母子分離對青年CD-1雄鼠認知功能及海馬BDNF介導(dǎo)的LTP的影響

王亞濤，張月明，韋琪瑤，吳永芳，陳貴海

生命早期的負性生活事件如母子分離(maternal separation, MS)是神經(jīng)精神類疾病的高危因素，可導(dǎo)致機體一系列的神經(jīng)心理行為的改變，嚴重者可造成持久的情緒和認知功能障礙[1-2]，但其具體機制不明?，F(xiàn)有研究[3]表明MS會加速子代老年期的認知功能損害，其中涉及興奮性突觸傳遞的長時程增強(long-term potentiation, LTP)受損。然而由于采取的動物品系與分離程序各不相同，MS對青年期認知功能的影響結(jié)果矛盾[4-5]，且是否涉及突觸可塑性的改變尚不清楚。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)作為內(nèi)源性蛋白之一，是海馬等腦區(qū)突觸可塑性的重要調(diào)節(jié)因子[6]，在腦發(fā)育及腦功能中起關(guān)鍵作用。研究表明，MS導(dǎo)致的認知功能改變與BDNF水平有關(guān)[7]，后者是否聯(lián)系認知損害相關(guān)的突觸可塑性有待研究。該研究旨在探討早期MS對青年期雄鼠認知功能及海馬BDNF介導(dǎo)的LTP的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物CD-1小鼠(SPF級，6～8周)購自于北京維通利華責任有限公司。將14只健康CD-1孕鼠照料至其自然生產(chǎn)。隨后將子代雄鼠隨機分配至MS組及對照(CON)組，其中MS組的新生幼鼠在出生后第4天開始，每日上午9 ∶00—12 ∶00將母鼠與子鼠分離，直至出生后第21天斷奶，CON組不進行任何干預(yù)。期間給予母鼠及子鼠充足的食物，維持室溫22～24 ℃、濕度50%～60%、明暗周期12 h/12 h。斷奶后，將兩組幼鼠分籠飼養(yǎng)至3月齡。最終每組各納入13只，其中8只用于行為學、Western blot及實時熒光定量PCR的檢測，另外5只用于離體海馬LTP的誘導(dǎo)。實驗程序均經(jīng)安徽醫(yī)科大學實驗動物委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1Morris水迷宮實驗 采用Morris水迷宮實驗評估幼鼠空間學習和記憶能力。水迷宮由一圓形水池和水下平臺組成。實驗分為定位航行期(學習期)和空間探索期(記憶期)兩部分。① 定位航行期：每次測試將小鼠頭部面向池壁隨機從4個象限投入水中，小鼠在規(guī)定時間(60 s)內(nèi)爬上平臺或未能找到平臺均讓其在平臺適應(yīng)30 s。每天進行4次測試，間歇15 min，實驗持續(xù)7 d。② 空間探索期：在定位航行實驗的最后一天，撤去平臺，將小鼠從靶象限的相反象限放入水中，讓其自由探索60 s。使用Any-Maze分析定位航行期中受試小鼠找到平臺的潛伏期、游泳路程及速度，以及空間探索期的靶象限時間及路程百分比。

1.2.2Western blot 采用Western blot法檢測兩組子鼠大腦海馬區(qū)BDNF的相對含量。水迷宮結(jié)束后15 d將兩組小鼠頸椎脫臼后取腦，剝離海馬組織并充分研磨后，加入RIPA細胞裂解液進行裂解。12 000 r/min離心10 min。收集上清液，在收集的蛋白樣品中按照1 ∶4加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min，以充分變性蛋白。隨后按照Western blot法的步驟操作，一抗為BDNF抗體，二抗為羊HRP標記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG。使用Image J軟件分析蛋白條帶，計算BDNF的相對表達量。

1.2.3實時熒光定量PCR 提取海馬組織，加入TRIzol裂解液進行研磨，提取總RNA，利用分光光度計檢測其純度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，將其作為熒光定量的模板，反應(yīng)體系包括：5 μl的2×SYBR Green Mixture、1 μl的上游引物、1 μl的下游引物、1 μl的cDNA、2 μl的RNase Free water。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性、單循環(huán)1 min，95 ℃、20 s，60 ℃、1 min，共計40個循環(huán)。mRNA相對含量計算方法為2-ΔΔCt。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4離體海馬CA1區(qū)LTP誘導(dǎo) 將小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉、處死，從顱腔中取出腦組織，將切除嗅球和小腦的腦組織直立粘于標本底座，固定于標本槽內(nèi)。調(diào)整刀片高度，振動切片機進行連續(xù)切片，切取包含背側(cè)海馬的400 μm厚冠狀腦片。腦片在記錄之前，在持續(xù)通入95% O2和5% CO2混合氣體的人工腦脊液中孵育1 h。加入各組藥物后進行場電位記錄。將刺激電極鎢絲電極置于海馬CA3區(qū)，玻璃記錄電極置于CA1區(qū)，記錄CA1區(qū)的場興奮性突觸后電位。場電位經(jīng)放大器放大后，輸出信號經(jīng)數(shù)模轉(zhuǎn)換器處理，由數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集、分析和處理。記錄時首先找到能引起可觀察場興奮性突觸后電位(filed excitatory postsynaptic potential, fEPSP)的最小刺激，再逐漸增大刺激強度，記錄每次刺激引起的突觸前動作電位和突觸后fEPSP的幅度。刺激方波的波寬為0.1 ms，刺激頻率為0.033 Hz。以能引起最大fEPSP幅度50%的刺激強度作為測試刺激強度。給予時間間隔分別為20、40、60、80、100、150、200、400、600、800 ms和1 s的雙脈沖刺激，計算第2個fEPSP與第1個fEPSP幅度的比率。以能引起最大fEPSP幅度的50%刺激強度作為測試刺激強度，穩(wěn)定記錄30 min作為基線，由高頻電刺激(100 Hz、1 000 ms ×2, 30 s間隔誘導(dǎo))，誘導(dǎo)后持續(xù)記錄90 min。

2 結(jié)果

2.1 母子分離對小鼠空間記憶的影響定位航行期，兩組尋找平臺的潛伏期[F(6，84)=109.6，P<0.01]以及游泳路程[F(6，84)=76.06，P<0.01]均隨天數(shù)的增加而逐漸減小；與CON組小鼠相比，MS組小鼠定位航行期潛伏期[F(1，14)=30.10，P<0.01](圖1A)及游泳路程[F(1，14)=64.95，P<0.01](圖1C)增加；而處理因素×天數(shù)的交互效應(yīng)對潛伏期[F(6，84)=1.813，P>0.05]及游泳路程[F(6，84)=0.956 7，P>0.05]無顯著性影響?？臻g探索期，與CON組小鼠相比，MS組小鼠靶象限時間百分比(P<0.05，圖1B)及游泳路程百分比(P<0.05，圖1D)均下降。游泳速度[F(6，84)=0.606 3，P>0.05]不隨天數(shù)發(fā)生改變，且組間比較無統(tǒng)計學差異[F(1，14)=0.724 1，P>0.05](圖1E)。

圖1 兩組CD-1小鼠在Morris水迷宮中的測試情況A：定位航行期潛伏期；B：空間探索期靶象限時間百分比；C：定位航行期游泳距離；D：空間探索期靶象限路程百分比；E：游泳速度；與CON組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 母子分離對小鼠海馬區(qū)BDNF水平的影響兩獨立樣本t檢驗結(jié)果表明，與CON組相比，MS組海馬區(qū)BDNF蛋白含量降低(P<0.01)。見圖2。

圖2 兩組CD-1小鼠海馬區(qū)BDNF蛋白含量的表達比較A：BDNF蛋白條帶；B：BDNF蛋白相對含量；與CON組比較：**P<0.01

2.3 母子分離對小鼠海馬區(qū)BDNF mRNA水平的影響實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，MS組BDNF mRNA相對含量低于CON組(P<0.05)。見圖3。

圖3 兩組CD-1小鼠海馬區(qū)BDNF mRNA水平比較與CON組比較：*P<0.05

2.4 母子分離對小鼠海馬CA1區(qū)LTP的影響使用θ爆發(fā)刺激(TBS)誘導(dǎo)海馬CA3-CA1通路LTP，與對照組相比，MS組LTP振幅降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 離體海馬CA1區(qū)LTPA：fEPSP模式圖；B：fEPSP相對斜率統(tǒng)計圖；與CON組比較：**P<0.01

3 討論

生命早期是個體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵時期，這一時期神經(jīng)元的發(fā)育及功能完善極易受應(yīng)激事件的影響，引起一系列神經(jīng)生物學變化，從而導(dǎo)致成年后的認知功能損害[1]。母子分離通過母愛剝奪這一較為溫和的手段對幼鼠進行心理打擊，常被用于探討生命早期應(yīng)激影響成年后學習與記憶功能的機制。本研究顯示，經(jīng)歷MS的青年期CD-1子鼠在Morris水迷宮學習期的潛伏期及游泳路程顯著延長，在記憶期靶象限時間及路程百分比顯著降低，而運動能力(即游泳速度)未發(fā)生損害。這表明嬰兒期的MS經(jīng)歷可損害青年期的空間學習記憶功能。

盡管MS導(dǎo)致學習和記憶功能受損的機制尚不明確，但海馬作為記憶形成和維持的關(guān)鍵腦區(qū)可能參與其中。BDNF在海馬區(qū)廣泛表達，并通過與酪氨酸激酶受體B(tyrosine receptor kinase B, TrkB)結(jié)合調(diào)節(jié)下游的PI3K/AKT、PLC-γ等信號通路，進而參與認知相關(guān)神經(jīng)元的功能調(diào)節(jié)[8-9]。該研究使用Western blot與實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明，3月齡MS組海馬區(qū)BDNF的表達水平(蛋白和mRNA)顯著下降。以往母子分離研究對象多為分離程序持續(xù)整個哺乳期的大鼠或哺乳前中期的近交系小鼠。由于前者品系的差異及后者分離時間的不足，使得母子分離操作對認知功能的影響具有矛盾性[10-11]。為改善這一模型，該研究選用對更能模擬人群特點的封閉群CD1小鼠進行足夠強度的母子分離操作，并通過多種技術(shù)評估其BDNF的表達水平，同時利用電生理技術(shù)填補了該品系的小鼠LTP變化這一空白，進而顯示負性生活事件如母愛剝奪易導(dǎo)致海馬區(qū)BDNF的表達水平下降，從而造成持久的認知功能減退。

目前研究MS對嚙齒類動物突觸可塑性的影響，其研究對象聚焦于大鼠，而鮮有研究關(guān)注小鼠的突觸可塑性是否改變。僅有的一項研究顯示，通過檢測經(jīng)歷MS操作的C57BL/6J子鼠青春期第35～55天海馬不同通路的LTP，結(jié)果提示，CA3-CA1通路的LTP尚未受損，而顆粒細胞發(fā)出的軸突組成的苔蘚纖維與CA3區(qū)錐體細胞通路的LTP下調(diào)[11]。該研究電生理結(jié)果表明嬰兒期經(jīng)歷MS的青年CD-1小鼠CA3-CA1通路的LTP受損。究其原因，可能是該研究采用的動物品系、分離程序以及檢測時期的差異所致。

既往研究[9]結(jié)果表明，BDNF作為突觸可塑性的重要調(diào)節(jié)因子，參與學習與記憶功能，其機制之一是通過與TrkB受體結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。另有研究[12]顯示，通過選擇性的降低海馬CA1/CA3區(qū)BDNF/TrkB的表達，在突觸前膜BDNF與TrkB結(jié)合參與LTP的誘導(dǎo)，二者在突觸后膜結(jié)合用于維持LTP。LTP是NMDA受體突觸傳遞效能持續(xù)增強的表現(xiàn)，在學習記憶過程中發(fā)揮重要作用。BDNF可以通過促進NMDAR的轉(zhuǎn)錄、翻譯過程，調(diào)節(jié)NMDAR的磷酸化水平從而促進谷氨酸突觸傳遞，這一過程依賴于突觸后TrkB的活化[13]。此外，BDNF/TrkB通路通過促進Ca2+內(nèi)流，活化蛋白激酶C誘導(dǎo)NMDAR的轉(zhuǎn)運進而調(diào)節(jié)突觸可塑性[14]。以上研究提示，BDNF可能通過介導(dǎo)突觸可塑性在MS導(dǎo)致的青年期認知功能受損中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，一定強度的母子分離會導(dǎo)致青年期雄鼠的認知功能減退，后者可能與海馬區(qū)BDNF介導(dǎo)的LTP受損有關(guān)。該實驗的不足之處在于未采用免疫組化技術(shù)檢測海馬各亞區(qū)BDNF含量，未進一步向腦室注射外源性BDNF或轉(zhuǎn)基因技術(shù)使BDNF在青年期過表達，觀察能否逆轉(zhuǎn)MS帶來的LTP下調(diào)及學習記憶功能的損害。此外，BDNF介導(dǎo)的LTP的下游通路如何參與MS導(dǎo)致認知功能損害的過程有待于進一步研究。