基于CFTR的胞漿內(nèi)第二信使cAMP檢測方法的建立*

吳明達，劉雪瑩，馮劍南，高雪偉，郝 峰，高俊濤

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗學(xué)院，吉林 132013；2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延吉 133002；3.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 132013；4.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 132013)

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)是最大的膜受體家族，其中GPCRs在內(nèi)分泌、神經(jīng)、心血管、感覺和免疫系統(tǒng)功能中發(fā)揮的基礎(chǔ)性作用尤為突出，并與甲狀腺疾病、高血壓或帕金森病等人類流行疾病的發(fā)病機制有關(guān)[1-3]。GPCRs作為臨床藥物研發(fā)的重要靶點，對其激動劑和抑制劑的研究備受關(guān)注，高通量藥物篩選技術(shù)有助于推動GPCRs靶向藥物的深入研究[4]?；贕PCRs信號傳遞過程中效應(yīng)分子改變細胞內(nèi)第二信使的含量與分布,通過對下游第二信使定量檢測以反映GPCRs功能性已經(jīng)成為GPCRs靶向藥物篩選的重要手段。其中cAMP作為胞漿內(nèi)重要的第二信使[5]，可調(diào)控細胞內(nèi)諸多重要的生理過程，如參與細胞的增殖與分化、激素的合成與分泌、基因表達、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)節(jié)突觸傳遞的調(diào)節(jié)等[6]。與其他第二信使不同的是，胞漿內(nèi)cAMP也參與許多病理過程，是治療心臟病、急性白血病、慢性呼吸道疾病、某些腫瘤等疾病的潛在靶點[7,8]。因此，胞漿內(nèi)第二信使cAMP一直是科研領(lǐng)域的研究熱點。

cAMP分子量只有329.21，并且在細胞胞漿中的含量極低，為pmol/L級別，一般的檢測方法信噪比較低，且檢測難度頗大。目前最基本的方法可以分為兩類：一類是利用抗cAMP抗體檢測細胞內(nèi)cAMP與已知濃度的被標記的cAMP之間的競爭水平，該方法是通過不同檢測技術(shù)檢測不同標記物標記的cAMP，包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)、競爭性酶聯(lián)免疫吸附法、放射性免疫分析法等；另一類是基于轉(zhuǎn)錄水平的報告基因檢測模型，即報告基因法。上述方法普遍存在一些問題，例如在檢測時需要細胞破膜，使本來含量極低濃度的cAMP進一步稀釋，并且遭受細胞外環(huán)境的干擾；由于抗體的制備存在批次上差異，使檢測試劑存在非均一性；對相應(yīng)配套的儀器精密度要求十分嚴格，并且信噪比相對較低[9]，并且市售的cAMP檢測試劑盒普遍都造價昂貴?；谝陨蟘AMP檢測方法帶來的不便，本文探索了一種重復(fù)性高，檢測費用低，靈敏性高并且無需對細胞進行破膜處理的檢測方法。

本方法原理如下：當胞漿內(nèi)cAMP濃度升高時，囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)通道開放[10]，可將細胞外I-轉(zhuǎn)運到胞漿內(nèi)，使I-敏感的黃色熒光蛋白的熒光發(fā)生淬滅[11]。通過酶標儀檢測得到熒光淬滅曲線的斜率值來反映通道受cAMP激活開放的程度，間接反映細胞內(nèi)cAMP相對濃度的變化(圖1)。

1 材料與方法

1.1 材料

FRT細胞本實驗室保存；pcDNA3.1由麻彤輝教授饋贈；YFP-H148Q/I152L真核表達載體由本實驗室前期構(gòu)建[12]；Lipofectamine 3000脂質(zhì)體、zeocin抗生素、G418抗生素、ionomycin、calcimycin購自Invitrogen公司；F-12營養(yǎng)培養(yǎng)基、三羥基黃酮(genistein)、歐前胡素(imperatorin)、毛喉素(forskolin)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、Gly H101、CFTRinh -172均購自Sigma公司，放射免疫試劑盒購自上海中醫(yī)藥大學(xué)。

Fig. 1 Principle of the assay of CFTR-based cytosolic second messengercAMP detection

1.2 CFTR真核表達載體的構(gòu)建

將CFTR 和pcDNA3.1載體為模板，進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳，分別用Nhe I和BamH I雙酶切PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。利用T4連接酶將載體pcDNA3.1和目的基因CFTR于4℃連接反應(yīng)12 h。將CFTR- pcDNA3.1進行轉(zhuǎn)化，并提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳后送于上海生工生物公司測序。

1.3 共表達CFTR和YFP-H148Q/I152L細胞模型的構(gòu)建

1.3.1 構(gòu)建共表達CFTR和YFP-H148Q/I152L細胞株 按照Lipofectamine 3000說明書將CFTR質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞(fisher rat thyroid follicular epithelial cells，F(xiàn)RT)中，利用zeocin抗生素進行篩選，兩周后利用倒置熒光顯微鏡觀察，挑取細胞膜上可見綠色熒光的細胞進行有限稀釋，對得到的陽性克隆的細胞株進行擴大培養(yǎng)，經(jīng)過兩次傳代仍表達CFTR的細胞則為穩(wěn)定表達CFTR的FRT大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞株。按照Lipofectamine 3000說明書將YFP-H148Q/I152質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到已穩(wěn)定表達CFTR的FRT細胞中，利用G418抗生素進行篩選，兩周后利用倒置熒光顯微鏡觀察，挑取胞漿中可見綠色熒光且熒光信號較強的細胞進行有限稀釋，對得到的陽性克隆的細胞株進行擴大培養(yǎng)，經(jīng)過兩次傳代仍表達YFP-H148Q/I152的細胞則為穩(wěn)定共表達CFTR-YFP-H148Q/I152L的FRT 細胞株。

1.3.2 流式細胞儀檢測細胞純度 將穩(wěn)定共表達CFTR-YFP-H148Q/I152L的FRT 細胞用胰酶消化，800 g離心5 min，棄上清，加入PBS緩沖液，重懸細胞后上機進行檢測。以未轉(zhuǎn)染的FRT細胞作為陰性對照，選擇FL2通道，激發(fā)光波長488 nm，檢測光波長575 nm，每管收集5×105cells。陰性對照所檢測到的熒光強度范圍進行設(shè)門，該門內(nèi)的細胞表示未轉(zhuǎn)染上的細胞，將大于該范圍的熒光強度表示為轉(zhuǎn)染成功的細胞，計算細胞純度。

1.4 熒光淬滅動力學(xué)實驗鑒定細胞模型的有效性

將培養(yǎng)在黑壁透明底的 96孔板中的穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染CFTR-YFP-H148Q/I152L的FRT細胞分為2組：實驗組和對照組，每組3個復(fù)孔。以含鈣鎂離子的PBS緩沖液洗滌兩組細胞 3次，加入50 μl含鈣鎂PBS緩沖液，向?qū)嶒灲M加入120 μl含有forskolin(CFTR激活劑)的碘化鈉PBS緩沖液，對照組加入CFTRinh -172(CFTR特異性抑制劑)孵育10 min，采用Fluo star多功能酶標儀檢測相對熒光強度動態(tài)變化。具體設(shè)置如下：發(fā)射光波長540 nm，激發(fā)光波長500 nm。以每0.2 s檢測一個相對熒光強度的速度動態(tài)檢測14 s，其中前2 s為基線，2 s后以180 μl/s的速度向?qū)嶒灲M組孔中加入120 μl含有forskolin的碘化鈉PBS緩沖液。

1.5 驗證細胞模型功能

為了驗證CFTR細胞模型可篩選CFTR調(diào)節(jié)劑，將細胞分為5組(實驗組4組，對照組1組)，每組3個復(fù)孔，其中實驗組4組分別加入imperatorin、genistein、forskolin、IBMX四種激活劑，另外對照組用鈣鎂PBS緩沖液洗滌細胞3次后，吸出液體后加入50 μl PBS緩沖液，加入CFTR抑制劑Gly H101，孵育10 min，采用多功能酶標儀進行檢測，加入碘化鈉PBS緩沖液120 μl，記錄相對熒光強度動態(tài)變化。

為了驗證CFTR細胞模型的功能活性，將細胞分為6組，每組3個復(fù)孔，以800 μmol/L作為初始濃度，采用倍比稀釋的方法獲得不同濃度的激活劑和抑制劑。其中4組分別加入不同濃度的imperatorin、genistein、forskolin、IBMX四種激活劑，采用多功能酶標儀進行檢測，加入碘化鈉PBS緩沖液120 μl，記錄相對熒光強度動態(tài)變化。另外2組加入不同濃度的Gly H101、CFTRinh -172兩種抑制劑，孵育10 min，同樣采用多功能酶標儀進行檢測，加入含有forskolin的碘化鈉PBS緩沖液120 μl，記錄相對熒光強度動態(tài)變化。利用Excel軟件對原始數(shù)據(jù)進行宏計算，求出斜率值(slope)，繪制細胞模型的劑量依賴曲線。

1.6 放射免疫法檢測cAMP的濃度變化

利用放射免疫試劑盒測定細胞內(nèi)cAMP濃度，將培養(yǎng)在黑壁透明底的 96孔板中穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染CFTR和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞采用無鈣鎂PBS緩沖液洗滌細胞3次，加入含有forskolin的PBS緩沖液孵育15 min，棄去溶液。加入200 μl醋酸緩沖液后立即將細胞超聲破碎，將細胞破碎液收集到含有800 μl醋酸緩沖液的EP管中，3 000 r/min離心15 min，吸取100 μl進行cAMP測定。按照說明書進行操作，檢測放射性含量，根據(jù)標準曲線進行cAMP濃度的計算。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CFTR真核表達載體的構(gòu)建

結(jié)果表明，所構(gòu)建重組質(zhì)粒上連有目的基因CFTR，酶切位點分別是NheI和BamHI，證實成功構(gòu)建CFTR真核表達載體(圖2)。

Fig. 2 The sequencing results of recombinant plasmid

2.2 共表達CFTR和YFP-H148Q/I152L細胞模型的構(gòu)建

轉(zhuǎn)染CFTR的FRT細胞共挑出5個單克隆細胞團，在倒置熒光顯微鏡下可見細胞膜呈綠色熒光，取表達量最高的單克隆細胞團進行擴大培養(yǎng)。穩(wěn)定表達CFTR的FRT細胞鏡下可見綠色熒光在細胞膜上均勻分布，結(jié)果表明CFTR表達在細胞膜上(圖3A)；共轉(zhuǎn)染CFTR-YFP-H148Q/I152L的FRT細胞共挑出6個單克隆細胞團，在倒置熒光顯微鏡下可見胞漿呈綠色熒光，同樣取表達量最高的進行擴大培養(yǎng)。鏡下可見綠色熒光在胞漿內(nèi)均勻分布，結(jié)果表明YFP-H148Q/I152L表達在胞漿中(圖3B)。結(jié)果表明，成功獲得穩(wěn)定共表達CFTR和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞株。流式細胞儀檢測結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞純度達到96.3%(圖3C，D)。

Fig. 3 Construction results of CFTR and YFP-H148Q / I152L cell model

2.3 熒光淬滅動力學(xué)實驗鑒定細胞模型的有效性

酶標儀結(jié)果顯示，實驗組加入forskolin后，細胞相對熒光強度顯著下降，對照組在CFTRinh -172孵育后，細胞相對熒光強度無明顯變化(圖4)。Forskolin可迅速升高胞漿內(nèi)cAMP濃度，cAMP濃度的升高可引起CFTR通道的開放，CFTR具有轉(zhuǎn)運碘離子特性，細胞外碘離子轉(zhuǎn)運至胞漿內(nèi)引起YFP-H148Q / I152L迅速淬滅，導(dǎo)致熒光強度顯著下降。而加入CFTRinh -172可抑制CFTR通道的開放，熒光強度無明顯變化。結(jié)果表明，共表達CFTR-YFP-H148Q/I152L的FRT 細胞具有CFTR通道特性，細胞模型構(gòu)建成功。

Fig. 4 Results of model validation by fluorescence quenching experiment

2.4 驗證細胞模型功能

加入CFTR激活劑genistein、imperatorin、forskolin、IBMX后，熒光迅速淬滅。而加入CFTR抑制劑Gly H101后，熒光不淬滅(圖5A)。通過計算分別得出各激活劑和抑制劑熒光淬滅曲線的斜率值分別為65.36±2.80、57.66±1.45、52.83±2.45、46.06±2.80和2.10±0.43，結(jié)果顯示各實驗組熒光斜率值均顯著高于對照組，各實驗組與對照組具有顯著性差異(P<0.01)，說明模型可以篩選CFTR調(diào)節(jié)劑。

Fig. 5 Fluorescence quenching kinetics experiment identification model could screen CFTR modulators

在加入不同濃度的CFTR激活劑后，熒光信號呈現(xiàn)不同的變化。隨著激活劑濃度的增加，熒光斜率不斷增強，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。結(jié)果采用GraphPad Prism 8軟件分析(圖6A)，genistein、imperatorin、forskolin、IBMX的EC50分別為(28.87± 0.16)μmol/L、(67.47±2.47)μmol/L、(107.20± 4.45)μmol/L、(174.26±1.66)μmol/L。在加入含有激活劑的碘化鈉PBS緩沖液后，隨著抑制劑濃度的增加，熒光信號不斷減弱，即抑制劑濃度越大其抑制作用越強，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。結(jié)果同樣采用GraphPad Prism 8軟件分析(圖6B)，CFTRinh -172、Gly H101的IC50分別為(23.58±1.70)μmol/L和(55.50±4.04)μmol/L。

Fig. 6 Dose-dependent curves of CFTR activators and inhibitors

2.5 基于CFTR的檢測方法與放射免疫法分別檢測cAMP

加入不同濃度的forskolin后，相對熒光強度產(chǎn)生不同程度的下降，激活劑濃度越大，相對熒光強度下降的幅度越大，熒光淬滅曲線斜率值越大(圖7A)，結(jié)果表明熒光斜率值與激活劑濃度呈劑量依賴關(guān)系。隨著激活劑濃度的升高，胞漿內(nèi)cAMP濃度越高，其濃度與激活劑濃度呈劑量依賴關(guān)系(圖7B)。根據(jù)圖7A,7B分析結(jié)果表明，熒光淬滅曲線斜率值隨著胞漿內(nèi)cAMP濃度增加而增加，并呈現(xiàn)良好的依賴關(guān)系，因此通過熒光變化的斜率值可反映細胞內(nèi)cAMP濃度(圖7C)。與傳統(tǒng)的放射免疫法(圖7D)相比，加入不同濃度的forskolin后，在同一cAMP濃度下熒光淬滅曲線Slope值變化百分比比放射性信號變化百分比更高，即本方法信噪比更高，信號窗口更大，說明此方法具有更高的靈敏度(圖7E)，因此該細胞模型可靈敏檢測細胞內(nèi)cAMP濃度的變化。

3 討論

cAMP作為第二信使學(xué)說是薩瑟蘭于1965年首先提出的，他認為人體內(nèi)各種含氮激素都是通過細胞內(nèi)的cAMP而發(fā)揮作用，首次把cAMP叫做第二信使[13]。cAMP作為第二信使在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著關(guān)鍵作用。對cAMP動力學(xué)的研究為cAMP相關(guān)疾病的藥物開發(fā)和治療提供線索。例如，抗腫瘤藥物對cAMP介導(dǎo)的細胞內(nèi)信號通路的調(diào)節(jié)可以減少腫瘤的生長[14,15]。然而，大多數(shù)用于測量活體內(nèi)cAMP水平的早期工具都需要細胞破壞，這不適合于活細胞成像。因此，在過去的幾十年里，研究開發(fā)用于實時監(jiān)測cAMP分布或信號動力學(xué)的工具一直是努力的方向，基于熒光蛋白和熒光素酶的基因編碼傳感器可能是克服這些缺點的有力工具。

Fig. 7 The detection method based on CFTR and radioimmunoassay respectively detect the changes of cAMP

檢測細胞內(nèi)cAMP的眾多方法中[16]，國內(nèi)外較為主流的方法大體可以歸為抗原抗體競爭性結(jié)合法和報告基因法,這兩種方法目前無論是在檢測原理和操作上仍存在一定的局限性[17,18]，如免疫法抗體在制備過程中存在批次上差異，使檢測試劑存在非均一性；報告基因檢測的顯著缺點是需要一個穩(wěn)定的細胞系來表達由cAMP反應(yīng)元件驅(qū)動的報告基因，并且需要較長的轉(zhuǎn)錄孵育時間，在這過程中可能會發(fā)生受體下調(diào)。在操作方法上，這兩種檢測手段均需要細胞破膜操作，耗時相對較長，并且需要額外的配套試劑。

本研究構(gòu)建一種新的胞漿內(nèi)第二信使cAMP的檢測方法，利用CFTR通道可以轉(zhuǎn)運碘離子和YFP-H148Q/I152L遇到碘離子淬滅的特性，成功構(gòu)建檢測胞漿內(nèi)第二信使cAMP的細胞模型。當胞漿內(nèi)cAMP濃度升高時，CFTR通道開放，細胞外I-轉(zhuǎn)運至胞漿內(nèi)，細胞內(nèi)黃色熒光蛋白雙突變體YFP-H148Q/I152L遇到I-發(fā)生熒光淬滅，熒光信號顯著下降，利用熒光淬滅曲線的斜率值來反映胞漿內(nèi)cAMP濃度。本研究提出的基于CFTR的胞漿內(nèi)第二信使cAMP檢測方法與傳統(tǒng)方法相比具有以下優(yōu)勢：(1)本方法利用熒光斜率值來反映胞漿內(nèi)cAMP濃度升高情況，解決了以往直接檢測cAMP濃度的方法的操作復(fù)雜、試劑昂貴、周期長等問題;(2)通過CFTR通道對cAMP以及YFP-H148Q/I152L熒光蛋白對CFTR通道開放后轉(zhuǎn)運碘離子的敏感性的特點，實現(xiàn)了對細胞內(nèi)cAMP的實時檢測，延遲基本可以忽略，這一優(yōu)勢相對于報告基因法是十分明顯的；(3)這種檢測方法無需額外的試劑，細胞模型經(jīng)過反復(fù)傳代至25代以上，CFTR和YFP-H148Q/I152L仍然保持其良好特性和穩(wěn)定狀態(tài)，具有良好的穩(wěn)定性。這種細胞模型在國外已經(jīng)證實可運用于陰離子通道的研究，并且美國加州大學(xué)Verkman教授利用基于CFTR對cAMP的敏感性，成功應(yīng)用類似的細胞模型進行了加壓素-2受體(Vasopressin-2，V2)調(diào)節(jié)劑的篩選[19]

綜上所述，本研究構(gòu)建的基于CFTR可敏感檢測胞漿內(nèi)第二信使cAMP的細胞模型，可以簡單快速地檢測胞漿內(nèi)cAMP濃度，為研究CFTR信號通路的第二信使cAMP相關(guān)靶點提供了篩選方法，同時為第二信使cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的深入研究以及對G蛋白偶聯(lián)受體的功能檢測奠定了良好的基礎(chǔ)。