七氟烷后處理對原代海馬神經(jīng)元氧糖剝奪/復氧損傷及自噬的影響

王佳楠，黃春霞，胡憲文

在臨床上，急性缺血性腦病的發(fā)病率、致殘率、病死率很高。腦缺血可導致神經(jīng)細胞損傷甚至死亡，造成不可逆的損傷[1]。臨床治療腦缺血的有效方法是盡快恢復血液灌注。再灌注后缺血區(qū)組織血供恢復但組織損傷加重的現(xiàn)象被稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)[2]。有研究[3]報道，在腦組織特別是海馬中氧與三磷酸腺苷儲存較少，海馬神經(jīng)元對線粒體功能障礙和線粒體活性氧增加敏感，對能量缺乏的耐受性較差，海馬神經(jīng)細胞極易因缺血再灌注受損。CIRI的發(fā)病機制復雜，其機制涉及線粒體功能障礙、自噬、自由基損傷、鈣超載、炎癥損傷、神經(jīng)細胞凋亡。自噬是一種細胞自降解過程，能夠降解和回收胞內(nèi)組分，被證實與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展有關，包括神經(jīng)退行性疾病、癌癥、自身免疫性疾病。

七氟烷是一種臨床上廣泛應用的吸入性麻醉藥，既往研究[4]表明，七氟烷后處理對CIRI有神經(jīng)保護作用，可以減少腦梗死面積。本課題組前期研究[5]表明七氟烷后處理可通過增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，降低促凋亡蛋白Bax、細胞色素C、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)的表達，減少海馬神經(jīng)元丟失，從而抑制細胞凋亡，對大鼠有神經(jīng)保護作用。但七氟烷后處理對腦自噬的影響還不清楚。故擬研究七氟烷后處理對原代海

馬神經(jīng)元氧糖剝奪/復氧(oxygen - glucose deprivation / reoxygenation, OGD/R)后損傷凋亡，線粒體氧化應激及自噬的影響，探討七氟烷后處理腦保護作用的相關分子機制，為臨床治療CIRI提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康成年SPF級雄鼠和雌鼠由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK(皖)2017-006。

1.1.2主要試劑 胎牛血清(貨號：S711-001S)購自上海Lonsera 公司；DMEM-12細胞培養(yǎng)液(貨號：11330500BT)、Neurobasal Medium(貨號：21103-049)、 0.25%胰蛋白酶(貨號：25200056)、GlutaMAX (貨號:35050-061)、B27 (貨號：17504-044)、青鏈霉素 (貨號:15140122)均購自美國Gibco公司；5-氟-2′-脫氧尿嘧啶核苷(貨號：F0503)、多聚賴氨酸 (貨號：P1399)均購自美國Sigma公司；Parkin抗體(貨號：2132S)、 微管相關蛋白1輕鏈3B(Microtubule-associated protein 1 light chain 3B, LC3B)抗體(貨號：3868S) 、活化的半胱氨酸蛋白酶3 (cleaved caspase-3)抗體(貨號:9661S)均購自美國Cell Signaling Technology 公司；絲氨酸/蘇氨酸激酶(PTEN induced putative kinase 1, PINK1)抗體(貨號：sc-517353)購自美國Santa Cruz Blotechnology公司；線粒體超氧化物指示劑(MitoSOX,貨號：M36008)購自美國 invitrogen公司 ；BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號: P0012)、 RIPA裂解液(貨號：P0013K)均購自上海碧云天生物技術有限公司；七氟烷(貨號: 83291)購自美國艾伯維公司；原位末端標記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)凋亡檢測試劑盒(貨號: 12156792910)購自美國Roche公司；ECL顯影液(貨號:32109)購自美國Thermo公司； 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)測定試劑盒(貨號:A020)購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3主要儀器 缺氧小室(加拿大Stem Cell公司)；七氟烷蒸發(fā)罐(德國Drager公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)；Tanon Fine Do X6 全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海 Tannon 公司)；Tecan M 1000 酶標儀(德國 Tecan 公司)；37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱(美國Sigma 公司)。

1.2 方法

1.2.1原代海馬神經(jīng)元細胞提取及培養(yǎng) 雌雄大鼠交配，以雌性大鼠出現(xiàn)陰道栓日計算胎齡，提取自孕鼠子宮內(nèi)胎齡(18±0.5)d胎鼠海馬組織。根據(jù)文獻方法[6]，用75%乙醇消毒器械及孕鼠腹部，“V”字形剪開腹部，取出胚胎，斷頭取腦，放入預冷的無菌平衡鹽溶液中，顯微鏡下分離海馬組織，0.25% 胰蛋白酶消化10 min左右，加入培養(yǎng)基(90% DMEM-F12+10%胎牛血清 )終止消化5 min，3 000 r/min、離心5 min，棄上清液后，加入培養(yǎng)基(88% DMEM-F12+1%青鏈霉素+1% Glutamax+10%胎牛血清)，制成細胞懸液，種植于多聚賴氨酸包被的玻片中，放入37 ℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。24 h后培養(yǎng)基全部換成細胞維持液(96% Neurobasal Medium+2% B27+1% Glutamax+1%青鏈霉素)，再加入5-氟-2′-脫氧尿嘧啶核苷(40 μmol/L)抑制膠質(zhì)細胞生長。每3 d更換培養(yǎng)液的1/3。培養(yǎng)至第7 天，神經(jīng)元已經(jīng)基本上發(fā)育成熟。

1.2.2建立細胞OGD/R損傷模型 參照文獻方法[7]，將原代海馬神經(jīng)元細胞正常培養(yǎng)時的完全培養(yǎng)基換為無血清無糖的平衡液(139 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、0.5 mmol/L MgCl2、1.0 mmol/L CaCl2、5 mmol/L HEPES，pH 7.4)，細胞置于缺氧小室中，通入95% N2+5% CO2氣體10 min 以驅(qū)除小室內(nèi)的氧氣，隨后將缺氧小室放入 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h 進行氧糖剝奪處理，然后用完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)來進行復氧復糖。

1.2.3實驗分組及處理 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)已經(jīng)基本發(fā)育成熟，對能量缺乏敏感。將細胞隨機分為3組： 對照組(CON組)，原代海馬神經(jīng)元細胞置于培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；氧糖剝奪/復氧組(OGD/R組)，將原代海馬神經(jīng)元細胞進行1.5 h氧糖剝奪和24 h復氧復糖處理；七氟烷后處理組(OGD/R+SEVO組)，原代海馬神經(jīng)元細胞進行氧糖剝奪處理后，缺氧小室內(nèi)預充濃度2.4%七氟烷6 min，然后密閉缺氧小室培養(yǎng)1 h ，后置于37 ℃, 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)23 h。

1.2.4檢測細胞LDH活性 完成以上分組及處理后，每組各取40 μl細胞培養(yǎng)上清液，嚴格按照LDH試劑盒說明書操作，利用酶標儀于波長450 nm處測定各孔吸光度值，然后根據(jù)公式計算各組培養(yǎng)液中LDH活性，以反映神經(jīng)元的損傷程度。

1.2.5MitoSOX染色 培養(yǎng)細胞經(jīng)處理后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)洗滌，在培養(yǎng)皿中加入MitoSOX與培養(yǎng)基混合物，37 ℃ 黑暗條件下孵育20 min。用PBS洗滌2次，將爬片撈出，用抗淬滅劑封片后固定至載玻片，用熒光倒置顯微鏡獲得圖像，統(tǒng)計熒光強度，以其反映線粒體活性氧水平。

1.2.6TUNEL染色 用PBS洗滌兩次爬片，在樣品上加入50 μl TUNEL反應混合物。為了確保TUNEL反應混合物在細胞單層間均勻擴散，并避免蒸發(fā)損失，樣品在孵化過程中應覆蓋副膜。在37 ℃黑暗條件下，在加濕氣氛中孵育60 min。用PBS洗滌玻片3次。采用共聚焦顯微鏡獲得圖像。

1.2.7免疫熒光 處理結束后的細胞用PBS沖洗，使用4%多聚甲醛固定細胞形態(tài)10 min，使用含有0.1%Triton X-100和1%牛血清白蛋白的PBS溶液通透并封閉細胞120 min，4 ℃過夜孵育一抗：兔抗LC3B (1 ∶200)。細胞在室溫下與相應的二抗孵育2 h。PBS洗滌后，用含細胞核標記物(DAPI)的抗淬滅劑封片后，指甲油將爬片固定至載玻片，采用共聚焦顯微鏡獲得圖像。

1.2.8Western blot 取處理結束后的原代海馬神經(jīng)元加入RIPA裂解液充分反應30 min,13 200 r/min離心30 min后取上清液，檢測各組細胞蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃煮10 min。 蛋白樣品用SDS-PAGE電泳分離，轉膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h, 含Tris緩沖液(TBST)洗滌2次，加一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后用ECL化學發(fā)光法檢測蛋白表達，采用Image J軟件計算目的蛋白與內(nèi)參灰度值。

2 結果

2.1 七氟烷后處理對原代海馬神經(jīng)元LDH釋放的影響與CON組相比，OGD/R組原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)液中LDH活性增加(F=23.12,P<0.01)；與OGD/R組相比，OGD/R+SEVO組LDH活性降低(F=15.30,P<0.05)。見圖1。

圖1 七氟烷后處理對原代海馬神經(jīng)元LDH釋放的影響a: CON組; b: OGD/R組; c: OGD/R+SEVO組; 與CON組比較：**P<0.01；與OGD/R組比較：#P<0.05

2.2 七氟烷后處理對原代海馬神經(jīng)元氧化應激的影響與CON組相比，OGD/R組線粒體活性氧增多(F=24.41,P<0.01)；與 OGD/R組相比，OGD/R+SEVO組線粒體活性氧減少(F=17.38,P<0.05)。見圖2。

圖2 七氟烷后處理對原代海馬神經(jīng)元線粒體活性氧的影響a: CON組; b: OGD/R組; c: OGD/R+SEVO組;與CON組比較：**P<0.01；與OGD/R組比較：#P<0.05

2.3 七氟烷后處理對原代海馬神經(jīng)元細胞凋亡的影響與CON組相比，OGD/R組TUNEL陽性細胞數(shù)量和cleaved caspase-3表達量增多；與 OGD/R組相比，OGD/R+SEVO組TUNEL陽性細胞數(shù)量和cleaved caspase-3表達量減少。見圖3。

圖3 TUNEL法檢測七氟烷后處理對原代海馬神經(jīng)元凋亡的影響A：Merge ×200；B：TUNEL ×600；C：cleaved caspase-3 ×600；D：Merge ×600

2.4 七氟烷后處理對原代海馬神經(jīng)元細胞自噬的影響采用免疫熒光染色檢測原代海馬神經(jīng)元細胞LC3B的表達水平。LC3B蛋白熒光染色結果如圖4所示，與CON組相比，OGD/R組LC3B蛋白的表達增多(F=6.97,P<0.01)；與OGD/R組相比，OGD/R+SEVO組LC3B蛋白減少(F=4.74,P<0.05)。用Western blot檢測細胞PINK1和Parkin蛋白表達，結果如圖 5所示，與CON組相比，OGD/R 組PINK1的表達增多(F=19.30,P<0.001)，Parkin的表達增多(F=5.26,P<0.05)；與OGD/R 組相比，OGD/R+SEVO組PINK1的表達減少(F=14.80,P<0.01)，Parkin 的表達也降低(F=5.65,P<0.05)。

圖4 七氟烷后處理對原代海馬神經(jīng)元LC3B蛋白表達的影響A：免疫熒光法檢測LC3B ×120；B：原代海馬神經(jīng)元中LC3B的表達變化；a: CON組；b：OGD/R組；c：OGD/R+SEVO組；與CON組比較：**P<0.01；與OGD/R組比較：#P<0.05

圖5 七氟烷后處理對原代海馬神經(jīng)元PINK1、Parkin蛋白的影響A：Western blot檢測PINK1、Parkin；B：原代海馬神經(jīng)元中PINK1、Parkin的表達變化；a：CON組；b：OGD/R組；c：OGD/R+SEVO組；與CON組比較：*P<0.05，***P<0.001；與OGD/R組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

腦組織尤其海馬區(qū)域因供能方式單一對能量缺乏非常敏感，極易因缺血再灌注受損。腦缺血再灌注的潛在病理改變與炎癥、氧化應激、自噬密切相關，這些改變最終可導致細胞凋亡、壞死。臨床上，麻醉和手術中遇到的失血性休克與復蘇事件非常常見，故找到一種有效且切實可行的方法來減輕CIRI具有非常重要的臨床意義。

課題組前期研究[8]表明2.4%七氟烷后處理可通過抑制細胞凋亡改善大鼠失血性休克和復蘇損傷后的空間學習和記憶障礙。有研究[9]表明七氟烷后處理可以減輕HT22細胞OGD/R損傷及凋亡程度。故研究采用(18±0.5)d孕鼠子宮內(nèi)胎鼠進行體外原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，其對氧糖剝奪敏感性高[10]。對培養(yǎng)7 d的原代海馬神經(jīng)元進行OGD/R處理，以此模擬體內(nèi)腦缺血再灌注過程。本研究通過此體外模型進行七氟烷保護作用機制的驗證與探索。OGD/R處理后神經(jīng)元LDH釋放及凋亡細胞數(shù)量均增加，說明OGD/R模型建立成功。經(jīng)過2.4%的七氟烷處理后LDH釋放減少，證實采用的七氟烷后處理可減輕OGD/R誘導的細胞損傷。在實驗中七氟烷后處理可以降低OGD/R誘導的神經(jīng)元線粒體活性氧的生成，降低神經(jīng)元氧化應激水平，改善線粒體功能。TUNEL和cleaved caspase-3染色證明七氟烷后處理可以減輕OGD/R誘導的細胞凋亡，改善凋亡早期的DNA斷裂。此次體外實驗證實七氟烷后處理可以減少OGD/R后的細胞損傷和凋亡，改善線粒體損傷。

目前越來越多的研究關注自噬在缺血/再灌注中的病理生理過程。自噬作為一種機體自我防御的機制，在缺血再灌注誘導的腦損傷中起著重要作用。在體外氧糖剝奪條件下，自噬是通過自噬體包裹損壞的蛋白及細胞器，將其送入溶酶體降解，提高自噬水平從而保護細胞免受損傷。有體外研究[11]證明，七氟烷后處理通過減少自噬體形成，增加自噬體的清除率而有助于細胞保護。LC3B是哺乳動物細胞中常見的自噬小體的標志蛋白。有研究[12]表明細胞在能量底物缺乏的情況下，會產(chǎn)生過度自噬的激活。本研究中OGD/R處理后神經(jīng)元LC3B表達增多，神經(jīng)元自噬過度激活。而七氟烷后處理可以減輕OGD/R所致的過度自噬。在細胞發(fā)生自噬的過程中，多種途徑被激活發(fā)揮作用。PINK1/Parkin可以通過對受損線粒體的識別來啟動及擴大自噬信號，是目前較公認的自噬途徑,被廣泛用來評估自噬水平[13]。本研究表明，OGD/R處理后神經(jīng)元PINK1、Parkin蛋白表達量增多，而七氟烷處理后這兩種蛋白表達量降低，證明七氟烷后處理可以減輕OGD/R所致的過度自噬，且這種作用可能與PINK1/Parkin通路有關。

綜上，研究表明七氟烷后處理可以通過減少OGD/R誘導的細胞過度自噬、減輕氧化應激、減少凋亡等途徑來保護原代海馬神經(jīng)元，且降低自噬的機制可能與PINK1/Parkin通路有關。該研究證實了七氟烷后處理對CIRI中神經(jīng)元的保護作用，探討了七氟烷后處理對CIRI中神經(jīng)元自噬的影響。但該研究只初步探討了可能的分子機制，沒有應用PINK1/Parkin通路抑制劑進行進一步證明，需在后續(xù)的研究中進一步深入研究其具體機制，為臨床治療CIRI提供潛在的分子靶點。