添加劑對紫花苜蓿青貯品質(zhì)及小腸可吸收氨基酸的影響

張海鉉，霍文婕，陳 雷，劉 強(qiáng)，張拴林，王 聰，許慶方，郭 剛

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

紫花苜蓿蛋白質(zhì)含量高，是反芻動物的優(yōu)質(zhì)粗飼料。青貯是紫花苜蓿主要的加工貯藏手段之一，但紫花苜蓿緩沖能值高，可溶性碳水化合物含量低，青貯難以成功[1]。補(bǔ)充添加劑是解決紫花苜蓿青貯問題的有效手段。近年來，乳酸菌添加劑已經(jīng)在苜蓿青貯生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，可提高青貯發(fā)酵品質(zhì)[2]。并且同型發(fā)酵乳酸菌的青貯效果優(yōu)于異型發(fā)酵乳酸菌，這是由于同型發(fā)酵以產(chǎn)生乳酸為主，可迅速降低pH值，抑制不良微生物的生長，提高青貯營養(yǎng)價值[3]。添加乳酸菌還可以減少青貯過程中蛋白質(zhì)和氨基酸的分解，進(jìn)而減少氨態(tài)氮(Ammonia nitrogen，NH3-N)的生成，降低干物質(zhì)(Dry matter，DM)損失[4-5]。

單寧是一種植物次級代謝產(chǎn)物，多酚羥基化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)使其具有較強(qiáng)的抑菌和抗病毒作用。添加單寧可以提高青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，Ka-malak等[6]發(fā)現(xiàn)添加橡木縮合丹寧能夠降低苜蓿青貯中乙酸、丁酸濃度，提高乳酸和丙酸濃度，改善苜蓿青貯的發(fā)酵品質(zhì)。李成云等[7]發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿青貯中添加榛子(Hazelnut)葉縮合單寧迅速降低青貯pH值，增加青貯乳酸含量，減少發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)損失，提高青貯發(fā)酵的品質(zhì)。單寧還具有與蛋白質(zhì)結(jié)合，減少蛋白質(zhì)分解的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在瘤胃pH值為5～7時，單寧可以降低瘤胃蛋白表面活性，從而保護(hù)蛋白質(zhì)在瘤胃中不易被降解[8]，增加機(jī)體氮的利用效率[9]。另外，在青貯過程中，單寧與乳酸菌組合添加具有一定的協(xié)同作用[10]，從而為單寧在動物飼草料加工中的應(yīng)用提供了新的研究思路。

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本單位，若日糧中氨基酸組成符合動物營養(yǎng)需要，則可顯著提高動物生長效率、減少廢物排出，對環(huán)境保護(hù)具有重要意義，但由于日糧組成變化較大以及瘤胃微生物的作用，使得目前還無法準(zhǔn)確評估反芻動物氨基酸的營養(yǎng)需要及生物學(xué)價值[11]。幼齡反芻動物的消化系統(tǒng)類似于單胃動物，瘤胃功能尚未健全，所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸必須從日糧中獲得，因而氨基酸組成及供給十分重要。紫花苜蓿蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類齊全[12]，可為反芻動物提供必需氨基酸。紫花苜蓿青貯中使用添加劑可抑制蛋白質(zhì)降解，提高發(fā)酵品質(zhì)，為動物機(jī)體提供更為豐富的氨基酸。郭旭升等[13]研究發(fā)現(xiàn)添加甲酸可以有效抑制紫花苜蓿青貯中蛋白質(zhì)的降解，提高總氨基酸含量。

目前，關(guān)于乳酸菌和單寧作為青貯添加劑的研究，主要集中在降低苜蓿青貯飼料干物質(zhì)和蛋白質(zhì)損失，以及粗蛋白質(zhì)構(gòu)成方面，對于青貯飼料中的氨基酸組分變化及小腸可吸收氨基酸含量的影響研究較少。苜蓿青貯已經(jīng)成為奶牛日糧的重要組成部分，氨基酸平衡，特別是必需氨基酸的供給對于奶牛生產(chǎn)性能的提升至關(guān)重要。為此，本試驗(yàn)通過紫花苜蓿青貯添加縮合單寧(葡萄籽單寧)和復(fù)合乳酸菌，研究添加劑對紫花苜蓿青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)、營養(yǎng)價值及小腸可吸收氨基酸組成的影響，以期為紫花苜蓿青貯生產(chǎn)中添加劑的應(yīng)用和反芻動物氨基酸營養(yǎng)理論提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)四個處理組：對照組(CK)；復(fù)合乳酸菌組(戊糖乳桿菌+戊糖片球菌+乳酸片球菌，1∶1∶1，L)；葡萄籽單寧組(G)；復(fù)合乳酸菌+單寧酸組(LG)。葡萄籽單寧購置于潤澤生物科技有限公司，純度97%；戊糖乳桿菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌為實(shí)驗(yàn)室自有菌株。處理組復(fù)合乳酸菌的添加量為106cfu·g-1鮮重(Fresh weight，F(xiàn)W)，葡萄籽單寧添加量為3%干物質(zhì)(Dry matter，DM)。葡萄籽單寧添加量參考Tabacco等[8]報(bào)道紫花苜蓿青貯中單寧添加量。同時，三種乳酸菌均能耐受此單寧濃度。

1.2 青貯制作

紫花苜蓿(品種‘SR 4030’)種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院試驗(yàn)站(112°35′25″E，37°25′08″N，海拔783 m)，于第二茬現(xiàn)蕾期刈割，留茬高度為5 cm，田間凋萎4.5 h至干物質(zhì)含量在350 g·kg-1FW左右，用鍘刀切碎至2 cm左右，并進(jìn)行徹底混勻，取樣分析其化學(xué)組分、微生物數(shù)量和氨基酸組分(表1)。試驗(yàn)添加所用乳酸菌，于試驗(yàn)前一天經(jīng)分別活化后，置于恒溫?fù)u床上厭氧培養(yǎng)36 h，測定乳酸菌數(shù)量，按照菌落數(shù)量1∶1∶1混合，復(fù)合乳酸菌添加量達(dá)到106cfu·g-1FW；葡萄籽單寧添加量為3% DM，將其用蒸餾后溶解后均勻噴灑至紫花苜蓿；LG組兩種添加劑按等體積進(jìn)行添加，復(fù)合乳酸菌添加量為106cfu·g-1FW，葡萄籽單寧添加量為3% DM；對照組添加等體積的蒸餾水。將各處理組紫花苜蓿500 g放入帶有單向排氣閥的聚乙烯真空袋中，抽真空并密封，每組處理5個重復(fù)，至于環(huán)境溫度(20℃～25℃)條件下保存。青貯60 d后開袋取樣，分析其發(fā)酵指標(biāo)。

表1 紫花苜蓿鮮樣營養(yǎng)價值、附著微生物數(shù)量和氨基酸組成Table 1 Nutrient value,epiphytic microbial amount and amino acid contents of alfalfa

1.3 測定指標(biāo)及方法

取青貯后樣品20 g，加入60 g蒸餾水完全浸沒，4℃靜置24 h，用四層濾布及快速濾紙過濾，得到青貯浸提液，用于測定pH值、乳酸、揮發(fā)性脂肪酸(Volatile fatty acid，VFA)和氨態(tài)氮(NH3-N)。pH值采用pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司LE438型)測定；乳酸含量采用對羥基聯(lián)苯比色法測定[14]；VFA含量采用氣相色譜儀(GC-TRACE 1300，色譜柱型號為30 m×0.25 mm×0.25 μm)測定[15]；NH3-N含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法[16]測定。中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber，ADF)含量采用Van Soest方法利用濾袋技術(shù)測定[17]。采用體外三步法[18]測定蛋白質(zhì)及氨基酸小腸消化率。簡要步驟為晨飼前采集3頭瘤胃瘺管荷斯坦奶牛的瘤胃液，經(jīng)4層濾布過濾至39℃保溫瓶中，將瘤胃液與人工唾液(按照Longland等[19]描述的方法配制)按照1∶1充分混勻，并持續(xù)通入CO2保持厭氧環(huán)境，以維持瘤胃微生物的活性。稱取新鮮青貯發(fā)酵樣品1 g于發(fā)酵瓶中(體積為120 mL)，加入90 mL發(fā)酵液，每個處理組3個重復(fù)，同時設(shè)置3個空白組(只有發(fā)酵液)，將發(fā)酵瓶置于恒溫水浴搖床中發(fā)酵16 h，模擬瘤胃發(fā)酵[20]后，測定發(fā)酵液pH值、NH3-N和VFA濃度，同青貯浸提液測定方法。稱取瘤胃發(fā)酵后飼料殘?jiān)冉?jīng)過胃蛋白酶(1 g·L-1，Sigma P-7012)處理(38℃震蕩水浴1 h)，再經(jīng)過胰酶(3 g·L-1，Sigma P-7545)作用(38℃震蕩水浴24 h)，然后加入三氯乙酸溶液終止酶反應(yīng)，沉淀未消化蛋白。發(fā)酵后的飼料殘?jiān)?，采用冷凍干燥法測定體外干物質(zhì)降解率(DMD)及各氨基酸組分含量。氨基酸分析前處理根照GB/T18246-2019[21]酸水解法進(jìn)行，采用全自動氨基酸分析儀(Biochrom 30+)[22]測定，流動相流速25 mL·h-1，茚三酮流速20 mL·h-1，進(jìn)樣量為20 μL，脯氨酸在波長440 nm處測定，其它種類氨基酸在570 nm波長下進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GLM(SAS 9.0)進(jìn)行復(fù)因子方差分析。各處理組之間均值差異采用Tukey’s多重比較檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加劑對紫花苜蓿青貯發(fā)酵特性及各氨基酸組分的影響

如表2所示，與對照組相比，添加復(fù)合乳酸菌組顯著增加了青貯飼料中粗蛋白含量(P<0.05)，顯著降低了丁酸含量(P<0.05)。與對照組比，添加葡萄籽單寧組及兩者組合添加組均顯著降低了青貯飼料中乳酸、乙酸、丁酸、總揮發(fā)酸及氨態(tài)氮含量(P<0.05)，而添加葡萄籽單寧單獨(dú)組顯著增加了青貯飼料干物質(zhì)及粗蛋白含量(P<0.05)。與單獨(dú)添加復(fù)合乳酸菌組相比，兩種添加劑組合添加顯著提高了青貯飼料乳酸/乙酸比值(P<0.05)，顯著降低了青貯飼料中乙酸、丁酸、總揮發(fā)酸、氨態(tài)氮及粗蛋白含量(P<0.05)。與單獨(dú)添加單寧組相比，兩者組合添加顯著提高了青貯飼料中乳酸/乙酸比值(P<0.05)，顯著降低了青貯飼料中的乙酸、總揮發(fā)酸、氨態(tài)氮及粗蛋白的含量(P<0.05)。各添加劑處理組對青貯飼料丙酸、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量沒有顯著影響。

表2 復(fù)合乳酸菌和葡萄籽單寧對紫花苜蓿青貯飼料發(fā)酵參數(shù)和營養(yǎng)價值的影響Table 2 Effect of compound lactic acid bacteria and grape seed tannins on fermentation parameters and nutrient value of alfalfa silage

如表3所示，除Val外，青貯飼料必需氨基酸含量均受到復(fù)合乳酸菌添加的顯著影響(P<0.05)，而非必需氨基酸只有Gly和Cys受到復(fù)合乳酸菌添加的顯著影響(P<0.05)；葡萄籽單寧添加顯著影響青貯飼料除Met，Phe和Val外的所有必需氨基酸，以及非必需氨基酸中的Ser和Cys含量(P<0.05)；兩者組合添加除對青貯飼料Met，Phe，Ser，Glu和Pro含量沒有交互效應(yīng)外，其余氨基酸均存在交互效應(yīng)(P<0.05)。與對照組相比，復(fù)合乳酸菌添加顯著增加了紫花苜蓿青貯飼料必需氨基酸組分中的Met含量和非必需氨基酸組分中Asp和Cys含量(P<0.05)，而Ile，Tyr和Thr含量顯著降低(P<0.05)；葡萄籽單寧添加顯著提高了青貯飼料必需氨基酸組分中的Ile，Leu，Lys，His，Arg，Tyr含量(P<0.05)和非必需氨基酸組分中的Asp，Ser，Ala，Cys含量(P<0.05)，同時TAA含量顯著提高(P<0.05)；兩種添加劑組合添加顯著提高了青貯飼料Cys含量(P<0.05)，而Tyr和Thr含量顯著降低(P<0.05)。

表3 復(fù)合乳酸菌和葡萄籽單寧對紫花苜蓿青貯飼料氨基酸組成的影響Table 3 Effect of compound lactic acid bacteria and grape seed tannins on amino acid contents of alfalfa silage 單位：g·kg-1DM

2.2 添加復(fù)合乳酸菌及葡萄籽單寧青貯對體外瘤胃發(fā)酵特性及小腸可吸收氨基酸的影響

如表4所示，復(fù)合乳酸菌添加顯著提高青貯飼料干物質(zhì)降解率(P<0.05)，葡萄籽單寧添加顯著提高瘤胃微生物蛋白產(chǎn)量(P<0.05)。

表4 復(fù)合乳酸菌和葡萄籽單寧對紫花苜蓿青貯飼料體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 4 Effect of compound lactic acid bacteria and grape seed tannins on rumen fermentation parameters of alfalfa silage in vitro

如表5所示，與對照組相比，添加復(fù)合乳酸菌顯著提高青貯飼料Cys以及TAA的小腸吸收量(P<0.05)；葡萄籽單寧添加提高青貯飼料His，Arg，Ser，Glu，Cys和TAA的小腸可吸收量(P<0.05)；兩者組合添加顯著提高青貯飼料中Glu和Cys的小腸可吸收量(P<0.05)。

表5 復(fù)合乳酸菌和葡萄籽單寧對紫花苜蓿青貯飼料小腸可吸收氨基酸組成的影響Table 5 Effect of compound lactic acid bacteria and grape seed tannins on the contents of absorbable amino acids in the small intestine of alfalfa silage 單位：g·kg-1DM

3 討論

3.1 復(fù)合乳酸菌和葡萄籽單寧對紫花苜蓿青貯飼料發(fā)酵特性的影響

青貯是復(fù)雜的微生物發(fā)酵過程，受多因素調(diào)控[23]，為提高青貯品質(zhì)，復(fù)合添加劑的應(yīng)用也越來越廣泛。添加單寧可抑制不良微生物對碳水化合物和蛋白質(zhì)的利用，提高飼料營養(yǎng)價值[24]，本研究中添加葡萄籽單寧使苜蓿青貯飼料pH值，VFA及NH3-N含量顯著降低，減少營養(yǎng)物質(zhì)損失。單寧種類及乳酸菌種類的選擇是影響單寧調(diào)控乳酸菌的因素[25]。葡萄籽縮合單寧對乳酸菌具有一定抑制作用[26]，本研究中葡萄籽單寧添加顯著降低青貯飼料中的乳酸含量，抑制乳酸菌生長代謝。青貯過程中NH3-N的生成主要是由于植物和微生物蛋白酶對飼料蛋白質(zhì)的降解作用。單寧具有一定抑制蛋白降解的作用[27]，本研究中葡萄籽單寧單獨(dú)或組合添加均能顯著降低青貯飼料的NH3-N含量，抑制蛋白質(zhì)降解。本研究中所選乳酸菌均為前期菌株篩選鑒定過程中產(chǎn)酸特性較好的菌株，但復(fù)合乳酸菌處理組青貯飼料的pH值和NH3-N含量與對照組無顯著性差異，這可能是由于青貯原料中水溶性碳水化合物含量較低，而附著乳酸菌數(shù)量較高，本研究中青貯原料附著乳酸菌達(dá)到105cfu·g-1FW以上。Muck等[28]證實(shí)青貯材料附著乳酸菌數(shù)量達(dá)到105cfu·g-1FW以上，乳酸菌外源添加劑的作用有限。另外，植物蛋白水解酶在pH值為5.0～6.0[29]范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的活性。因此，復(fù)合乳酸菌添加并未表現(xiàn)出明顯的pH值和NH3-N變化。丁酸是蛋白質(zhì)、葡萄糖和乳酸被腐敗菌等有害微生物分解所產(chǎn)生的，本試驗(yàn)中紫花苜蓿經(jīng)田間凋萎后，干物質(zhì)含量達(dá)到350 g·kg-1，青貯原料水分活度降低，抑制梭菌生長[30]。葡萄籽單寧添加組丁酸含量顯著降低，是由于單寧具有強(qiáng)烈的抑菌作用，抑制了梭菌的生長，從而減少了丁酸產(chǎn)生。

葡萄籽單寧的添加顯著提高了青貯飼料的干物質(zhì)含量，這與其抑制不良微生物作用有關(guān)。與紫花苜蓿原料相比，各添加劑處理組的蛋白質(zhì)含量略有增加，其原因可能是復(fù)合乳酸菌及葡萄籽單寧對蛋白質(zhì)具有一定的保護(hù)作用，而乳酸菌發(fā)酵過程中利用可溶性碳水化合物[31]，產(chǎn)生了揮發(fā)性物質(zhì)，干物質(zhì)含量減少，使青貯飼料中蛋白質(zhì)含量相對增加。與對照組相比，單寧添加劑組增加了青貯飼料中粗蛋白質(zhì)的含量。這是由于單寧與蛋白質(zhì)可以形成復(fù)合物，從而抑制植物和微生物蛋白的降解[32]。復(fù)合乳酸菌添加同樣顯著提高了青貯飼料的粗蛋白質(zhì)含量，然而兩種添加劑組合應(yīng)用并未顯示良好的效果，可能是紫花苜蓿青貯中添加單寧抑制乳酸菌的生長，使得兩種添加劑組合添加應(yīng)用不具備相互促進(jìn)作用[33]。所有處理組的NDF和ADF含量無顯著性差異，這與徐生陽等[34]的研究結(jié)果一致，說明添加復(fù)合乳酸菌及葡萄籽單寧有利于紫花苜蓿青貯營養(yǎng)物質(zhì)的保存。

紫花苜蓿青貯過程中蛋白質(zhì)降解主要是由于植物蛋白酶和微生物的作用。本試驗(yàn)青貯飼料Arg被大量分解，其他氨基酸也有不同程度的降低，但Gly，Ala，Pro和Leu增加，這是青貯過程中植物蛋白酶的降解作用和微生物蛋白合成的共同作用[35]。葡萄籽單寧處理組的TAA含量最高，這是由于葡萄籽單寧與蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，阻礙了蛋白酶的分解作用。復(fù)合乳酸菌與葡萄籽單寧組合處理組的TAA含量低于單獨(dú)添加葡萄籽單寧組，與上述蛋白質(zhì)含量結(jié)果一致。與對照組相比，復(fù)合乳酸菌添加可以提高青貯飼料中的Cys含量，而對其他氨基酸沒有影響，這可能與乳酸菌菌種代謝[36]有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

3.2 復(fù)合乳酸菌和葡萄籽單寧對紫花苜蓿青貯飼料體外瘤胃發(fā)酵特性及小腸可吸收氨基酸的影響

瘤胃液pH值是評定瘤胃內(nèi)環(huán)境是否穩(wěn)定的重要指標(biāo)[37]。各處理組瘤胃液pH值均在正常值6.2～7.0范圍內(nèi)[38]。對于體外發(fā)酵體系，青貯飼料底物有限，通常難以影響瘤胃pH值[39]。本試驗(yàn)中添加葡萄籽單寧提高瘤胃MCP的產(chǎn)量，添加單寧減緩蛋白及碳水化合物的降解，為瘤胃微生物提供更多營養(yǎng)成分[40]。瘤胃干物質(zhì)降解率是影響干物質(zhì)采食量的重要因素[41]。本試驗(yàn)中添加復(fù)合乳酸菌顯著提高了干物質(zhì)降解率，乳酸菌有助于瘤胃其他有益菌的生長[42]，從而提高飼料營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃內(nèi)的降解[43]，陳雷等[33]也得出相似研究結(jié)果。葡萄籽單寧處理組干物質(zhì)降解率最低，與其具有一定的抑制微生物生長的作用有關(guān)。

蛋白質(zhì)的利用效率與小腸可吸收氨基酸含量和組成有關(guān)。在反芻動物新蛋白體系中，小腸可吸收氨基酸用以評價飼料蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值[44]。小腸可吸收氨基酸主要來源于瘤胃微生物蛋白和飼料非降解蛋白質(zhì)[45]，提高小腸可吸收氨基酸含量有利于提高反芻動物的生產(chǎn)性能。在pH值為5～7時，縮合單寧可與蛋白質(zhì)結(jié)合，降低瘤胃蛋白表面活性，從而保護(hù)蛋白質(zhì)在瘤胃中不易被降解[8]，還可以增加瘤胃液的黏性，減少泡沫和胃脹氣的產(chǎn)生，增加機(jī)體氮的利用效率[9]。葡萄籽單寧處理組小腸可吸收氨基酸含量最高，這是由于在瘤胃中葡萄籽單寧與植物蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定復(fù)合物，抑制瘤胃微生物的分解作用，并且在酸性條件下不易被分離，使得過瘤胃蛋白質(zhì)增多，到達(dá)小腸的蛋白質(zhì)總流量增加，從而促進(jìn)小腸對氨基酸的吸收效率[8,46]。單獨(dú)添加葡萄籽單寧可以提高小腸可吸收Lys和Arg的含量，可能與葡萄籽單寧提高胰蛋白酶活性有關(guān)，使得肽鏈內(nèi)切酶水解兩種氨基酸之間的肽鍵[47]。添加劑處理組均提高了小腸可吸收Cys和Glu的含量，這是由于添加復(fù)合乳酸菌及葡萄籽單寧提高了青貯飼料中兩者的含量，同時還可能通過影響瘤胃內(nèi)微生物群系提高兩種氨基酸的吸收量[48-49]。紫花苜蓿添加葡萄籽單寧青貯后，提高了青貯飼料中Lys，His等多種必需氨基酸含量，從而增加了小腸可吸收必需氨基酸的含量，對于提高反芻動物蛋白質(zhì)利用和生產(chǎn)性能具有積極作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，單獨(dú)添加葡萄籽單寧以及葡萄籽單寧與乳酸菌組合添加可以降低紫花苜蓿青貯飼料中乙酸、總揮發(fā)性脂肪酸和氨態(tài)氮的含量，對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)具有一定的改善作用，但乳酸含量降低；而單獨(dú)添加乳酸菌對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的改善作用效果有限；單獨(dú)添加葡萄籽單寧或乳酸菌，青貯飼料總氨基酸含量均顯著提高；添加葡萄籽單寧還可以顯著提高體外發(fā)酵微生物菌體蛋白合成量，以及小腸可吸收異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，組氨酸，精氨酸，酪氨酸和總氨基酸含量。因此，添加葡萄籽單寧在一定程度上改善了紫花苜蓿青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價值，且明顯提高了青貯飼料中必需氨基酸賴氨酸、組氨酸和精氨酸，以及總氨基酸的小腸可吸收量。