外泌體在皰疹病毒潛伏中的作用及研究進(jìn)展

陳彥廷，鄭從森，楊亞慧，陳玫婷，覃麗梅

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528225）

皰疹病毒是具有囊膜的線狀雙鏈DNA 病毒，因代表病毒即單純皰疹病毒能引起皰疹而得名。皰疹病毒顆粒是直徑為150 nm、由162 個(gè)殼粒排列組成的二十面體［1］，囊膜上有糖蛋白組成的纖突。皰疹病毒主要侵害皮膚、黏膜以及神經(jīng)組織等，可引起哺乳類、鳥類、爬行類、兩棲類、昆蟲以及軟體動(dòng)物的疾病，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞增生及其他病理變化。

根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和同源性等特征將皰疹病毒分為α、β、γ 三個(gè)亞科。α 皰疹病毒亞科內(nèi)含單純皰疹病毒1 型（Herpes simplex virus 1，HSV-1）、馬立克氏病毒（Marek’s disease，MDV）、雞傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）、偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）等，這類病毒增殖速度快并引起細(xì)胞病變；β 皰疹病毒亞科內(nèi)含巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）、人皰疹病毒6 型（Herpesviruses 6，HHV-6）等，被這類病毒感染的細(xì)胞形成巨細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)；γ 皰疹病毒亞科內(nèi)含EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）和卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposi sarcoma-associated Herpesviruses，KSHV）等，被這類病毒感染的淋巴樣細(xì)胞可導(dǎo)致淋巴增生等病理變化［2］。

潛伏感染是皰疹病毒的重要特點(diǎn)，皰疹病毒在潛伏期間能逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別，同時(shí)將病毒基因組整合到宿主細(xì)胞DNA 中，使病毒進(jìn)入潛伏感染狀態(tài)。此時(shí)，病毒蛋白表達(dá)量很少甚至沒有，然而當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，病毒可再次激活并快速增殖［3］。不同種類的皰疹病毒在潛伏感染時(shí)選擇的部位有所不同，包括感覺神經(jīng)節(jié)、角膜、淋巴細(xì)胞等。

1 外泌體的結(jié)構(gòu)與功能

外泌體是一類由細(xì)胞分泌至體液中的磷脂納米囊泡，直徑介于30 nm～150 nm 之間，大多數(shù)不同類型的細(xì)胞在生理和病理?xiàng)l件下均可分泌外泌體。1983 年外泌體首次被報(bào)道，起初被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)一種“垃圾車”的機(jī)制用于清除細(xì)胞不必要的蛋白質(zhì)［4］。然而隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)外泌體是細(xì)胞間信號(hào)傳遞的重要載體，能將宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、miRNA 和ncRNA 等活性成分轉(zhuǎn)移至相鄰或遠(yuǎn)端細(xì)胞，同時(shí)參與機(jī)體的免疫應(yīng)答、血管生成、細(xì)胞增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移等生理和病理過程［5］。目前發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞可分泌外泌體，如腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等。

由于外泌體是從細(xì)胞中釋放出來的囊泡，可能被病毒“挾持”，進(jìn)行細(xì)胞間的病毒物質(zhì)的交換。近些年來，研究發(fā)現(xiàn)外泌體在皰疹病毒的潛伏感染中發(fā)揮作用，同時(shí)被病毒潛伏感染的細(xì)胞分泌的外泌體具有控制受體細(xì)胞中基因表達(dá)和影響細(xì)胞活力的能力。還有許多皰疹病毒已進(jìn)化到能夠?qū)⒉《窘M分包裹至外泌體中，通過外泌體的整合和釋放，觸發(fā)下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，如圖1 所示。

圖1 外泌體和靶細(xì)胞之間的物質(zhì)交流

2 外泌體在皰疹病毒潛伏感染中的作用

2.1 外泌體影響EBV 的潛伏

EB 病毒（Epstein-Barr Virus，EBV）感染機(jī)體時(shí)首先攻擊上皮細(xì)胞和B 細(xì)胞，同時(shí)在B 細(xì)胞中發(fā)生潛伏感染，以逃避宿主的免疫損傷。同時(shí)，這些潛伏感染的病毒在機(jī)體免疫力低下時(shí)可被再激活并增殖，從而引起相應(yīng)的疾病。不同的潛伏感染模式對(duì)不同類型的淋巴系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生有所影響，但不論是哪種潛伏感染模式，均可通過改變宿主細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或組成性活化宿主細(xì)胞關(guān)鍵信號(hào)通路，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。在EBV 感染的機(jī)體中，外泌體主要是通過整合或攜帶病毒編碼產(chǎn)物及宿主細(xì)胞內(nèi)的功能性物質(zhì)，如病毒蛋白、mRNA 和miRNA 等，隨后將其遞送給未感染細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用。EBV 在裂解復(fù)制期間，感染細(xì)胞中病毒DNA 大量復(fù)制，并通過外泌體釋放到細(xì)胞外感染其他細(xì)胞。此外，EBV 感染的細(xì)胞分泌的外泌體中含有潛伏膜蛋白2A（Latent membrane protein-2A，LMP2A），該蛋白可模擬B細(xì)胞受體（BCR）觸發(fā)的信號(hào)，改變正常B 細(xì)胞的發(fā)育，可見病毒感染細(xì)胞分泌的外泌體在病毒潛伏期中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用［6］。

外泌體可能還會(huì)影響與EB 病毒相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展，載有EBV 編碼產(chǎn)物的外泌體被未感染細(xì)胞內(nèi)化后，多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路被激活，進(jìn)而操控細(xì)胞的增殖和凋亡，影響細(xì)胞的微環(huán)境，從而參與EBV相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制。Keryer-Bibens 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，EBV 相關(guān)NPC 細(xì)胞分泌的外泌體中包含EBV 潛伏膜蛋白1（Latent membrane protein-1，LMP-1）和半乳糖凝集素9（Galectin-9），能夠抑制T 細(xì)胞活化和增殖，導(dǎo)致EBV 相關(guān)腫瘤的發(fā)生。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，用含有LMP-1 的外泌體處理EBV 陰性細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力［8］。

2.2 外泌體影響HSV 的潛伏

單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus，HSV）具有神經(jīng)細(xì)胞嗜性，一旦HSV 感染神經(jīng)末梢，病毒就能在神經(jīng)節(jié)內(nèi)將病毒核衣殼通過逆轉(zhuǎn)運(yùn)的方式從軸突運(yùn)送到神經(jīng)細(xì)胞以外的地方。HSV 感染3 周后，病毒的復(fù)制活性將會(huì)顯著減弱，此階段被稱為潛伏感染，此時(shí)宿主不會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀；然而當(dāng)潛伏狀態(tài)被打破，如紫外線照射、精神狀態(tài)及壓力、激素水平變化、免疫抑制劑的使用、免疫缺陷病毒感染等［9］，HSV-1 病毒將從潛伏狀態(tài)進(jìn)入重激活狀態(tài)。此時(shí)，病毒開始表達(dá)具有功能的病毒蛋白，在神經(jīng)細(xì)胞中組裝成具有感染性的病毒顆粒，并沿著軸突方向運(yùn)輸?shù)礁腥静课徊⒋罅繌?fù)制，從而導(dǎo)致HSV-1 病毒再激活［10］。研究發(fā)現(xiàn)，病毒可利用神經(jīng)元獨(dú)特的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)建立潛伏感染的物質(zhì)基礎(chǔ)，外泌體可以將HSV-1 編碼的糖蛋白B（gB）或gB/ MHC-II 類分子復(fù)合物從HSV-1 感染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞，使受體細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)病毒的免疫反應(yīng)［11］，進(jìn)而使得神經(jīng)元成為HSV 的存儲(chǔ)庫(kù)。

當(dāng)HSV-1 開始進(jìn)入潛伏階段，病毒抗原特異性CD8+T 細(xì)胞在受感染的神經(jīng)組織中浸潤(rùn)，并將攜帶有病毒DNA 的神經(jīng)元細(xì)胞包圍住，這些浸潤(rùn)神經(jīng)組織的CD8+T 細(xì)胞具有抑制HSV-1 從神經(jīng)細(xì)胞中再激活的功能［12］。然而，在潛伏感染過程中，HSV-1 所表達(dá)的潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（Latency Associated Transcript，LAT）直接或間接地導(dǎo)致了三叉神經(jīng)組織中CD8+T 的功能衰竭，從而促進(jìn)病毒的再激活［13］。LAT 不但可以抑制細(xì)胞內(nèi)HSV-1 裂解靶細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，阻止免疫反應(yīng)導(dǎo)致的宿主細(xì)胞死亡，促進(jìn)HSV-1 建立潛伏感染，還能通過抑制細(xì)胞凋亡，使被病毒感染的細(xì)胞免于被機(jī)體清除，從而達(dá)到維持潛伏感染細(xì)胞存活的目的［14］。外泌體作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞的重要載體，可將宿主細(xì)胞中的活性成分運(yùn)送給其他細(xì)胞，比如HSV-1 感染的細(xì)胞分泌的外泌體可將HSV 潛伏期高表達(dá)的LAT 傳遞給其他細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)或維持HSV 的潛伏感染。

此外，人胚胎肺成纖維細(xì)胞（HELF）中的IFI-16 存在于細(xì)胞核中，可控制病毒DNA 復(fù)制；用siRNA沉默后會(huì)增強(qiáng)HSV-1、HSV-2 和HCMV 的復(fù)制，推測(cè)IFI16 可能是皰疹病毒復(fù)制周期中的一種新的限制性因子，可被分泌到外泌體中調(diào)控病毒潛伏［15］。

2.3 外泌體影響KSHV 的潛伏

卡波西肉瘤皰疹病毒（Kaposi’s Sarcoma associated Herpes Virus，KSHV）主要感染上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，一般在感染宿主細(xì)胞后24～48 h 進(jìn)入潛伏期。在潛伏期間，KSHV 絕大多數(shù)病毒基因也是停止表達(dá)，只表達(dá)如ORF73/LANA、ORF72/v-Cyclin、ORF71/v-FLIP 等潛伏期相關(guān)基因，而且不釋放病毒顆粒［16］。研究發(fā)現(xiàn)，KSHV 至少編碼11 種過去未發(fā)現(xiàn)并在KSHV 潛伏感染的細(xì)胞中表達(dá)的miRNA，這些miRNA 序列在KSHV 感染的細(xì)胞中的表達(dá)情況表明，miRNA 介導(dǎo)的RNA 干擾導(dǎo)致宿主細(xì)胞mRNA 表達(dá)下調(diào)可能是建立或維持KSHV 潛伏感染的關(guān)鍵步驟［17］。有報(bào)道表明，KSHV 能將某些特定的病毒和細(xì)胞成分分泌到外泌體中，被感染的細(xì)胞分泌的外泌體優(yōu)先結(jié)合那些參與代謝、翻譯和細(xì)胞遷移的蛋白質(zhì)，這些外泌體蛋白可能參與旁分泌或自分泌過程，攜帶有病毒的遺傳物質(zhì)的外泌體由此可操縱腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，KSHV 感染的細(xì)胞分泌的外泌體包含有參與重塑上皮粘附連接的蛋白質(zhì)，表明外泌體可能調(diào)節(jié)細(xì)胞的錨定或運(yùn)動(dòng)，有助于維持病毒潛伏感染。潛伏感染時(shí)，KSHV 病毒基因的少量表達(dá)限制了免疫系統(tǒng)檢測(cè)到的抗原表位數(shù)量，從而逃避宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答，使病毒得以存活。還有研究表明，潛伏感染的細(xì)胞可能在所有KSHV 誘導(dǎo)的腫瘤中起著關(guān)鍵作用。

2.4 外泌體影響MDV 的潛伏

馬立克氏病病毒（Marek’s Disease Virus，MDV）在易感雞中的致病過程分為四個(gè)階段：早期溶細(xì)胞感染階段、潛伏感染階段、晚期溶細(xì)胞感染階段、增殖階段。病毒感染后約6 天進(jìn)入MDV 潛伏階段，此時(shí)病毒復(fù)制停止，雞群臨床癥狀消失，淋巴組織內(nèi)表達(dá)的MDV 抗原消失，也檢測(cè)不到病毒抗原和腫瘤抗原的表達(dá)。MDV 潛伏感染主要與CD4+T 細(xì)胞有關(guān)，在MDV 潛伏感染期間，活化的CD4+T 細(xì)胞成為MDV 基因組的儲(chǔ)存庫(kù)，同時(shí)被MDV 感染的T 細(xì)胞最終會(huì)發(fā)展成為淋巴瘤細(xì)胞，因此T 細(xì)胞在MDV感染和致病過程中發(fā)揮重要作用，即在MDV 潛伏感染期，病毒基因組可能通過外泌體整合到靜息狀態(tài)下的CD4+T 淋巴細(xì)胞中逃逸宿主的免疫監(jiān)視。

MDV 感染的外泌體中發(fā)現(xiàn)含有MDV 的糖蛋白gB、被膜蛋白VP22 及特異性磷蛋白pp38 等［18］。其中，pp38 是MDV 編碼的立即早期（Immediately early）蛋白，主要是在B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞中存在，并能與pp24 結(jié)合形成異物二聚體發(fā)揮生物活性，而pp38/pp24 二聚體中1.8 kb mRNA 之間的雙向啟動(dòng)子參與病毒潛伏，同時(shí)發(fā)現(xiàn)1.8 kb 轉(zhuǎn)錄本家族與MDV 潛伏的誘導(dǎo)和維持有關(guān)［19］。

某些宿主細(xì)胞因子如IL-6、IL-18、IFNγ 和NO 能促進(jìn)病毒潛伏的建立和維持。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞的激活導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)IFNγ 水平增加，進(jìn)而可以刺激NO 的產(chǎn)生，而巨噬細(xì)胞源性的NO 對(duì)T 細(xì)胞有絲分裂反應(yīng)起抑制作用［20］。在MDV 潛伏感染過程中，NO 通過限制T 細(xì)胞活化、增殖和減少活化T 細(xì)胞的供應(yīng)來降低病毒感染細(xì)胞的水平。同時(shí)，MDV 在潛伏感染期間可誘導(dǎo)一氧化氮合酶（inducible NO synthase，iNOS）的產(chǎn)生，而iNOS 的存在有利于MDV 潛伏感染的建立和維持；iNOS 抑制劑處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)病毒載量顯著增加［21］。外泌體作為細(xì)胞間的傳遞載體，可能會(huì)將這些細(xì)胞因子運(yùn)送到其他宿主細(xì)胞，在MDV 潛伏感染的維持和建立中起到一定的作用。

2.5 皰疹病毒影響外泌體的分泌和功能

不同的皰疹病毒對(duì)外泌體的分泌也有一定程度的影響。致癌性皰疹病毒（如EBV 和KSHV）感染可能會(huì)調(diào)節(jié)受感染細(xì)胞外泌體的含量和功能，進(jìn)而創(chuàng)造有助于癌癥的發(fā)展微環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，潛伏的皰疹病毒可顯著改變外泌體的內(nèi)容物，如在感染EBV 和KSHV 外泌體中均鑒定出230 種蛋白質(zhì)是未感染細(xì)胞分泌的外泌體中沒有的，其中93 種蛋白質(zhì)對(duì)EBV 感染的外泌體具有特異性，而22 種對(duì)KSHV 外泌體具有特異性［22］。同時(shí)，在雙重感染的細(xì)胞中還存在其他16 種不同的蛋白質(zhì)，而在未感染的對(duì)照細(xì)胞中則沒有檢測(cè)到這些蛋白質(zhì)，說明外泌體內(nèi)容物的差異可能是不同種病毒感染特有的［23］。

研究發(fā)現(xiàn)，在EBV 感染的機(jī)體內(nèi)，表達(dá)LMP1 的上皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可以被成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞吸收；含LMP1 的外泌體的另一個(gè)特性是它們與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的潛在結(jié)合增強(qiáng)，同時(shí)LMP1 影響參與粘附和細(xì)胞通訊的多種細(xì)胞蛋白的表達(dá)，并對(duì)外泌體的成分和功能有所影響［24］。LMP1 以及其他病毒蛋白可能對(duì)外泌體的成分和功能產(chǎn)生有效影響,機(jī)體在病毒潛伏和慢性感染時(shí)，外泌體參與維持病毒感染的持久性［25］。

3 討論

皰疹病毒可以感染多種物種，不但會(huì)威脅人體的生命健康，還會(huì)危害到畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。病毒潛伏與病毒感染的持續(xù)性以及再感染的發(fā)生密切相關(guān)，探究外泌體在皰疹病毒潛伏期中的作用，或許有助于深入了解病毒的致病機(jī)制。目前可知，外泌體在皰疹病毒的感染和傳播中發(fā)揮重要的作用。病毒感染細(xì)胞后，病毒DNA 大量復(fù)制合成，在部分皰疹病毒潛伏期間通過外泌體能將病毒的遺傳物質(zhì)傳遞至未感染細(xì)胞，逃避機(jī)體的免疫應(yīng)答，并維持病毒的潛伏。同時(shí)，不同的皰疹病毒也會(huì)對(duì)外泌體的分泌和功能有影響，以增強(qiáng)病毒自身的潛伏性和持久性。目前對(duì)皰疹病毒的研究主要集中在人型皰疹病毒，對(duì)其他種屬皰疹病毒研究不足，本文對(duì)外泌體在部分皰疹病毒中的作用進(jìn)行整理和總結(jié)，可為深入研究外泌體在其他皰疹病毒潛伏感染中的作用提供參考。