中風(fēng)膠囊對(duì)腦缺血/再灌注損傷模型鼠腦組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響*

呂棟輝，安方玉，顏春魯，李海龍，王嘉玉，石 瑤，袁靈青，趙延真，楊建新，郭 丹，頡旺軍

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000；5.天水市中醫(yī)院，天水 741000；6.甘肅省中醫(yī)藥研究中心，蘭州 730000；7.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，蘭州 730000)

腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury，CI/RI)是腦組織在發(fā)生缺血后重新得到血液的過程中伴隨發(fā)生的腦功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷現(xiàn)象。由于發(fā)病率高、致殘率高和致死率高等“三高”的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)，CI/RI的主要病機(jī)涉及氧化應(yīng)激損傷[2]、炎癥反應(yīng)[3]、神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4]等。其中，有關(guān)CI/RI引發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡備受關(guān)注。自噬作為一種特殊的細(xì)胞凋亡形式，相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，細(xì)胞自噬參與調(diào)控了CI/RI階段的神經(jīng)細(xì)胞損傷與凋亡[5]。也有研究表明[6]，抑制CI/RI模型大鼠的PI3K/Akt信號(hào)通路后，可進(jìn)一步調(diào)控其下游自噬相關(guān)靶蛋白的表達(dá)來(lái)加重腦損傷。提示，PI3K/Akt通路可能是導(dǎo)致CI/RI發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞損傷與凋亡的關(guān)鍵。反之，激活CI/RI模型大鼠的PI3K/Akt信號(hào)通路可以發(fā)揮腦損傷的保護(hù)作用，但具體分子機(jī)制未明。

近年來(lái)，中醫(yī)復(fù)方在CI/RI中以多靶點(diǎn)、多途徑、整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢(shì)對(duì)其神經(jīng)元損傷發(fā)揮明顯的保護(hù)作用[7]。中風(fēng)膠囊由三七、水蛭、紅參、土鱉蟲、穿山甲、大黃、丹參組成，全方具有補(bǔ)氣行血，化瘀通絡(luò)之功，可能對(duì)CI/RI的神經(jīng)損傷具有防護(hù)作用。為此，本研究采用改良線栓法構(gòu)建CI/RI模型，通過觀察中風(fēng)膠囊對(duì)CI/RI模型大鼠PI3K/Akt/Beclin1信號(hào)通路的自噬相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響，初步從細(xì)胞自噬角度揭示中風(fēng)膠囊干預(yù)的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選取體質(zhì)量為(180±20)g的SPF級(jí)健康雄性SD大鼠60只，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SYXK(甘)2015-0005，本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及條件符合甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

中風(fēng)膠囊(河南省中醫(yī)藥研究附屬醫(yī)院，產(chǎn)品批號(hào)：20180901)。陽(yáng)性藥物丁苯酞(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：118190343)。

1.3 主要試劑

10%水合氯醛(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào):20170318)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)為：11141-C)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)為：11201ES08)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列為：Beclin1上游：5′-ATTGAAACTCGCCAGGATGGT-3′，下游：5′-CTGGTCTTCACAGGGTGCTA-3′；LC3上游：5′-TTGGTCAAGATCATCCGGCG-3′，LC3下游：5′-AGATGTCAGCGATGGGTGTG-3′；GAPDH上游：5′-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3′，GAPDH下游：5′-TTGTCACAAGAGAAGGCAGC-3′。大鼠血清雌二醇(E2)ELISA試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司，批號(hào)為：1812R)；大鼠血清卵泡刺激素(FSH) ELISA檢測(cè)試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司，批號(hào)為：1903R)；Rabit Anti-PI3K Polyclonal Antibody(Affinity，AF6242)；Rabit Anti-pPI3K Polyclonal Antibody(Immunoway，B2401)；Rabit Anti-Akt Polyclonal Antibody(Immunoway，B8501)；Rabit Anti-pAkt Polyclonal Antibody(Genetex，41766)；Rabit Anti-Beclin1 Polyclonal Antibody(Immunoway，B2601)；Rabit Anti-LC3 Polyclonal Antibody(Immunoway，B8101)；RabitGAPDH Polyclonal Antibody(Immunoway，B1501)。

1.4 儀器

iMark型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；5424R型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)；ABI-9700型PCR擴(kuò)增儀(Applied biosystems公司)；Quantstudio3型熒光定量PCR儀(Thermofisher公司)；Minichemi610型化學(xué)發(fā)光成像儀(北京六一生物科技有限公司)；BX53型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.5 實(shí)驗(yàn)藥物的給藥劑量

按照體表面積換算法，計(jì)算大鼠所用中風(fēng)膠囊的中劑量(臨床人用劑量為6 g/d)，其具體計(jì)算方法為：6 g×0.018×5=0.54 g/(kg·d)。則中風(fēng)膠囊高、中、低劑量分別為1.08、0.54、0.27 g/(kg·d)。

1.6 動(dòng)物分組、給藥及造模

60只SPF級(jí)雄性SD大鼠飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham operation group)、模型組(model group)、丁苯酞組(butylphthalide group)、中風(fēng)膠囊高、中、低劑量組，每組 10 只。模型組及各干預(yù)組均采用改良線栓法建立大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔麻醉后，將大鼠頸部正中皮膚切開，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端，于近端插入直徑0.25 mm的尼龍線，將尼龍線緩慢向顱內(nèi)推進(jìn)，進(jìn)線18 mm左右，略感阻力即到大腦中動(dòng)脈起始部阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈，2 h后將尼龍線拔至頸外動(dòng)脈殘端，實(shí)現(xiàn)血流再灌注，縫合皮膚切口，成功構(gòu)建MCAO模型。假手術(shù)組除不插尼龍線閉塞大腦中動(dòng)脈之外，其余步驟同造模組。術(shù)后各組大鼠均在相同條件下，自由飲水，攝食。缺血/再灌注24 h后，假手術(shù)組、模型組大鼠均給予等體積 0.9%氯化鈉溶液灌胃，丁苯酞組灌服丁苯酞0.054 g/(kg·d) ，中風(fēng)膠囊高、中、低劑量組分別按1.08、0.54、0.27 g/(kg·d)灌胃，給藥10 d，每天1次。干預(yù)結(jié)束后留取血清，處死各組大鼠，摘取腦組織備用。

1.7 各組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分

各組大鼠末次給藥24 h后，觀察其神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。參考經(jīng)典的ZeaLonga 評(píng)分法對(duì)MCAO大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：0分：無(wú)神經(jīng)功能障礙；1分：癱瘓側(cè)前肢伸展不完全，輕度神經(jīng)功能障礙；2分：爬行時(shí)，大鼠向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分：爬行時(shí)，大鼠身體向癱瘓側(cè)傾斜，重度神經(jīng)功能缺損；4分：意識(shí)障礙，甚至處于昏迷狀態(tài)。

1.8 各組大鼠體重及腦指數(shù)的測(cè)定

各組大鼠干預(yù)結(jié)束后24 h，稱取各組大鼠體重，然后立即斷頭取腦，在冰臺(tái)上剝離出大鼠全腦，稱腦濕重。腦指數(shù)(mg/g)=腦質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.9 各組大鼠腦組織病理形態(tài)變化觀察

4%甲醛溶液固定腦組織，常規(guī)石蠟包埋，行厚5 μm冠狀切片，經(jīng)二甲苯、乙醇、蒸餾水洗脫后，蘇木精染色5 min，然后水洗，0.5%伊紅液染色3 min，蒸餾水沖洗、脫水、干燥后封片，光鏡下觀察腦組織結(jié)構(gòu)改變。

1.10 各組大鼠血清中雌二醇(E2)和卵泡刺激素(FSH)的含量

各組大鼠干預(yù)結(jié)束后24 h，采集外周血，3 500 r/min，離心15 min，取上清液。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清E2、FSH水平，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.11 各組大鼠腦組織Beclin1、LC3的基因表達(dá)測(cè)定

用Trizol試劑提取各組大鼠腦組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：預(yù)變性95℃、5 min，變性95℃、10 s，退火60℃、20 s，延伸72℃、20 s，共40個(gè)循環(huán)。用實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒定量Beclin1、LC3mRNA表達(dá)，數(shù)據(jù)經(jīng)2-ΔΔCt處理后進(jìn)行Beclin1、LC3mRNA相對(duì)表達(dá)量分析。

1.12 各組大鼠腦組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Beclin1、LC3的蛋白表達(dá)測(cè)定

采用RIPA裂解液提取大鼠缺血區(qū)域腦組織總蛋白，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定用 BCA 法，并調(diào)整點(diǎn)樣的蛋白質(zhì)濃度為50 μg /10 μl，10 μl/well，作SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、滴加一抗(PI3K、pPI3K、Akt、pAkt、Beclin1、LC3和GAPDH)，4℃孵育過夜，TBST 洗滌5 min×4次后，滴加山羊抗兔IgG 37℃孵育1 h，TBST漂洗5 min×3次，將ECL超敏發(fā)光液的A和B溶液等體積混勻后滴加于山羊抗兔IgG孵育過的PVDF 膜上，暗室靜置反應(yīng)1 min 后Image J6.0進(jìn)行曝光，然后進(jìn)行灰度值的分析。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 中風(fēng)膠囊對(duì)各組大鼠體質(zhì)量、腦指數(shù)及神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低，腦指數(shù)和神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，中風(fēng)膠囊高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著升高、神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低，中風(fēng)膠囊各干預(yù)組大鼠腦指數(shù)均顯著降低(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Effects of Zhongfeng capsule on body weight,brain index and neurological injury score in rats of each n=10)

2.2 中風(fēng)膠囊對(duì)各組大鼠血清雌二醇(E2)和卵泡刺激素(FSH)含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清E2和FSH含量均降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，中風(fēng)膠囊各干預(yù)組大鼠血清E2和FSH含量均升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

Tab. 2 Effects of Zhongfeng capsule on serum levels of estradiol (E2) and follicle stimulatihormone(FSH) in rats of each n=10)

2.3 中風(fēng)膠囊對(duì)各組大鼠腦組織病理形態(tài)變化的影響

假手術(shù)組的腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組腦組織結(jié)構(gòu)排列疏松，間隙變寬，間質(zhì)水腫，神經(jīng)細(xì)胞呈三角形，核固縮深染；中風(fēng)膠囊高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞排列較整齊，間質(zhì)水腫明顯減輕，變性和壞死的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少(圖1)。

Fig. 1 Effects of Zhongfeng capsule on pathomorphological changes of brain tissue in rats of each group(HE ×20)

2.4 中風(fēng)膠囊對(duì)各組大鼠自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3表達(dá)的影響

與模型組比較，中風(fēng)膠囊各干預(yù)組大鼠腦組織LC3和Beclin1的基因表達(dá)均顯著降低(P<0.01，表3)。

Tab. 3 Effects of Zhongfeng capsule on gene expressions of Beclin1 and LC3 in rats of each n=6)

2.5 中風(fēng)膠囊對(duì)各組大鼠PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Beclin1、LC3蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織p-PI3K和p-Akt的蛋白表達(dá)均顯著降低，LC3和Beclin1的蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，中風(fēng)膠囊各干預(yù)組大鼠腦組織p-PI3K和p-Akt的蛋白表達(dá)均顯著升高，LC3和Beclin1的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01，表4，5，圖2)。

Tab. 4 Effects of Zhongfeng capsule on protein expression gray values of PI3K,p-PI3k,Akt and p-Akt in rats of each group(OD, n=6)

Tab. 5 Effects of Zhongfeng capsule on protein expression gray values of LC3 and Beclin1 in rats of each group(OD, n=6)

Fig. 2 Effects of Zhongfeng capsule on PI3K,p-PI3K,Akt,p-Akt,LC3 and Beclin1 protein expressions in rats of each group(Western blot)

3 討論

缺血性腦卒中在中醫(yī)學(xué)中屬于本虛標(biāo)實(shí)之證，以氣虛為本，血瘀為標(biāo)[8]。因此以“益氣活血通絡(luò)”為主要治法。中風(fēng)膠囊由三七、水蛭、紅參、土鱉蟲、穿山甲、大黃、丹參組成。方中紅參大補(bǔ)元?dú)?，氣旺以促血行為君藥；水蛭、土元、穿山甲三藥合用破血逐瘀通絡(luò)是為臣藥；三七、丹參加強(qiáng)臣藥活血化瘀之功效，且有化瘀不傷正的特點(diǎn)為佐藥；大黃逐瘀通經(jīng)，導(dǎo)瘀血下行亦為佐藥，全方攻補(bǔ)兼施，標(biāo)本兼治，具有補(bǔ)氣行血，化瘀通絡(luò)之功。依據(jù)組方分析，可能對(duì)CI/RI具有防護(hù)作用，但是其具體治療機(jī)制未明。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)[9,10]，大鼠腦缺血/再灌注損傷24 h后，其神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯上升，腦梗死體積顯著增加，缺血神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重受損，神經(jīng)元大量丟失。提示，CI/RI 導(dǎo)致機(jī)體的神經(jīng)功能缺損，神經(jīng)元脫失、變性及功能改變，同時(shí)也是影響神經(jīng)信息傳遞和神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵病機(jī)[11]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，腦缺血/再灌注損傷模型鼠體重顯著降低，腦指數(shù)及神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高，其腦組織結(jié)構(gòu)排列疏松，間隙變寬，間質(zhì)水腫，神經(jīng)細(xì)胞呈三角形，核固縮深染。提示腦缺血/再灌注加重了腦組織病理?yè)p傷和腦神經(jīng)功能缺損。給予中風(fēng)膠囊干預(yù)后，其高劑量組大鼠體重顯著升高，神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低，其神經(jīng)細(xì)胞排列較整齊，間質(zhì)水腫明顯減輕，變性和壞死的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，但未完全恢復(fù)正常；中風(fēng)膠囊各劑量腦指數(shù)顯著降低。提示中風(fēng)膠囊可能通過降低腦缺血/再灌注損傷模型鼠神經(jīng)功能評(píng)分來(lái)改善其腦組織的病理?yè)p傷，但具體通過何種分子機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用，目前尚未研究。

PI3K是一種細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，其下游的Akt為絲氨酸/蘇氨酸激酶，二者參與調(diào)控細(xì)胞的生存、增殖和凋亡，維持細(xì)胞的正常功能[12]。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典的保護(hù)性通路[13]，在多種臟器缺血/再灌注損傷中發(fā)揮著抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等多種保護(hù)作用[14]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明[15]，PI3K/Akt信號(hào)通路可通過調(diào)控Beclin1和LC3的表達(dá)來(lái)參與腦缺血/再灌注損傷的自噬調(diào)控。其激活途徑是：多種細(xì)胞因子和神經(jīng)因子與酪氨酸激酶受體結(jié)合激活PI3K，活化的PI3K能夠使下游的Akt發(fā)生磷酸化反應(yīng)，p-Akt可以進(jìn)一步抑制下游分子Beclin1和LC3的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)元的自噬反應(yīng)，保護(hù)腦缺血/再灌注損傷[16]。Beclin1作為PI3K/Akt信號(hào)通路的下游靶基因，被認(rèn)為是反映細(xì)胞自噬特異性的標(biāo)志蛋白，主要功能是參與自噬體的形成，促進(jìn)自噬體的成熟[17]；LC3作為PI3K/Akt信號(hào)通路的下游的另一靶基因，也被認(rèn)為是反映細(xì)胞自噬特異性的標(biāo)志蛋白，其中LC3Ⅱ是成熟自噬體的標(biāo)志分子，且隨著自噬體膜的增加而增加[18]。研究已經(jīng)證實(shí)[19,20]，腦缺血/再灌注損傷后p-PI3K、p-Akt的表達(dá)是下調(diào)的，自噬蛋白Beclin1、LC3的表達(dá)是上調(diào)的。說(shuō)明腦缺血/再灌注損傷可以激活機(jī)體自身的自噬水平，從而進(jìn)一步加重缺血腦組織的神經(jīng)元損傷。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，腦缺血/再灌注損傷模型組鼠腦組織p-PI3K、p-Akt表達(dá)水平明顯下降，Beclin1、LC3的表達(dá)水平顯著上升，與上述研究報(bào)道一致。另有研究發(fā)現(xiàn)[21]，一些復(fù)方制劑如加味滌痰湯可明顯下調(diào) LC3Ⅱ、Beclin1表達(dá)，上調(diào)p62表達(dá)來(lái)抑制腦缺血/再灌注損傷模型鼠腦組織自噬，進(jìn)一步減輕腦缺血/再灌注損傷鼠腦神經(jīng)元損傷，發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。陳琰琰等[22]的研究也進(jìn)一步證實(shí)，通絡(luò)清腦注射粉針劑通過下調(diào)Beclin1、LC3的表達(dá)來(lái)抑制大鼠海馬和皮質(zhì)區(qū)過度自噬，減少自噬體數(shù)量，減輕神經(jīng)元凋亡，保護(hù)MCAO誘導(dǎo)的腦損傷。本研究顯示，中風(fēng)膠囊干預(yù)后，顯著上調(diào)腦缺血/再灌注損傷鼠腦組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)，下調(diào)Beclin1、LC3的基因和蛋白表達(dá)。由此可見，中風(fēng)膠囊通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路中的Beclin1、LC3的表達(dá)來(lái)抑制腦缺血/再灌注損傷鼠神經(jīng)元的自噬，從而發(fā)揮保護(hù)其腦神經(jīng)細(xì)胞功能的作用。

綜上所述，中風(fēng)膠囊對(duì)腦缺血/再灌注損傷鼠具有明顯的腦保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)PI3K/Akt/信號(hào)通路中p-PI3K、p-Akt表達(dá)和下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路中Beclin1、LC3表達(dá)來(lái)抑制神經(jīng)元過度自噬(圖3)。但本文僅從細(xì)胞自噬的角度研究中風(fēng)膠囊對(duì)腦缺血/再灌注損傷模型鼠的腦保護(hù)機(jī)制，鑒于PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控靶點(diǎn)的復(fù)雜性，中藥復(fù)方的多靶點(diǎn)、多途徑、整體協(xié)調(diào)的特點(diǎn)，對(duì)中風(fēng)膠囊干預(yù)腦缺血/再灌注損傷模型鼠的腦保護(hù)機(jī)制將進(jìn)一步從炎癥和凋亡等雙向調(diào)控的分子機(jī)制展開，作為后續(xù)研究的重點(diǎn)。

Fig. 3 Molecular mechanisms of Zhongfeng capsule protecting cerebral ischemia/reperfusion injury in rats