ALA對(duì)高溫脅迫下苜蓿屬3個(gè)品種葉片生理的影響

張 鶴，敖平星，趙 雁

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明650201)

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是植物體內(nèi)所有四吡咯化合物(如血紅素、葉綠素、維生素B12和卟啉等)生物合成的關(guān)鍵前體，與植物的生命活動(dòng)密切相關(guān)[1-2]。研究表明ALA是一種新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育[3]，提高葉綠素含量[4]，顯著促進(jìn)光合速率[5-6]。如外源ALA處理可以上調(diào)馬鈴薯(Solanumtuberosum)葉片PSⅡ反應(yīng)中心核心蛋白D1和D2編碼基因表達(dá)，提高光系統(tǒng)Ⅱ(Photosystem Ⅱ，PSⅡ)反應(yīng)中心活性，促進(jìn)光合運(yùn)轉(zhuǎn)速率[7]；Wang等[8]對(duì)小麥(Triticumaestivum)的研究也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)論。此外，噴施ALA還可以調(diào)節(jié)逆境脅迫下植物體內(nèi)的抗氧化酶活性，清除過(guò)剩的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，降低相對(duì)電導(dǎo)率(Relative conductivity，EL)和丙二醛(Malonydialdehyde，MDA)含量，保護(hù)細(xì)胞膜穩(wěn)定性，從而提高植物抗逆性[9]。ALA對(duì)人類和牲畜沒(méi)有毒害作用，可生物降解、對(duì)環(huán)境友好[10]，因此在植物抗逆性研究中具有巨大的潛力。目前，利用外源ALA提高植物抗逆性的研究主要集中在無(wú)花果(Ficuscarica)[11]、黃瓜(Cucumissativus)[12]、西瓜(Vitisvinifera)[13]等園藝作物上，而對(duì)其影響豆科牧草抗逆性的研究鮮有報(bào)道。

近幾年全球氣候驟變，高溫氣候環(huán)境越來(lái)越嚴(yán)重。根據(jù)IPCC第六次報(bào)告公布的數(shù)據(jù)，預(yù)計(jì)到2100年氣溫將上升1.5～5.8℃[14]。高溫引起植物形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理、生化和分子水平的一系列變化，最終影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降[15-16]。在高溫脅迫下，氧化應(yīng)激通常產(chǎn)生大量的ROS，過(guò)剩的ROS可以通過(guò)葉綠體、線粒體和過(guò)氧化物酶體的氧化對(duì)植物細(xì)胞造成不可逆的損傷[17]。開(kāi)發(fā)抗高溫脅迫的品種或噴施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑提高植物耐熱性是研究熱點(diǎn)[18-19]。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)和南苜蓿(MedicagohispidaL.)均為苜蓿屬優(yōu)質(zhì)牧草，但高溫脅迫是限制其在亞熱帶地區(qū)大面積推廣應(yīng)用的主要因素之一。鑒于此，本研究以苜蓿屬3個(gè)品種為材料，探究外源ALA延緩高溫脅迫下苜蓿植物葉片衰老的生理機(jī)制，為ALA在苜蓿植物上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為紫花苜蓿(M.sativa)WL525HQ購(gòu)于北京正道生態(tài)科技有限公司，德欽苜蓿(M.sativa‘Deqin’)由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)畢玉芬教授贈(zèng)送，楚雄南苜蓿(M.hispida‘Chuxiong’)由云南省草地動(dòng)物研究所贈(zèng)送，3個(gè)品種的種子均為當(dāng)年生種子，均存于4℃避光條件下，種子發(fā)芽率分別為92%，68%，76%。

1.2 試驗(yàn)處理

將顆粒飽滿的苜蓿種子置于濕潤(rùn)的紗布中，25℃催芽，然后移栽至小花盆中，栽培基質(zhì)為滅菌泥炭土，每盆栽植4株(7 cm×7 cm)。每隔2 d澆1次Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，并將小花盆放置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24℃/18℃(晝/夜)，白天12 h，夜晚12 h，相對(duì)濕度在65%，光照強(qiáng)度為400 μmol·m-2·s-1。待長(zhǎng)至35 d苗齡時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的苜蓿植株放入人工智能氣候箱中模擬高溫環(huán)境脅迫。在進(jìn)行高溫脅迫前先對(duì)苜蓿植株進(jìn)行ALA預(yù)處理，即在常溫下(24℃/18℃晝/夜12 h/12 h)對(duì)植株葉面噴施不同濃度的ALA水溶液(0，5，10，15，20，25 mg·L-1ALA)，以葉片正面和背面濕潤(rùn)滴水為標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)噴施4 d，再進(jìn)行高溫脅迫(42℃/38℃，晝/夜，12 h/12 h) 3 d。試驗(yàn)共設(shè)置7個(gè)處理：①常溫培養(yǎng)+蒸餾水(CK)；②高溫脅迫+蒸餾水(Heat)；③高溫脅迫+5 mg·L-1ALA (HA1)；④高溫脅迫+10 mg·L-1ALA (HA2)；⑤高溫脅迫+15 mg·L-1ALA (HA3)；⑥高溫脅迫+20 mg·L-1ALA (HA4)；⑦高溫脅迫+25 mg·L-1ALA (HA5)。每個(gè)處理重復(fù)3次，高溫脅迫3 d后采集苜蓿植株頂芽下第一片真葉，-80℃保存，用于各生理指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)定

葉綠素含量采用酒精浸提法測(cè)定[20]；MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[21]；相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定方法參照葉尚紅等[22]的方法并稍作改動(dòng)；SOD、POD和CAT活性參考李合生[21]的方法并加以改良。

1.4 隸屬函數(shù)值及隸屬度[23]

隸屬函數(shù)值計(jì)算公式：

X(u)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

X(u)=1-[(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)]

(2)

式中：X為各苜蓿屬植物中某一指標(biāo)的測(cè)定值，Xmin為該指標(biāo)測(cè)定值的最小值，Xmax為該指標(biāo)測(cè)定值的最大值；當(dāng)測(cè)定指標(biāo)與植物耐熱性呈正相關(guān)時(shí)采用公式(1)，當(dāng)測(cè)定指標(biāo)與植物耐熱性呈負(fù)相關(guān)時(shí)采用公式(2)。

隸屬度=∑(X(u1)+X(u2)+…+X(un)/n

式中：n為指標(biāo)數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用Excel計(jì)算和整理數(shù)據(jù)；用SPSS 21.0對(duì)不同處理的各指標(biāo)進(jìn)行方差分析(P<0.05)，用LSD和Dunnett T3對(duì)各參數(shù)平均數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和多重比較，同時(shí)，以處理和品種作為固定因子，對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行雙因素方差分析；用Origin 2019做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALA對(duì)高溫脅迫下苜蓿屬植物葉片相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量的影響

外源ALA濃度梯度對(duì)高溫脅迫下3個(gè)苜蓿品種葉片的影響表現(xiàn)出濃度效應(yīng)(圖1)。與CK相比，Heat處理使各品種中葉片發(fā)生了枯萎失綠現(xiàn)象，而經(jīng)不同濃度ALA預(yù)處理后再進(jìn)行高溫脅迫，各品種中葉片枯萎失綠程度降低。這種形態(tài)上的變化趨勢(shì)在生理指標(biāo)EL和MDA含量中也得到驗(yàn)證。由圖2可知，Heat處理使各品種中葉的EL和MDA含量顯著升高(P<0.05)。與CK相比Heat處理下各品種苜蓿葉中EL分別升高了205.844%，206.589%和226.741% (圖2A)，MDA含量分別升高了112.649%，110.140%和124.664% (圖2B)。高溫脅迫下噴施不同濃度ALA預(yù)處理后，各品種中葉的EL和MDA含量與Heat處理相比均顯著降低(P<0.05)，其中在HA4處理下各品種中葉的EL和MDA含量最低，與CK差異不顯著，且各品種中葉的EL和MDA在HA2、HA3和H5處理間兩兩差異不顯著。

圖1 不同處理下的苜蓿植株葉片形態(tài)Fig.1 The morphology of alfalfa plants leaves under different treatments注：A,楚雄南苜蓿(M. hispida ‘Chuxiong’)，B,紫花苜蓿WL525HQ(M. sativa ‘WL525HQ’)，C,德欽紫花苜蓿(M. sativa ‘Deqin’)Note:A,M. hispida ‘Chuxiong’,B, M. sativa ‘WL525HQ’,C,M. sativa ‘Deqin’

圖2 ALA對(duì)高溫脅迫下苜蓿葉片相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量的影響Fig.2 Effect of ALA on EL and MDA content of Medicago leaves under high temperature stress注：同品種不同處理下，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；M-525代表紫花苜蓿WL525HQ(M. sativa ‘WL525HQ’)，M-DQ代表德欽紫花苜蓿(M. sativa ‘Deqin’)，M-CX代表楚雄南苜蓿(M. hispida ‘Chuxiong’)。下同Note:Different lowercase letters indicate significant differences between different treatment of the same cultivar at the 0.05 level. M-525 for M. sativa ‘WL525HQ’,M-DQ for M. sativa ‘Deqin’,M-CX for M. hispida ‘Chuxiong’. The same as below

2.2 ALA對(duì)高溫脅迫下苜蓿屬植物葉片抗氧化酶活性的影響

由圖3可知，Heat處理使各品種中葉的CAT、SOD和POD活性顯著降低(P<0.05)。與CK相比Heat處理下各品種苜蓿葉中CAT活性分別下降了46.510%，45.292%和51.065%(圖3A)；SOD活性分別下降了53.176%，52.416%和56.150% (圖3B)；POD活性分別下降了28.325%，28.235%和35.448%(圖3C)。高溫脅迫下噴施不同濃度ALA預(yù)處理后，各品種中葉的CAT,SOD和POD活性與Heat處理相比均有上升，且這3個(gè)酶活性隨著ALA濃度的增加總體上呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)；其中在HA4處理下各品種中葉的CAT、SOD和POD活性達(dá)到峰值，與Heat差異顯著(P<0.05)，與CK差異不顯著；且各品種中葉的3個(gè)酶活性在其余ALA處理間兩兩差異不顯著，與Heat也無(wú)顯著差異。

圖3 ALA對(duì)高溫脅迫下苜蓿葉片CAT、SOD和POD活性的影響Fig.3 Effect of ALA on CAT，SOD and POD activity of Medicago leaves under high temperature stress

2.3 ALA對(duì)高溫脅迫下苜蓿屬植物葉片葉綠素含量的影響

由圖4可知，Heat處理使各品種中葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量均顯著降低(P<0.05)。與CK相比Heat處理下3個(gè)品種苜蓿葉綠素a分別下降了36.214%，29.890%和48.875% (圖4A)；葉綠素b分別下降了47.387%，30.611%和52.147% (圖4B)；總?cè)~綠素含量分別下降了39.775%，30.137%，49.903% (圖4C)。高溫脅迫下噴施不同濃度ALA預(yù)處理后，各品種中葉綠素a,b和總?cè)~綠素含量與Heat處理相比均有上升，且這3個(gè)指標(biāo)隨著ALA濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。在HA4處理下各品種中葉綠素a,b和總?cè)~綠素含量最大且顯著高于Heat處理(P<0.05)，但與其余4組ALA處理和CK相比差異不顯著。

圖4 ALA對(duì)高溫脅迫下苜蓿葉片葉綠素含量的影響Fig.4 Effect of ALA on chlorophyll content of Medicago leaves under high temperature stress

2.4 影響苜蓿屬植物各測(cè)定指標(biāo)的因素效應(yīng)分析

利用SPSS 21.0軟件中一般線性模型對(duì)品種和處理進(jìn)行雙因素方差分析可知(表1)，處理對(duì)各測(cè)定指標(biāo)有顯著影響(P<0.05)；品種除了對(duì)CAT和POD活性無(wú)顯著影響外，對(duì)其余指標(biāo)均有顯著影響(P<0.05)；處理和品種的交互作用對(duì)所有指標(biāo)均無(wú)顯著影響。由于Partial Eta Squared(η2)值的大小表示著主效應(yīng)的大小[24]，故在上述的顯著效應(yīng)中，其對(duì)各測(cè)定指標(biāo)作用的大小次序?yàn)椋禾幚?品種。因此在本試驗(yàn)分析中主要考慮不同處理對(duì)苜蓿植株各測(cè)定指標(biāo)的影響，雖然品種間也存在顯著差異，但這種差異可能是由品種自身特異性所決定的，所以未考慮品種間的差異。

表1 品種和處理對(duì)各測(cè)定指標(biāo)的雙因素方差分析Table 1 Two way ANOVA of variety and treatment on each measured index

2.5 ALA緩解苜蓿屬植物高溫脅迫適宜濃度的篩選

隸屬函數(shù)分析提供了一種在多指標(biāo)測(cè)定基礎(chǔ)上，對(duì)植物特性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的方法，這種分析方法可以消除單一指標(biāo)評(píng)價(jià)的片面性[25]。為了能夠清晰的反映不同濃度ALA預(yù)處理對(duì)苜蓿植物耐熱性的影響，采用隸屬函數(shù)分析將3個(gè)苜蓿品種中與耐熱性相關(guān)的8個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。由表2可知，在HA4處理下，這8個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值大多都很高，隸屬度為0.969，排名第1，優(yōu)于CK，說(shuō)明20 mg·L-1ALA預(yù)處理對(duì)這3個(gè)苜蓿品種高溫脅迫的緩解作用最好，耐熱性也最強(qiáng)。在高溫脅迫下(Heat)，各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值和隸屬度最小均為0.000，處于本次耐熱性排序的末端，說(shuō)明在高溫脅迫下未經(jīng)ALA預(yù)處理的各苜蓿品種受到的熱損害最嚴(yán)重，耐熱性最差。

表2 ALA對(duì)高溫脅迫下苜蓿葉片各測(cè)定指標(biāo)的隸屬函數(shù)分析Table 2 Membership function analysis of ALA on various measured indexes of Medicago leaves under high temperature stress

3 討論

5-氨基乙酰丙酸(ALA)是一種天然氨基酸，具有生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)功能[26]，可以提高植物的抗逆性，在農(nóng)林生產(chǎn)上具有廣闊用途。在園林植物上，用 50 mg·L-1ALA可以提高金森女貞(Ligustrumjaponicum‘Howardii’)葉片的耐熱性[27]；在園藝作物上，用25 mg·L-1ALA能促進(jìn)低溫脅迫下番茄(Solanumlycopersicum)幼苗的生長(zhǎng)，提高其抗冷性[28]；在大田作物上，用30 mg·L-1ALA可提高RWC和葉綠素含量，增強(qiáng)油菜(Brassicanapus)的抗旱性[29]。盡管不同植物間的反應(yīng)有所差異，但ALA能明顯提高植物的抗逆性。本研究對(duì)3個(gè)苜蓿品種的各耐熱性指標(biāo)進(jìn)行雙因素方差分析，結(jié)果表明，與品種因素相比，ALA處理對(duì)苜蓿植株耐熱性的影響作用占主導(dǎo)地位，其中以20 mg·L-1ALA能顯著提高苜蓿抵抗高溫的能力。

高溫脅迫下植物體內(nèi)會(huì)積聚大量的活性氧，從而加劇細(xì)胞膜脂的過(guò)氧化作用，并破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，使細(xì)胞液外滲，導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率升高[30-31]。而膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物之一是MDA[32]。所以常將MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率作為評(píng)判植物細(xì)胞膜受損程度的重要指標(biāo)[33]。有研究表明，高溫下細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性與相關(guān)相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[34]。馮漢青等[35]研究表明，在高溫脅迫下外源ALA的施用可以顯著降低當(dāng)歸幼苗(Angelicasinensis)中MDA含量，增強(qiáng)了幼苗對(duì)逆境的適應(yīng)能力。本研究結(jié)果表明，在高溫脅迫下3個(gè)品種中葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量顯著升高，葉片出現(xiàn)枯萎失綠現(xiàn)象，施用不同濃度的ALA預(yù)處理后可降低相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量，增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。在高溫脅迫下，較高活性的抗氧化酶能夠有效除細(xì)胞內(nèi)過(guò)剩自由基和活性氧，保護(hù)細(xì)胞免受氧化傷害，維持植物正常生長(zhǎng)[36-38]。與對(duì)照相比，在高溫脅迫下各苜蓿品種中葉片的中抗氧化酶(SOD，POD和CAT)活性均有顯著下降，施用外源ALA預(yù)處理后，3種抗氧化酶活性均升高，這與Katuwal等[39]的研究結(jié)果相似。在高溫脅迫下，ALA通過(guò)提升3個(gè)苜蓿品種中葉片的膜穩(wěn)定性和抗氧化能力來(lái)延緩葉片衰老，從而提高其耐熱性。

光合作用是植物體進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)換及能量代謝的主要途徑，而葉綠素又是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，其含量的高低很大程度上決定著植物光合能力的強(qiáng)弱[2]。在植物中，ALA是合成葉綠素分子中吡咯環(huán)的起始物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)植物葉綠素的合成，促進(jìn)葉綠素a氧化為葉綠素b[40]。Zhang等[41]研究表明，鹽脅迫下外源ALA處理能使決明(Cassiaobtusifolia)葉片保持較高的葉綠素含量和光合速率，葉自慧等[42]對(duì)菊花(Chrysanthemum×morifolium)的研究也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)論。本研究結(jié)果與之相似，在高溫脅迫下施用外源ALA預(yù)處后可以提高各品種中葉片的葉綠素a、b和葉綠素總量。

4 結(jié)論

高溫脅迫抑制了紫花苜蓿WL525HQ和德欽苜蓿以及楚雄南苜蓿葉片的生長(zhǎng)，使葉片出現(xiàn)枯萎失綠的現(xiàn)象。經(jīng)ALA預(yù)處理后能有效緩解高溫脅迫對(duì)這3個(gè)苜蓿品種的熱損傷，使葉片中相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量顯著降低，保護(hù)膜穩(wěn)定性；提高抗氧化酶(CAT、SOD和POD)活性，延緩葉片衰老；增加葉綠素含量，促進(jìn)光合作用，進(jìn)而提高3個(gè)苜蓿品種的耐熱性。隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)認(rèn)為當(dāng)ALA濃度為20 mg·L-1時(shí)緩解高溫脅迫效果最好。