紅景天膠囊調(diào)控BDNF信號通路的抗抑郁作用機制研究*

高麗麗 吳成翰 廖遠(yuǎn)生 張 勝 趙 堅

抑郁癥是一種主要表現(xiàn)為持久的情緒低落的精神類疾病，其已成為全球突出的健康問題[1]，對中國民眾健康及社會危害正日益凸顯。抑郁癥的病因及發(fā)病機制復(fù)雜，至今仍未完全闡明，有待進(jìn)一步深入研究。因此，探討抑郁癥的發(fā)病機制，尋找更加有效的治療藥物，對防治抑郁癥的發(fā)生發(fā)展具有重要的意義。抑郁癥發(fā)病機制復(fù)雜是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)抗抑郁療效不理想、易復(fù)發(fā)和服藥周期長的主要原因。故對于不良作用小的中成藥開發(fā)與研究成為目前的熱點[2]。中藥抗抑郁作用具有多層次、多靶點的特點，被廣泛用于抑郁癥的治療。

抑郁癥屬于中醫(yī)“郁證”范疇，郁證起于七情刺激，繼而由氣及血，氣血不足，心神失養(yǎng)，腦神不利而發(fā)為郁病。心主血，心藏神，氣血調(diào)和，則心神安定，紅景天益氣養(yǎng)心在抑郁癥的中藥組方中屬于高頻藥物。胡國恒教授自擬腎腦復(fù)元湯，方中重用紅景天，對卒中后抑郁起到了很好的抗抑郁作用[3]。中成藥心腦欣膠囊、利舒康膠囊是抑郁癥的有效藥物，兩方的君藥均為紅景天[4，5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)以紅景天苷為主要成分的紅景天膠囊運用于抑郁癥臨床治療已獲得顯著的療效，其不良作用也并未因劑量增大而增多[6，7]。但目前對于紅景天膠囊抗抑郁的作用機制尚未見相關(guān)報道。

本研究選用慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激抑郁大鼠模型，給予紅景天膠囊干預(yù)，基于“心主神明，腦為元神之府”，從腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)信號通路探索其抗抑郁的分子機制，為中醫(yī)藥抗抑郁治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物本研究采用清潔級2～3個月齡(體質(zhì)量180～250 g)健康雄性無特定病原體(Specific pathogen free，SPF)級Sprague Dawley(SD)大鼠。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。實驗步驟和實驗動物的照料均嚴(yán)格按照2006年中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》[8]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。大鼠自由飼養(yǎng)1周后，除正常組以外其余所有大鼠制備慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激抑郁模型(CUMS)。

1.2 藥物紅景天膠囊(西藏高原安生物科技開發(fā)有限公司，0.3 g/粒，批號: 2020301)；舍曲林片(浙江京新藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：50 mg，批號：A20120501)。

1.3 試劑RNAiso Plus(9109)、PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)(RR036A)、SYBR ? Premix Ex TaqTM II(TliRNaseH Plus，RR820A)，大連寶生物工程有限公司。

1.4 儀器Centrifuge TDL-5高速低溫離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；MJ-Mini 48 孔梯度 PCR 儀，美國伯樂公司；Real-Time PCR Syste(StepOnePlus)，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；BW-OF302 曠場實驗視頻分析系統(tǒng)，上海軟隆科技發(fā)展有限公司。

2 方法

2.1 動物分組及給藥隨機取20只健康SD大鼠為正常對照組。將造模成功的80只雄性抑郁癥SD大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為4組，分別為：模型組；舍曲林組；紅景天膠囊低劑量組；紅景天膠囊高劑量組。給藥前用1 ml蒸餾水配制混懸液，給藥劑量按實驗動物與人的體表面積比，人與大鼠等效藥量換算方法計算，大鼠的等效劑量相當(dāng)于人的6倍，灌胃給藥。正常組每日灌服生理鹽水1 ml，模型組每日灌服生理鹽水1 ml，舍曲林組按10 mg/kg制備舍曲林混懸液1 ml，紅景天膠囊低劑量組按30 mg/kg制備紅景天膠囊混懸液1 ml，紅景天膠囊高劑量組按60 mg/kg制備紅景天膠囊混懸液1 ml。以上藥物均每日上午灌服1次,連續(xù)干預(yù)4周。

2.2 造模方法制備CUMS抑郁模型，應(yīng)激刺激包括：束縛2 h，潮濕墊料24 h，禁食24 h，夾尾倒掛30 min，禁水24 h，45 ℃傾斜鼠籠24 h，冰水游泳6 min，明暗顛倒，空籠飼養(yǎng)12 h。正常組不進(jìn)行任何刺激。其余各組進(jìn)行每天隨機不同順序的刺激，共刺激30 d，且不得連續(xù)使用相同順序刺激，同一種刺激順序使用次數(shù)要小于3次，實現(xiàn)不可預(yù)知性的刺激方式。CUMS處理完成后，獲得80只抑郁癥大鼠。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 糖水偏愛率實驗實驗前，先訓(xùn)練大鼠進(jìn)行適應(yīng)性含糖飲水。第1天，放2瓶均裝有1%的蔗糖水；第2天，1瓶裝有1%的蔗糖水，1瓶純水；最后1 d，將蔗糖水的瓶子和純水的瓶子調(diào)換位置，減少干擾，持續(xù)12 h；接著，再禁食禁水持續(xù)12 h后，測定動物糖水偏好實驗。將1瓶100 ml的1% 蔗糖水與1瓶100 ml純水置于每籠大鼠前，觀察12 h，對2瓶水進(jìn)行稱量，記錄糖水消耗體積、純水消耗體積，得出大鼠糖水偏好指數(shù)。糖水偏好率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。造模前后和給藥4周后各進(jìn)行1次糖水偏好實驗，計算大鼠糖水偏好率。

2.3.2 曠場實驗采用四周及底面全部為黑色的無蓋方箱，其底面分成16個20 cm×20 cm的白線方格。先將大鼠放置于暗箱中，適應(yīng)2 min后，記錄大鼠 5 min 內(nèi)的活動情況。觀察指標(biāo)：水平運動得分:以大鼠穿越底面格數(shù)(至少3爪進(jìn)入方格)為水平運動得分，每格得1分；垂直運動:以大鼠前兩肢直立次數(shù)為垂直運動得分，每直立1次得1分。測定后用酒精消毒擦拭箱子內(nèi)部，避免氣味殘留。記錄造模前后和給藥4周后各組大鼠的曠場得分情況。

2.3.3 強迫游泳使用圓柱形玻璃缸測定強迫游泳實驗，玻璃缸高20 cm，直徑14 cm，深度約10 cm。實驗前1 d，先對大鼠進(jìn)行游泳訓(xùn)練，隨后吹干放回籠中，第2天再進(jìn)行正式實驗。實驗時大鼠在玻璃缸中游泳6 min，記錄最后5 min內(nèi)大鼠的累積不動時間。不動時間判定為大鼠僅有細(xì)小肢體動作，無掙扎動作，頭部浮于水面。記錄造模前后和給藥4周后各進(jìn)行強迫游泳試驗。

2.3.4 血清CREB BDNF表達(dá)水平測定血清樣本收集選取股動脈方式采集大鼠血液，置于EP管中，靜置30 min，在4 ℃，3500 r/min 離心15 min，分離血清并分裝，置于-80 ℃冰箱保存。

2.3.5 海馬組織中CREB BDNF GSK-3β mRNA表達(dá)水平測定按照 SYBR ? Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseHPlus)試劑盒說明書步驟完成qRT-PCR 實驗，以明確大鼠海馬組織中CREB、BDNF和GSK-3β的mRNA 表達(dá)水平，引物序列見表 1，在PCR 管中加入反應(yīng)液，渦旋離心，再將反應(yīng)液置于管底；設(shè)置的擴增程序為95 ℃、30 s，1個循環(huán)；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s；40個循環(huán)；95 ℃、15 s；60 ℃、60 s；95 ℃、15 s。應(yīng)用 Step One Software V 2.1 分析軟件調(diào)整基線和閾值后，分析反應(yīng)板數(shù)據(jù)，得出每個樣品的 Ct值，與對照組比較后，取2ΔΔCt值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

表1 PCR 引物序列

3 結(jié)果

3.1 對抑郁大鼠糖水偏愛率的影響造模前各組糖水偏愛率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。造模后，與正常組比較，各組抑郁大鼠糖水偏愛率顯著降低。藥物干預(yù)后，與模型組相比，治療4周后紅景天膠囊低劑量組、舍曲林組及紅景天膠囊高劑量組的糖水偏愛率均增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，紅景天膠囊干預(yù)組與舍曲林組作用相當(dāng)。見表2。

表2 紅景天膠囊對各組大鼠糖水偏愛率的影響 (只，

3.2 對抑郁大鼠曠場實驗運動得分的影響造模前各組大鼠曠場實驗運動得分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后，與正常組比較，各組抑郁大鼠曠場實驗水平運動得分顯著降低，垂直運動得分也顯著降低。藥物干預(yù)后，與模型組比較，治療4周末，舍曲林組、紅景天膠囊低劑量及高劑量組水平運動及垂直運動得分均上升。紅景天膠囊干預(yù)組與舍曲林組作用相當(dāng)。見表3。

表3 紅景天膠囊對大鼠曠場實驗運動得分的影響 (只，

3.3 對抑郁大鼠強迫游泳不動時間的影響造模前各組大鼠強迫游泳實驗得分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，造模后，與正常組比較，各組抑郁大鼠強迫游泳實驗不動時間顯著增高。藥物干預(yù)后，與模型組比較，治療2周后，舍曲林組、紅景天膠囊低劑量組和紅景天膠囊高劑量組大鼠強迫游泳不動時間明顯減少，紅景天膠囊干預(yù)組與舍曲林組作用相當(dāng)。見表4。

表4 紅景天膠囊對各組大鼠強迫游泳不動時間結(jié)果

3.4 對抑郁大鼠血清BDNF CREB GSK-3β的影響經(jīng)藥物干預(yù)后，與模型組相比，紅景天膠囊低劑量組、紅景天膠囊高劑量組及舍曲林組的血清BDNF、CREB含量均增加，且紅景天膠囊高劑量組增加最為顯著，各藥物干預(yù)組GSK-3β含量均下降，以紅景天膠囊高劑量組下降最為顯著。見表5。

表5 紅景天膠囊對抑郁大鼠血清BDNF CREB的影響

3.5 對抑郁大鼠海馬BDNF CREB GSK-3β mRNA的影響經(jīng)藥物干預(yù)后，與模型組相比，舍曲林組、紅景天膠囊低劑量組及紅景天膠囊高劑量組的BDNF、CREB mRNA表達(dá)均顯著升高，其中以紅景天膠囊高劑量組升高更為明顯。GSK-3β mRNA表達(dá)均顯著下降，以紅景天膠囊高劑量組下降更為顯著。見圖1，表6。

表6 紅景天膠囊對大鼠海馬BDNF CREB GSK-3β mRNA表達(dá)的影響

圖1 各組大鼠海馬組織中BDNF CREB GSK-3β mRNA的表達(dá)

4 討論

紅景天性味：寒，甘、澀。歸經(jīng)：心、肺經(jīng)。臨床上其具有理氣養(yǎng)血、益氣養(yǎng)心、扶正固本、活血化瘀等功效。臨床上多用于氣虛血瘀、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、倦怠氣喘等癥。早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》就提出心是情志活動的重要器官，主宰地位著精神活動，《素問·靈蘭秘典論》曰：“心者,君主之官，神明出焉”，也認(rèn)為心對于精神活動的主宰調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要。雖腦為元神之府，但心神對腦神有重要的支配作用，正如《素問遺篇·本病論》曰：“心為君主之官，神明出焉，神失守位，即神游上丹田，在帝太一帝君泥丸宮下”。心精氣匯聚于腦，支配人的精神行為?，F(xiàn)代研究也證明中醫(yī)學(xué)中“心主神明”實質(zhì)是心臟對“精神-神經(jīng)-內(nèi)分泌-靶器官”的整體概況，體現(xiàn)了中醫(yī)的五臟整體觀念[9]。心臟支配大腦對外界做出反映，并形成意識思維等情感活動[10]。

中醫(yī)臨床實踐也表明，從“心”論治很多精神神志疾病，也取得了良好的效果，這又為心主神明供了臨床實踐的證據(jù)[11]。腦為髓海，髓由精生，精源于五臟六腑之氣血。腦為人體生命活動的中樞，神明之心實質(zhì)就是腦。心主血，上供于腦，故心腦相系，常心腦同治。人的精神、意識和思維活動是大腦對外界事物的反映。因此基于“心主神明、腦為元神之府”，本研究從腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)入路，對紅景天膠囊治療抑郁癥的機制進(jìn)行研究，也為中醫(yī)學(xué)探索益氣養(yǎng)心法治療抑郁癥奠定初步實驗基礎(chǔ)，也為紅景天膠囊的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是體內(nèi)一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有促進(jìn)神經(jīng)元的生長和分化的重要作用，在神經(jīng)元細(xì)胞的生長及功能可塑調(diào)節(jié)作用中發(fā)揮重要作用，影響著中樞神經(jīng)可塑性[12]。研究表明[13]，抑郁小鼠模型的腦內(nèi)BDNF表達(dá)較正常小鼠明顯下降，且經(jīng)抗抑郁藥物治療后BDNF表達(dá)回升。究其機制可能與BDNF相關(guān)信號通路損傷有關(guān)，而此信號通路也是抑郁癥發(fā)病的關(guān)鍵通路[14，15]。BDNF信號系統(tǒng)的啟動程序是受體酪氨酸激酶B(TrkB)的磷酸化，TrkB受體結(jié)合BDNF后可啟動糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)信號通路[16]。GSK-3β信號通路是近年來研究抗抑郁藥作用機制的重要靶標(biāo)，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[17]。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)是重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一，在腦內(nèi)所有細(xì)胞中均有表達(dá)。BDNF與TrkB相結(jié)合，使TrkB磷酸化，從而激活GSK3β途徑，促使BDNF表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子CREB絲氨酸位點磷酸化，最終上調(diào)BDNF的表達(dá)[18]。綜上所述，BDNF/GSK-3β/CREB通路是抑郁癥發(fā)生的關(guān)鍵通路，是抑郁癥機制研究的重點。

通過本實驗研究發(fā)現(xiàn)，紅景天膠囊可有效發(fā)揮抗抑郁的作用，且其通過調(diào)節(jié)BDNF/GSK-3β/CREB通路而發(fā)揮抗抑郁作用，保護(hù)海馬神經(jīng)元的功能,為今后對抗抑郁藥物機制的深入研究奠定理論基礎(chǔ)。