建

以PRRSV XH-GD 全病毒cDNA 為模板，以NSP7-F 和NSP7-R 為引物，Ex Taq 酶擴(kuò)增目的蛋白，凝膠純化酶切連接pET-28a（+）載體。其中，引物5＇端為BamH I 酶切位點(diǎn)，3＇端 為Hind III 酶切位點(diǎn)，引物由廣州天一輝遠(yuǎn)公司生物科技有限公司合成。上游引物序列：5＇-CGCGGATCCTCGCTGACTGG TGCCCTCG-3＇，下游引物序列：5＇-CCGAAGCTTTTCCCACTGAG CTCTTCTATTCTCG-3＇。

2.2 蛋白表達(dá)與純化

2.2.1 時間梯度分析

將pET-28a-NSP7 轉(zhuǎn)入BL21 表達(dá)菌，16 h 之后挑選目的菌落到含有卡那霉素的液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至OD450值0.4～0.6，加1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)，每小時取1 mL 表達(dá)菌，表達(dá)菌進(jìn)行SDS-PAGE 表達(dá)量分析。

2.2.2 可溶性分析

誘導(dǎo)表達(dá)100 mL 陽性菌，以1.0 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)4 h，4 ℃12 000 r/min 離心15 min。加入5 mL Binding Buffer 重懸菌體，冰浴超聲裂解至懸濁液透亮（200 W，工作3 s/次，5 s 間隔）。完畢后4 ℃12 000 r/min 離心15 min，分離超聲產(chǎn)物沉淀和上清，5 mL Binding Buffer 重懸沉淀。上清液和沉淀分別在沸水中加熱15 min，之后進(jìn)行SDS-PAGE 表達(dá)量分析。

2.2.3 表達(dá)蛋白純化

蛋白純化步驟參考GE Healthcare 公司Ni Sepharose 6 Fast Flow 使用說明書。

2.3 表達(dá)蛋白Western blot 驗(yàn)證

Western blot 參照文獻(xiàn)［12］步驟，一抗為豬的陽性血清（本實(shí)驗(yàn)室保存），二抗HRP 標(biāo)記1:10 000山羊抗豬IgG（H+L），ECL 化學(xué)發(fā)光顯影。

2.4 間接ELISA 的建立

2.4.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定

將重組純化NSP7 抗原通過0.05 M 碳酸鹽緩沖液配置不同濃度（10 μg/mL 至0.125 μg/mL），4 ℃包被酶標(biāo)板16 h，每孔100 μL。加入5%脫脂乳封閉液，200 μL/孔，37 ℃孵育2 h。按1:10 開始倍比血清，每孔100 μL。置37 ℃作用1 h 開展ELISA 方陣實(shí)驗(yàn)。將1:2 000 稀釋后酶標(biāo)二抗加入反應(yīng)板，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。TMD 底物加入反應(yīng)板，每孔50 μL，置37 ℃作用1 h，在每孔加入50 μL 2 mol/L終止液終止反應(yīng)。測定OD450值，計算得到最優(yōu)包被濃度與血清稀釋度。

2.4.2 工作條件的優(yōu)化

根據(jù)上面結(jié)果包被酶標(biāo)板配制不同封閉液：1% BSA（Bovine Serum Albumin）、0.1% BSA、5%脫脂奶粉、馬血清。固定其他條件，一抗孵育時間設(shè)定0.5 h、1 h、1.5 h、2 h 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定一抗最佳作用時間。HRP-鼠抗豬IgG（H+L）以1：500，1：1 000，1：2 000，1：4 000 稀釋，二抗孵育時間為30 min、60 min、90 min、120 min，測定二抗最優(yōu)反應(yīng)條件。顯色時間分別為5 min、7.5 min、10 min、12.5 min、15 min，確定最佳顯色時間。

2.4.3 陰陽性臨界值確定與靈敏度、特異度分析

用本方法檢測100 份（60 份陽性血清與40 份陰性血清）已知背景血清樣品。測試換算成S/P 值，優(yōu)化臨界值（Cut off value）與靈敏度、特異度。規(guī)定S/P 值≥Cut off value 為陽性，S/P 值＜Cut off value 為陰性。Cut off value=（樣品OD450-陰性對照OD450）/（陽性對照OD450-陰性對照OD450）。

2.4.4 特異性試驗(yàn)

用本方法檢測背景明確的豬瘟病毒、口蹄疫病毒、偽狂犬病毒、圓環(huán)病毒等常見豬病血清，分析特異性。

2.4.5 敏感性試驗(yàn)

挑選5 份抗體效價不同陽性血清樣品，參考1:100～1:6 400 進(jìn)行稀釋，檢測稀釋后OD450值，換算為S/P 值檢測敏感性。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn)

針對批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，選取8 份抗體水平不同的豬血清分別進(jìn)行測試，每份豬血清測定8 次，之后計算分析。批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)通過4 個不同的時間點(diǎn)制備酶標(biāo)版，分別測定8 份樣品記錄檢測結(jié)果，開展數(shù)據(jù)分析。

2.4.7 臨床血清樣品比較

臨床采集113 份未知血清，用本方法與IDEXX 試劑盒同時測定并比較差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定結(jié)果

以PRRSV-2 XH-GD 株cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，在770 bp 處有擴(kuò)增片段，如圖1 所示。

圖1 NSP7 片段PCR 擴(kuò)增結(jié)果

將重組質(zhì)粒pET-28a-NSP7 進(jìn)行PCR 鑒定，可見大小770 bp 片段，如圖2 所示，表明重組質(zhì)粒pET-28a-NSP7 構(gòu)建成功。

圖2 質(zhì)粒PCR 鑒定結(jié)果

3.2 NSP7 誘導(dǎo)結(jié)果

通過SDS-PAGE 電泳分析，在36 kD 處出現(xiàn)蛋白條帶，與預(yù)期大小一致，5 h 達(dá)到最高，如圖3 所示。

圖3 NSP7 誘導(dǎo)時間結(jié)果

細(xì)菌被誘導(dǎo)表達(dá)后超聲裂解，結(jié)果表明NSP7 主要存在于上清中，如圖4 所示。

圖4 NSP7 的可溶性結(jié)果

3.3 Western blot 鑒定結(jié)果

將NSP7 蛋白轉(zhuǎn)膜并鑒定，表明重組蛋白可被陽性血清識別，如圖5 所示。

圖5 NSP7 蛋白Western blot 結(jié)果

3.4 間接ELISA 條件優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)方陣滴定實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)分析確定最佳蛋白包被濃度2 μg/mL，最佳一抗稀釋度1:80，最佳封閉液5%脫脂乳，最佳封閉條件37 ℃封閉2 h，最適酶標(biāo)二抗稀釋濃度1:2 000，二抗工作時間37 ℃作用2 h，顯色時間7.5 min。

3.5 臨界值確定與靈敏度、特異度分析

將背景明確血清進(jìn)行分析，結(jié)果表明臨界值為0.11，靈敏度為99.1%，特異度為100%。

3.6 特異性試驗(yàn)結(jié)果

對豬瘟病毒、口蹄疫病毒、偽狂犬病毒、圓環(huán)病毒進(jìn)行檢測，結(jié)果表明所檢測全部陽性血清抗體OD450均小于臨界值，說明本方法特異性良好。

3.7 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

將標(biāo)準(zhǔn)血清和不同抗體水平血清進(jìn)行1:800 倍稀釋，檢測結(jié)果仍為陽性，表明本方法敏感性良好。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明批內(nèi)系數(shù)小于5%，批間變異系數(shù)小于9%，表明本方法重復(fù)性良好。

3.9 與IDEXX 試劑盒分析結(jié)果

采集113 份豬血清，分別用本ELISA 方法和IDEXX 公司生產(chǎn)PRRSV ELISA 試劑盒檢測，比較兩者符合率，結(jié)果表明，本方法檢出102 份陽性，IDEXX 試劑盒檢出106 份陽性，95 份為雙陽性，雙陰性為7 份，符合率為96.2%。

4 討論

PRRSV-2 對我國養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，建立有效準(zhǔn)確的檢測方法對于及早發(fā)現(xiàn)和診治該疾病具有重要意義。ELISA 方法因其準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)而在獸醫(yī)臨床廣泛應(yīng)用［13-14］。

NSP7 在PRRSV 復(fù)制與免疫調(diào)控方面起著關(guān)鍵作用。研究表明，PRRSV 感染202 天，NSP1、NSP2、NSP7 保持高抗體水平表達(dá)，高于N 蛋白抗體水平［15］。NSP7 下調(diào)干擾素調(diào)節(jié)因子7，抑制下游干擾素刺激基因表達(dá)，逃逸抗病毒反應(yīng)［16］。噬菌體展示方法在NSP7 鑒定出多個表位［17］。NSP7 與NSP9 互做［18-19］，NSP7 第153～162 位氨基酸存在線性表位NAWGDEDRLN［20］。NSP7 在不同毒株間高度保守，適于做血清學(xué)靶標(biāo)，已建立免疫層析試紙［21］。

NSP7 抗體只在病毒復(fù)制過程出現(xiàn)，滅活疫苗產(chǎn)生針對N 蛋白抗體而不產(chǎn)生NSP7 抗體，弱毒疫苗或者野毒感染才產(chǎn)生包括NSP7 在內(nèi)非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，以此區(qū)分滅活苗免疫和弱毒苗免疫。本研究基于此建立抗體檢測方法，實(shí)驗(yàn)效果良好，NSP7 可被豬陽性血清識別，可用于臨床檢測PRRSV 抗體。以NSP7 為抗原建立ELISA 有以下優(yōu)點(diǎn)：1）NSP7 蛋白可溶，有助于大規(guī)模建立診斷體系；2）NSP7 蛋白保守性較高，突變少；3）該蛋白感染過程可保持較長時間，且NSP7 抗體出現(xiàn)早，后期NSP7 抗體高于N 蛋白，靈敏度和特異度成為它的優(yōu)點(diǎn)，有助于減少N 蛋白的假陽性結(jié)果。

本研究建立ELISA 診斷方法與商品化檢測試劑盒符合率高、特異性好、重復(fù)性好，可用于檢測NSP7 抗體效價。PRRSV NSP7 可溶性較好，方法建立成功。