不同頻率的振動(dòng)訓(xùn)練對大鼠早期膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)作用及其JNK/NF-κB、SOX9機(jī)制*

汪宗保，王 連，柳奇奇，楊永暉，劉 攀，李斯亮，姚長風(fēng)

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，合肥 230031；3.上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種慢性、退行性和致殘性膝關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨破壞、滑膜炎、關(guān)節(jié)周圍結(jié)構(gòu)和軟骨下骨改變?yōu)樘卣?，表現(xiàn)關(guān)節(jié)逐漸僵硬、陣發(fā)性疼痛和功能逐漸衰退，嚴(yán)重影響患者的日常生活[1]，合理訓(xùn)練可改善KOA的相關(guān)癥狀，振動(dòng)訓(xùn)練(vibration exercise，VE)近些年試用于本病的臨床康復(fù)治療，表現(xiàn)出有效、安全、舒適、方便、依從性好，易長期堅(jiān)持。據(jù)報(bào)道[2]振動(dòng)訓(xùn)練可對KOA患者關(guān)節(jié)的骨性結(jié)構(gòu)、軟組織和神經(jīng)功能顯著改善，但作用機(jī)制可能存在具體發(fā)揮作用的多種信號通路機(jī)制。

JNK(c-Jun N-termianl kinase，JNK)是一種c-Jun氨基末端激酶，在細(xì)胞炎癥和凋亡相關(guān)基因表達(dá)中起重要作用，有報(bào)道[3]稱c-Jun n端激酶(JNK)在內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)可調(diào)節(jié)KOA，其信號在細(xì)胞分化、凋亡和增殖中的作用可通過三個(gè)保守的酶級聯(lián)激活轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá)。而腫瘤壞死因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是涉及骨關(guān)節(jié)炎的重要轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥發(fā)生中也起著關(guān)鍵作用，其抑制效應(yīng)有望成為KOA治療的一種思路[3]。另有研究[4]表明SOX9與NF-κB有關(guān)聯(lián)，它們可以調(diào)節(jié)軟骨形成。SOX9又是軟骨形成的主要調(diào)節(jié)因子，COL2A1的表達(dá)在體內(nèi)直接受到SOX9蛋白調(diào)控[5]。

因此，本研究試圖從上述關(guān)聯(lián)信號探討不同頻率的振動(dòng)訓(xùn)練對早期KOA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白JNK及NF-κB通路表達(dá)的影響分析其可能作用機(jī)制，為振動(dòng)訓(xùn)練影響骨關(guān)節(jié)炎軟骨修復(fù)完善理論實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從合肥安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買健康雄性SD大鼠(生產(chǎn)許可證scxk(皖)2017-001)，數(shù)量多于本研究最低要求48只以備用，均為8周齡，體重在(250±25)g，大鼠分籠飼養(yǎng)環(huán)境：安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心SPF級動(dòng)物房，動(dòng)物房溫度設(shè)置于22～25℃，濕度設(shè)置40%～70%，光照時(shí)間滿足12 h/d，食物為國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，飲自來水。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

SD大鼠在動(dòng)物房標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，所有大鼠編號標(biāo)記，實(shí)際使用中隨機(jī)數(shù)字表法選出48只條件好的大鼠，隨機(jī)分為6組(n=8)：NC組，MC組，GP1(頻率60 Hz)，GP2組(頻率40 Hz)，ZP組(頻率20 Hz)，DP組(頻率10 Hz)，參照以往文獻(xiàn)設(shè)置[6,7]。除NC組外，各組均建立膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，6周后造模完成進(jìn)行振動(dòng)訓(xùn)練。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

主要試劑：乙醇、三氯甲烷、異丙醇、甲醇(上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司20180410)，二甲苯(上海蘇懿20180310)，番紅O軟骨染色液(中國索萊寶20171031)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Scientific)，熒光定量PCR試劑盒(Qiagen，中國)，RIPA細(xì)胞裂解液(強(qiáng))(中國碧云天生物技術(shù)研究所Beyotime，貨號P0013B)，Western一抗二抗去除液(Beyotime，011918180129)；NF-κB p65(北京中杉金橋，B2317)；JNK(美國Bioworld Technology公司，AA34142)，SOX9(中國博奧森Bioss公司，AG10233229)，ECL超敏發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司，SF249607)，SOX9(兔抗大鼠多克隆抗體)(Bioss，AG10233229)，NF-Kbp65(兔抗大鼠多克隆抗體)(Bioss公司，131225W)，JNK(兔抗大鼠多克隆抗體)(Bioworld公司，AA34142)，PVDF膜(Millipore公司，R7JA4305G)，PBS緩沖液粉末(無錫傲銳東源生物科技有限公司，WK172110-1)，蘇木素(BA-4041)、伊紅(BA-4024)(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，716092、716101)

主要儀器：Y-DC-20電磁振動(dòng)試驗(yàn)臺(tái)(無錫市翼搏凡環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備有限公司)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司，JW-3021HR)，電子天平(日本島津AUY120)，石蠟包埋機(jī)(孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)公司，YB-7LF)，OLYMPUS顯微鏡，徠卡切片機(jī)(德國Leica，RM2016)；P-MIDI 3D數(shù)字切片掃描儀(匈牙利)，熒光定量PCR儀(美國Thermo Scientific)，PVDF膜(美國Millipore公司)，VE-186型轉(zhuǎn)膜儀和電泳儀(Tanon，上海天能)。

1.4 膝骨關(guān)節(jié)炎造模方法

按照手術(shù)無菌原則，將木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸分別與生理鹽水配成2%、0.03 mol/L的濃度，儲(chǔ)存于4℃恒溫冰箱，實(shí)驗(yàn)前4 h放置于室溫。將2%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L的L-半胱氨酸以2∶1混勻，靜置0.5 h對大鼠雙后腿的膝關(guān)節(jié)腔注射。實(shí)驗(yàn)前麻醉大鼠采用腹腔注射藥物2%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)后，將大鼠仰臥位固定于木板上，剃去大鼠左右膝關(guān)節(jié)腔周圍1 cm區(qū)域的腿毛，絡(luò)合碘消毒，75%乙醇脫碘。將大鼠膝屈曲，角度以方便注射為宜，髕骨下極可見白色髕腱，在其外緣的膝眼作為注射藥物進(jìn)針點(diǎn)，先針破皮下后，將注射針頭拐彎再穿刺皮下組織入關(guān)節(jié)腔保證有落空感后向髁間窩方向進(jìn)針，抵達(dá)股骨髁后再回撤2 mm，將新配靜置的0.15 ml 2%木瓜蛋白酶溶液和L-半胱氨酸混合液注入雙膝關(guān)節(jié)腔。共注射三次，時(shí)間分別在第1、4、7日以相同的方案進(jìn)行，6周后完成相對早期OA造模[8]，該方案為OA藥物造模通用方法之一。

1.5 振動(dòng)訓(xùn)練方案

振動(dòng)訓(xùn)練在固定的Y-DC-20電磁振動(dòng)試驗(yàn)臺(tái)上給大鼠設(shè)置上下垂直振動(dòng)模式，訓(xùn)練組振動(dòng)每周5 d，每次40 min，參考了持續(xù)4周的運(yùn)動(dòng)時(shí)間[9]。大鼠采用直立方式：兩前足不著平面，兩后足站立在振動(dòng)平臺(tái)上，平臺(tái)上的自制裝置同時(shí)可以訓(xùn)練多只，每只大鼠均為空間較小的圓柱狀間室隔開，模擬人體站立姿勢振動(dòng)，振幅2～5 mm。實(shí)驗(yàn)結(jié)束按上述麻醉取樣雙側(cè)后腿股骨，剝離股骨內(nèi)側(cè)髁表面關(guān)節(jié)軟骨，編號放置-80℃液氮中保存待測；切下股骨外側(cè)髁置于甲醛溶液固定。

1.6 HE、番紅O染色及Mankin評分

大鼠膝關(guān)節(jié)股骨外側(cè)髁經(jīng)4%甲醛溶液固定后，10% EDTA 液脫鈣，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟過夜，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，HE染色，中性樹膠封片。番紅O染色入Safranin O stain 內(nèi)浸染1～2 min，蒸餾水洗1 min；分別采用梯度95%、無水酒精脫水，經(jīng)過二甲苯透明，以光學(xué)樹脂封固。隨機(jī)從切片選取 4～5個(gè)區(qū)域攝像顯微鏡觀察軟骨切片的結(jié)構(gòu)，參照Mankin(改良Mankin)軟骨病理評分標(biāo)準(zhǔn)評分。

1.7 RT-qPCR檢測mRNA的表達(dá)

收集大鼠股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨組織勻漿后，Trizol法提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參，再以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火10 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列如表 1。

Tab. 1 Primer sequences of each gene

1.8 Western blot檢測蛋白表達(dá)

取各組關(guān)節(jié)軟骨組織，勻漿后加入RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定濃度，上樣等質(zhì)量的蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、4℃過夜、孵育二抗、PBST清洗、ECL顯影，β-actin作為內(nèi)參蛋白計(jì)算相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 振動(dòng)訓(xùn)練對大鼠KOA關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)的影響

建模成功后各組四周的HE染色見圖1。結(jié)果顯示：正常對照NC組染色保持均勻，軟骨表面平整，未見破壞，層級結(jié)構(gòu)清晰，軟骨細(xì)胞排列整齊，潮線清晰完整；未干預(yù)的大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎MC組關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，斷裂，見不規(guī)則軟骨，排列紊亂，潮線不完整；振動(dòng)訓(xùn)練各組(GP1、GP2、ZP、DP)失染或淺染，軟骨表面不平整程度不一，細(xì)胞數(shù)量相對正常組減少，密度不均一，潮線不連續(xù)或消失情況不同程度存在，但是振動(dòng)訓(xùn)練各組之間比較，頻率較低的訓(xùn)練組軟骨形態(tài)學(xué)改善相對較好，10 Hz頻率的DP組(圖1F)形態(tài)學(xué)表現(xiàn)最佳。

改良Mankin評分結(jié)果(圖2)顯示，各組均顯著高于NC組(P<0.01)；GP1組、GP2組、ZP組、DP組顯著低于MC組(P<0.01)；GP2組、ZP組、DP組顯著低于GP1組(P<0.05，P<0.01，P<0.01)；ZP組、DP組顯著低于高頻GP2組(P<0.05，P<0.01，圖2)。表示Mankin評分在所有造模后及模型訓(xùn)練各組中的評分均顯著高于NC組，但振動(dòng)訓(xùn)練的頻率越低評分表現(xiàn)越低。

2.2 振動(dòng)訓(xùn)練對KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨JNK、NF-κBp65、SOX9mRNA表達(dá)的影響

4周振動(dòng)訓(xùn)練后，JNK mRNA表達(dá)：與NC組比較，MC、GP1、GP2組顯著升高(P<0.01)；與MC組比較，GP1、GP2、ZP、DP組顯著降低(P<0.01)；與GP1組比較，GP2、ZP、DP組顯著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.01)；DP組顯著降低于GP2組(P<0.01)。

NF-κB p65mRNA表達(dá)：與NC組比較，MC、GP1、GP2、ZP組顯著升高(P<0.01)；與MC組比較，GP1、GP2、ZP、DP組顯著降低(P<0.01)；與GP1組，GP2、ZP、DP組顯著降低(P<0.01，P<0.05，P<0.01)。SOX9 mRNA表達(dá)：與NC組比較，MC、GP1、GP2、ZP、DP組顯著低(P<0.01)；ZP、DP組顯著高于MC、GP1、GP2組(P<0.01)，DP組顯著高于ZP組(P<0.01 ，表2)。

Tab. 2 JNK，NF-κB p65 and SOX9 mRNA levels in knee cartilage of each group rats after 4 weeks of different frequencies VE n=8)

2.3 振動(dòng)訓(xùn)練對KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨JNK、NF-κB p65、SOX9蛋白表達(dá)的影響

4周干預(yù)后，JNK蛋白表達(dá)水平：MC、GP1、GP2、ZP、DP組顯著高于NC組(P<0.01)；GP1、GP2、ZP、DP組顯著低于MC組(P<0.01)；GP2、ZP、DP組顯著低于GP1組(P<0.01)；ZP、DP組顯著低于GP2組(P<0.05，P<0.01)；DP組顯著低于ZP組(P<0.01)。NF-κB p65蛋白水平：MC、GP1、GP2、ZP、DP組顯著高于NC組(P<0.01)；GP1、GP2、ZP、DP組顯著低于MC組(P<0.01)；GP2、ZP、DP組顯著低于GP1組(P<0.01)；ZP、DP組顯著低于GP2組(P<0.05，P<0.01)；DP組顯著低于ZP組(P<0.01)。SOX9蛋白水平：MC、GP1、GP2、ZP、DP組顯著低于NC組(P<0.01)；GP1、GP2、ZP、DP組顯著高于MC組(P<0.01)；ZP、DP組顯著高于GP1組(P<0.01)，DP組顯著高于GP2、ZP組(P<0.01，表3，圖3)。

Tab. 3 Protein expressions of NF-κB p65，JNK and SOX9 in knee cartilage of each group rats after 4 weeks of different frequencies VE n=8)

Fig.3Protein expression levels of JNK，NF-κB p65 and SOX9 in knee cartilage of each group rats

Fig. 1 HE staining section of knee joints articular cartilage in rats of each group(×300)

Fig. 2 Mankin scores of each group n=8)

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎是一種給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)的中老年常見疾病。由于關(guān)節(jié)軟骨無血管，給藥途徑治療有一定的局限性，而且長期藥物治療可產(chǎn)生副作用，引發(fā)其他器官并發(fā)癥。臨床運(yùn)動(dòng)治療可明顯改善膝骨關(guān)節(jié)炎的癥狀，緩解疼痛，增強(qiáng)下肢肌力，提高患者日常生活活動(dòng)能力、生活質(zhì)量。運(yùn)動(dòng)療法被認(rèn)為是KOA二級預(yù)防無副作用的有效手段。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明合適的運(yùn)動(dòng)除了對KOA有一定的關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)效應(yīng)[9]，還有抗炎、抗凋亡[10,11]等作用。魏曉霏等[12]研究早期應(yīng)用振動(dòng)訓(xùn)練可有效改善兔KOA軟骨下骨微結(jié)構(gòu)的異常重構(gòu)，減輕軟骨損傷。

本研究試圖從JNK和NF-κB信號通路探討不同頻率振動(dòng)訓(xùn)練對KOA軟骨的影響闡述其可能的作用機(jī)理以完善治療KOA的非藥物干預(yù)機(jī)制研究，參照以往國內(nèi)外研究方法我們設(shè)置低頻10 Hz、中頻20 Hz、高頻40 Hz、高頻60 Hz四種，觀察其效果來推測其作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示：經(jīng)過四周振動(dòng)訓(xùn)練后，軟骨病理形態(tài)學(xué)HE可見正常對照NC組染色保持均勻，軟骨表面平整，未見破壞，層級結(jié)構(gòu)清晰，軟骨細(xì)胞排列整齊，潮線清晰完整；未干預(yù)的大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型MC組關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，見軟骨斷裂和不規(guī)則軟骨，排列紊亂，潮線不完整；對KOA振動(dòng)訓(xùn)練各組出現(xiàn)不同表現(xiàn)的失染或淺染，軟骨表面不平整程度不一，軟骨細(xì)胞數(shù)量稀少，密度不均，潮線不連續(xù)或消失亦有不同程度存在。而不同頻率振動(dòng)訓(xùn)練各組之間比較，頻率較低的訓(xùn)練組軟骨形態(tài)學(xué)改善相對積極，10 Hz頻率的DP組(圖1F)形態(tài)學(xué)表面平整程度最佳，軟骨Mankin 評分也相應(yīng)從高頻到低頻振動(dòng)訓(xùn)練組呈現(xiàn)遞減趨勢，提示從形態(tài)學(xué)上較低頻率振動(dòng)可表現(xiàn)良好的軟骨修復(fù)作用，也反映周而復(fù)始的振動(dòng)應(yīng)力適當(dāng)負(fù)荷刺激對關(guān)節(jié)軟骨代謝的維持是必要的。

本實(shí)驗(yàn)JNK和NF-κB p65蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果顯示模型組及其不同頻率干預(yù)各組JNK和NF-κB p65蛋白質(zhì)表達(dá)量均顯著高于正常對照組，但是，各振動(dòng)訓(xùn)練組與骨關(guān)節(jié)炎模型組相比：均表現(xiàn)出下降趨勢，其中中頻20 Hz和低頻10 Hz組明顯較低，低頻10 Hz組JNK和NF-κB p65蛋白質(zhì)表達(dá)最低。由此表明，振動(dòng)訓(xùn)練可以使得JNK和NF-κB p65活性下降，低頻率振動(dòng)訓(xùn)練抑制作用明顯。以往Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)跑臺(tái)和車輪運(yùn)動(dòng)可以降低IL-1b、IL-6和TNF-α的水平，并伴有p-P65、p-JNK和p-IkBa的下降。說明合理運(yùn)動(dòng)可減少JNK/NF-κB信號的激活。而JNK信號通路在細(xì)胞炎癥和凋亡相關(guān)基因表達(dá)增加中起到重要作用，通過一定運(yùn)動(dòng)刺激來抑制JNK激活是有積極作用的。有研究表明[14]NF-κB可抑制JNK的持續(xù)激活可能會(huì)增強(qiáng)某些因子如TNF-α誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，在軟骨細(xì)胞中生理范圍內(nèi)的生物力學(xué)信號可以抑制NF-κB的激活和促炎軟骨細(xì)胞反應(yīng)，在炎癥中扮演著關(guān)鍵作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果NF-κB p65的抑制提示振動(dòng)可降低NF-κB信號及其炎癥反應(yīng)。此外，本研究中所反映軟骨細(xì)胞外基質(zhì)II膠原(COL2Al)的調(diào)控因子SOX9通過振動(dòng)訓(xùn)練后表現(xiàn)出不同程度的增加，結(jié)果表現(xiàn)出所有頻率的振動(dòng)訓(xùn)練組顯著高于模型對照組，越低頻率組SOX9蛋白質(zhì)表達(dá)量愈高。而Bell 等[15]研究已證實(shí)COL2Al是SOX9強(qiáng)有力的靶目標(biāo)，關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)II型膠原COL2A1在體內(nèi)表達(dá)直接受SOX9蛋白調(diào)控，并提示COL2A1在軟骨形成過程中的異常調(diào)節(jié)是導(dǎo)致軟骨發(fā)育不良相關(guān)骨骼異常的原因之一[16]。

從本研究結(jié)果可以看出我們所設(shè)置的不同頻率振動(dòng)訓(xùn)練具有不同程度抑制JNK、NF-κB和增加SOX9表達(dá)作用，相對較低頻率振動(dòng)訓(xùn)練在軟骨形態(tài)學(xué)上修復(fù)效應(yīng)較好，越低頻率呈現(xiàn)JNK、NF-κB較強(qiáng)抑制和SOX9的較強(qiáng)活性。Rockel等[17]也證明SOX9的活性和軟骨基質(zhì)基因的表達(dá)受到NF-κB和RARs共激活的限制，SOX9、NF-κB等之間的串?dāng)_(Crosstalk)是協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)基因表達(dá)的關(guān)鍵機(jī)制。大量但不完全的證據(jù)表明，在多步驟軟骨形成通路中，復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)控制著SOX9的活性，SOX9分子網(wǎng)絡(luò)可能遠(yuǎn)比目前所認(rèn)識(shí)到的復(fù)雜[18]。

綜上，本研究提示振動(dòng)訓(xùn)練對大鼠早期KOA模型關(guān)節(jié)軟骨具有一定程度的修復(fù)作用、低頻振動(dòng)訓(xùn)練軟骨修復(fù)效應(yīng)相對優(yōu)于高頻振動(dòng)，JNK/NF-κB、SOX9的變化機(jī)制可能是軟骨作用的途徑之一：通過抑制JNK/NF-κB信號通路途徑來促進(jìn)SOX9表達(dá)上調(diào)完成。未來研究除繼續(xù)需完善振動(dòng)作用機(jī)制的基礎(chǔ)性研究，還要為更好的高質(zhì)量物理康復(fù)療法深入探索最佳的振動(dòng)方案來達(dá)到軟骨優(yōu)化治療效果。