發(fā)酵乳中乳酸菌的選擇性計(jì)數(shù)及分離鑒定

謝九艷，趙婷，高逸，辛迪，馮會(huì)粉，李宏，姚粟*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)2(中國合格評(píng)定國家認(rèn)可中心，北京，100062)

發(fā)酵乳是以生牛(羊)乳或乳粉為原料，經(jīng)殺菌、發(fā)酵后制成的pH值降低的產(chǎn)品。與傳統(tǒng)發(fā)酵不同，發(fā)酵乳通過添加嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種等乳酸菌作為發(fā)酵劑加快發(fā)酵乳的發(fā)酵過程[1]。乳酸菌對(duì)人體的健康有很多益處，有助于增加腸道微生物的定植，治療和預(yù)防腹瀉、緩解便秘、增強(qiáng)人體的的免疫力等[2-3]，但是乳酸菌需要達(dá)到一定數(shù)量才能起到保健作用，因此發(fā)酵乳中的活菌數(shù)尤其重要。為保證足夠數(shù)量活的益生菌到達(dá)腸道中，GB 19302、ISO 27205等國內(nèi)外相關(guān)機(jī)構(gòu)規(guī)定，發(fā)酵乳中益生菌的數(shù)量不得少于106CFU/mL[4]。近年來發(fā)酵乳產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，為提升發(fā)酵乳的品質(zhì)，乳桿菌、雙歧桿菌等益生菌加入發(fā)酵乳中以增加產(chǎn)品的芳香味道和保健功能等[1]，因此需要簡單、可靠的方法來確保商業(yè)發(fā)酵乳中發(fā)酵劑微生物和功能性微生物的含量，以保證產(chǎn)品的質(zhì)量。

目前對(duì)于發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)的檢測主要包括分子生物學(xué)定量分析方法、丙二醇甲醚醋酸酯/疊氮溴化乙錠結(jié)合實(shí)時(shí)定量等非培養(yǎng)方法，以及傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法。非培養(yǎng)方法是以乳酸菌的基因組核酸序列或細(xì)胞中的活菌數(shù)為基礎(chǔ)的鑒別方法，往往對(duì)儀器設(shè)備具有較高的要求[5]。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是基于乳酸菌的理化特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)乳酸菌的選擇性分離，操作簡便、設(shè)備依賴度低，適于廣泛推廣應(yīng)用[3-6]。但是目前傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，往往存在培養(yǎng)基選擇性差、計(jì)數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確等問題。因此根據(jù)不同乳酸菌的特性優(yōu)化選擇性培養(yǎng)基，結(jié)合菌種鑒定技術(shù)，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵乳中乳酸菌的種水平活菌計(jì)數(shù)具有重要意義。

本文主要聚焦市售發(fā)酵乳中常用的乳酸菌組合，通過驗(yàn)證和比較國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)中選擇性培養(yǎng)基的選擇性，并采用快速鑒定、形態(tài)學(xué)特征、生理生化和分子生物學(xué)特征等方法確定復(fù)合菌發(fā)酵乳中的不同種類乳酸菌的活菌數(shù)，為復(fù)合菌發(fā)酵乳產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。同時(shí)為政府監(jiān)管、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)制定提供技術(shù)支撐，對(duì)乳酸菌在乳品行業(yè)更加安全和廣泛的應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵乳產(chǎn)品

3種代表性的不同品牌發(fā)酵乳產(chǎn)品A、B、C購于北京大型超市，產(chǎn)品中標(biāo)識(shí)菌株類別及活菌數(shù)如下：

樣品1：品牌A(標(biāo)識(shí)：保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌，干酪乳桿菌，乳酸菌活菌數(shù)≥1×106CFU/g);

樣品2：品牌B (標(biāo)識(shí)：動(dòng)物雙歧桿菌BB-12，嗜熱鏈球菌，德氏乳桿菌保加利亞亞種，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌總數(shù)1×106CFU/g);

樣品3：品牌C(標(biāo)識(shí)：乳雙歧桿菌BL99，嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌，乳雙歧桿菌的≥1×106CFU/g)。

1.2 試劑與儀器

M17培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)股份有限公司；Chalmers(MC)培養(yǎng)基、De Man Rogosa Sharpe(MRS)培養(yǎng)基(BD)、莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；萬古霉素鹽酸鹽，國藥集團(tuán)。

拍擊式均質(zhì)器，法國 interscience 公司；pH計(jì)，梅特勒托利多儀器有限公司；厭氧產(chǎn)氣袋，日本三菱 MGC。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 選擇性培養(yǎng)基活菌計(jì)數(shù)

無菌操作稱取25 g樣品,置于225 mL生理鹽水中，充分振蕩混勻，制成1∶10(g∶mL)樣品勻液。用微量移液器吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于裝有9 mL生理鹽水的無菌試管，振搖試管使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。按上述操作順序，依次重復(fù)。選擇2～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，將冷卻至48 ℃的培養(yǎng)基傾注入平皿內(nèi)。

參照GB 4789.35—2016對(duì)3種樣品中的乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，每種樣品分別采用MC培養(yǎng)基、改良MRS培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)。同時(shí)，根據(jù)樣品標(biāo)識(shí)中的菌種類別選用適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行菌種的選擇性分離培養(yǎng)和計(jì)數(shù)，選擇性培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件如表1所示。

表1 選擇性培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 1 Selective medium and culture conditions

1.3.2 菌株分離鑒定

從選擇性培養(yǎng)基上隨機(jī)選取5個(gè)單菌落，通過平板劃線法進(jìn)行分離純化，獲得純菌株。

1.3.2.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)快速鑒定

選取新鮮培養(yǎng)的分離株到裝有300 μL超純水的離心管中，形成菌懸液；加入無水乙醇，渦旋離心取沉淀；加入50 μL 70%(體積分?jǐn)?shù))的甲酸水溶液，渦旋混合均勻；加入50 μL乙腈，通過移液器反復(fù)吹打使其混合均勻；離心取上清液加入到靶板孔中，室溫下晾干；滴加 α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)基質(zhì)溶液室溫下晾干，形成結(jié)晶；將點(diǎn)好樣品的靶板放入儀器內(nèi)，微生物鑒定標(biāo)配方法MBT_FC，上機(jī)測試，并采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.3.2.2 多相鑒定

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(OMEGA公司)提取分離株的基因組DNA。以基因組DNA為模板，利用通用引物27F和1492R對(duì)菌株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系按照PCR Mixture使用說明進(jìn)行配制(Tiangen公司)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。利用特異性引物對(duì)groEL基因和groEL基因序列進(jìn)行擴(kuò)增[8]，PCR反應(yīng)體系同上。擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，將序列結(jié)果遞交到EzBioCloud和NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析[9]。采用MEGA 4軟件中的Clustal功能對(duì)分離株與近緣種菌株的16S rRNA基因、pheS基因或groEL基因進(jìn)行多序列比對(duì)，并使用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育及分子進(jìn)化分析[10]。

將分離得到9個(gè)分離株接種到適宜培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一定時(shí)間后，收集新鮮菌體，加入2.5% 戊二醛4 ℃固定過夜。離心收集菌體，100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)漂洗3次。30%、50%、70%、85%、95%乙醇梯度脫水后100%乙醇脫水3次。干燥后用噴金—離子濺射儀BAL-TEC SCD005進(jìn)行噴金，使用掃描電鏡Hitachi SU8010進(jìn)行菌體形態(tài)觀察[11]。使用VITEK 2 Compact鑒定系統(tǒng)對(duì)分離株的底物利用特征進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性培養(yǎng)基和GB 4789.35的活菌計(jì)數(shù)

根據(jù)發(fā)酵乳上的標(biāo)識(shí)，依據(jù)表1中選擇性培養(yǎng)基和GB 4789.35對(duì)3種品牌的發(fā)酵乳進(jìn)行選擇性計(jì)數(shù)，結(jié)果如表2所示。GB 4789.35對(duì)3個(gè)樣品的乳酸菌總數(shù)的計(jì)數(shù)結(jié)果均高于選擇性培養(yǎng)基。其中選擇性培養(yǎng)基M17對(duì)嗜熱鏈球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果均高于GB 4789.35中的MC培養(yǎng)基。

在樣品1中，選擇性培養(yǎng)基MRS(含50 μg/mL的萬古霉素)和酸化MRS的計(jì)數(shù)結(jié)果之和為樣品中的乳桿菌總數(shù)，GB 4789.35中MRS培養(yǎng)基的計(jì)數(shù)結(jié)果為乳桿菌總數(shù)。MRS培養(yǎng)基的計(jì)數(shù)結(jié)果遠(yuǎn)高于選擇性培養(yǎng)基。在樣品2和樣品3中，GB 4789.35的MRS培養(yǎng)基主要用于乳桿菌和雙歧桿菌總數(shù)的計(jì)數(shù)。本文采用的選擇性培養(yǎng)基酸化MRS和雙歧桿菌培養(yǎng)基同樣用于上述兩種菌種的計(jì)數(shù)，MRS培養(yǎng)基的計(jì)數(shù)結(jié)果均高于選擇性培養(yǎng)基。

表2 選擇性培養(yǎng)基和GB 4789.35—2016的活菌計(jì)數(shù)及快速鑒定結(jié)果Table 2 The viable counting and rapid identification result of selective medium and GB 4789.35—2016

2.2 菌株分離鑒定

2.2.1 MALDI-TOF快速鑒定

從每種計(jì)數(shù)平板上隨機(jī)挑選5個(gè)菌落，進(jìn)行分離純化后，通過MALDI-TOF快速鑒定，確定培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)菌種的選擇性，結(jié)果如表2所示。

在樣品1中，M17和MRS(含50 μg/mL的萬古霉素)對(duì)樣品中嗜熱鏈球菌和干酪乳桿菌具有很好的選擇性，隨機(jī)挑選的5個(gè)菌落經(jīng)MALDI-TOF鑒定，結(jié)果均為嗜熱鏈球菌和干酪乳桿菌。表明在發(fā)酵乳中含有干酪乳桿菌的情況下，酸化MRS培養(yǎng)基上對(duì)德氏乳桿菌的選擇性較差。

樣品2和樣品3中M17和雙歧桿菌培養(yǎng)基對(duì)嗜熱鏈球菌和動(dòng)物雙歧桿菌的選擇性良好。在兩種培養(yǎng)基上隨機(jī)挑選的5個(gè)菌落經(jīng)MALDI-TOF鑒定，結(jié)果均為目標(biāo)菌種。但是酸化MRS培養(yǎng)基對(duì)德氏乳桿菌的選擇性在兩種樣品中具有一定的差異。樣品2的酸化MRS培養(yǎng)基上隨機(jī)挑選的5個(gè)菌落，經(jīng)鑒定均為動(dòng)物雙歧桿菌，樣品3隨機(jī)挑選的菌落鑒定結(jié)果均為德氏乳桿菌。這種差異性可能與菌種的數(shù)量有關(guān)。

GB 4789.35中的培養(yǎng)基經(jīng)過MALDI-TOF快速鑒定，結(jié)果顯示MC培養(yǎng)基和改良MRS培養(yǎng)基對(duì)嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌具有良好的選擇性。但在3個(gè)樣品中，MRS培養(yǎng)基均有嗜熱鏈球菌的生長。因此，GB 4789.35方法對(duì)乳桿菌和雙歧桿菌計(jì)數(shù)的結(jié)果均高于選擇性培養(yǎng)基，使得GB 4789.35檢測的乳酸菌總數(shù)較實(shí)際結(jié)果偏高。

2.2.2 復(fù)合菌發(fā)酵乳中分離株的多相鑒定

選取9個(gè)分離株進(jìn)行多相鑒定，發(fā)酵乳中分離株的鑒定結(jié)果均與發(fā)酵乳的標(biāo)識(shí)一致(表3)。動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)曾用名為乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)[12]；德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)的曾用名為保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)[13]。干酪乳桿菌(Lactobacillucasei)在2020年其分類學(xué)地位變更為干酪乳酪桿菌Lacticaseibacilluscasei[14]。德氏乳桿菌保加利亞亞種(L.delbrueckiisubsp.bulgaricus)通過多相鑒定只能鑒定到種水平，需進(jìn)一步通過全基因組測序及平均核苷酸一致性等方法鑒定到亞種水平。

表3 發(fā)酵乳分離株鑒定結(jié)果Table 3 The identification results of isolates from the fermented milk

2.2.2.1 形態(tài)學(xué)特征觀察

對(duì)9個(gè)分離株進(jìn)行掃描電鏡觀察，其掃描電鏡的形態(tài)特征如圖1所示。M17培養(yǎng)基上獲得的分離株的菌體形態(tài)特征為橢球形，單個(gè)、成對(duì)或呈鏈狀排列，符合嗜熱鏈球菌的典型形態(tài)特征；MRS(含50 μg/mL的萬古霉素)培養(yǎng)基上的分離株的菌體形態(tài)特征為短桿狀，單個(gè)或成對(duì)排列；雙歧桿菌培養(yǎng)基分離株的菌體形態(tài)特征為不規(guī)則桿狀，兩端稍膨大；酸化MRS培養(yǎng)基分離株的菌體形態(tài)特征包括兩種，在樣品2和樣品3中呈長桿狀，在樣品1中呈彎曲桿狀，單個(gè)或成對(duì)排列。

a-M-1；b-M-2；c-M-3；d-V-1；e-B-1；f-B-2；g-A-1；h-A-2；i-A-3圖1 分離株的掃描電鏡圖Fig.1 The scanning electron microscope of the isolated strains

2.2.2.2 生理生化特性

通過VITEK2 compact對(duì)9個(gè)分離株進(jìn)行生理生化檢測，檢測結(jié)果如表4所示。

表4 分離株的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristic of isolated strains

2.2.2.3 16S rRNA基因及功能基因序列鑒定

對(duì)9株分離株進(jìn)行分子水平鑒定，擴(kuò)增16S rDNA和相關(guān)持家基因的序列，并進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。分離株B-1和B-2，通過16S rDNA 和groEL基因序列的比對(duì)，和B.animalissubsp.lactis的相似性高達(dá)100%；分離株A-1、A-2、A-3，通過16S rDNA序列比對(duì)，和L.delbrueckiisubsp.bulgaricus、Lactobacillusdelbrueckiisubsp.sunkii的序列相似性均高于99%；分離株M-1、M-2、M-3，通過16S rDNA 和pheS基因進(jìn)行序列比對(duì)，和S.thermophilus的同源性為99.4%；分離株V-1，通過16S rDNA和pheS基因序列比對(duì)，和L.casei的序列相似性為100%。

a、b-雙歧桿菌培養(yǎng)基分離株的16S rRNA基因和groEL基因；c-酸化MRS培養(yǎng)基分離株的16S rRNA基因；d、e-M17培養(yǎng)基分離株的16S rRNA 基因和PheS基因;f、g-MRS培養(yǎng)基(含50 μg/mL的萬古霉素)分離株16S rRNA基因和PheS基因圖2 分離株與相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic trees of isolated strain and other related species 注：采用MEGA5.0軟件，鄰位連接法顯示菌株與相關(guān)模式種系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次的相似度重復(fù)計(jì)算，圖中發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)只顯示Bootstrap值 >50%數(shù)值，“T”表示模式菌株

2.3 選擇性培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)菌種的選擇性

本研究中，嗜熱鏈球菌的選擇性計(jì)數(shù)培養(yǎng)基M17和MC對(duì)嗜熱鏈球菌都具有良好的選擇性。但計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，3個(gè)樣品中M17培養(yǎng)基的計(jì)數(shù)結(jié)果均高于MC培養(yǎng)基。M17培養(yǎng)基的營養(yǎng)豐富，有利于發(fā)酵乳中嗜熱鏈球菌的復(fù)蘇，其中高濃度的甘油磷酸鈉不僅具有良好的緩沖作用，還能抑制發(fā)酵乳中其他乳酸菌如保加利亞乳桿菌的生長[15-16]，MC培養(yǎng)基以碳酸鈣作為緩沖劑，緩沖能力較弱，粉末容易沉淀或結(jié)塊，會(huì)影響菌落生長[17]。國際標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)多數(shù)推薦采用M17培養(yǎng)基對(duì)嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)[18]。

含有萬古霉素的MRS培養(yǎng)基對(duì)干酪乳桿菌具有良好的選擇性。干酪乳桿菌的選擇性計(jì)數(shù)主要根據(jù)其理化特性設(shè)計(jì)選擇性培養(yǎng)基，如劉愛萍等[6]研究表明以D-核糖為唯一碳源的培養(yǎng)基對(duì)干酪乳桿菌具有良好的選擇性。本文依據(jù)干酪乳桿菌的萬古霉素固有耐藥實(shí)現(xiàn)對(duì)干酪乳桿菌選擇性的計(jì)數(shù)。該選擇性培養(yǎng)基的應(yīng)用前提為發(fā)酵乳中含有嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌和干酪乳桿菌。當(dāng)發(fā)酵乳中含有其他萬古霉素固有耐藥的乳桿菌，如發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌[19]，該方法則不適用。

酸化MRS培養(yǎng)基對(duì)不同發(fā)酵乳中德氏乳桿菌的計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性存在差異，該培養(yǎng)基ISO 7889中規(guī)定對(duì)德氏乳桿菌保加利亞亞種的分離計(jì)數(shù)，該方法適用于發(fā)酵乳中只含有嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種，不具有普遍性。嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和部分雙歧桿菌等乳酸菌在酸化MRS培養(yǎng)基上也可以較好的生長嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和部分雙歧桿菌等在酸化MRS培養(yǎng)基上也可以較好的生長[20]。為更好的選擇性分離德氏乳桿菌保加利亞亞種，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可通過提高乙酸鈉的含量、采用改良RCM培養(yǎng)基等方法提高計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性[21-22]。

GB 4789.35—2016中規(guī)定，MRS培養(yǎng)基用于測定雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的總數(shù)，嗜熱鏈球菌的總數(shù)采用MC培養(yǎng)基。3個(gè)樣品的MRS培養(yǎng)基上均檢測到嗜熱鏈球菌，MRS培養(yǎng)基中的蛋白胨、牛肉粉、酵母粉和葡萄糖，可以為嗜熱鏈球菌的生長提供碳源、氮源等相關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)，不能選擇性的計(jì)數(shù)乳桿菌和雙歧桿菌。俞漪等[5]提出可通過形態(tài)特征進(jìn)行乳桿菌和厭氧菌的區(qū)分，提出在厭氧培養(yǎng)下，乳桿菌呈乳白色，較大，嗜熱鏈球菌呈半透明狀，較小，在乳酸菌計(jì)數(shù)的過程中可通過菌落形態(tài)特征實(shí)現(xiàn)乳桿菌計(jì)數(shù)。

3 結(jié)論

本研究以3種復(fù)合發(fā)酵乳為研究對(duì)象，采用不同的選擇性培養(yǎng)基，結(jié)合MALDI-TOF MS快速鑒定和細(xì)菌多相鑒定技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵乳中不同乳酸菌的選擇性計(jì)數(shù)及種水平的精準(zhǔn)鑒定。研究表明M17培養(yǎng)基和雙歧桿菌培養(yǎng)基對(duì)嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌具有良好的選擇性，可以對(duì)實(shí)現(xiàn)復(fù)合發(fā)酵乳產(chǎn)品中乳酸菌的精準(zhǔn)計(jì)數(shù)。德氏乳桿菌的選擇性計(jì)數(shù)較難，需進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基或采用分子生物學(xué)方法等進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。本研究中選擇性培養(yǎng)基應(yīng)用前提為發(fā)酵乳產(chǎn)品的菌種種類標(biāo)識(shí)范圍。若乳酸菌種類組合變化，需對(duì)培養(yǎng)基的選擇性進(jìn)行重新評(píng)估。本文所研究的選擇性計(jì)數(shù)培養(yǎng)基以及培養(yǎng)基選擇性的評(píng)估方法，為完善復(fù)合發(fā)酵乳產(chǎn)品的質(zhì)量控制和國家標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供技術(shù)支撐，助力提升發(fā)酵乳產(chǎn)品微生物質(zhì)量控制及市場監(jiān)管水平。