腎透明細(xì)胞癌中具有預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值免疫相關(guān)基因的篩選

徐明 薛波新 陽(yáng)東榮 朱進(jìn)

腎細(xì)胞癌約占成人惡性腫瘤的3%，其最常見組織學(xué)亞型為腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)，治療上以手術(shù)為主，但仍有一定比例患者死于腫瘤特異性復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1-2]。腫瘤微環(huán)境是由免疫細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)分子組成[3-4]。免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中兩種主要的非腫瘤成分，在腫瘤診斷和患者預(yù)后評(píng)估中具有重要價(jià)值。

ccRCC是最早通過(guò)免疫療法治療有效的惡性腫瘤之一，也是一種在各種臨床和基因組研究中發(fā)現(xiàn)的高度免疫侵襲性腫瘤[5-7]。Janiszewska等[8]總結(jié)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ccRCC患者中約1%的轉(zhuǎn)移自發(fā)消退是由大量免疫反應(yīng)介導(dǎo)的。免疫微環(huán)境中基因表達(dá)的具體機(jī)制在癌癥的治療中起著重要作用。然而，關(guān)于ccRCC的高免疫浸潤(rùn)、自發(fā)緩解和免疫治療反應(yīng)機(jī)制的報(bào)道仍缺乏可靠和詳細(xì)的解釋。因此，挖掘在ccRCC發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用的免疫微環(huán)境相關(guān)基因具有實(shí)際指導(dǎo)意義。

Yoshihara等[6]設(shè)計(jì)了ESTIMATE算法，該算法可利用癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)估計(jì)惡性腫瘤中的基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞。在該算法中，作者通過(guò)分析免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的特異性基因表達(dá)特征來(lái)計(jì)算免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分，以預(yù)測(cè)非腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)。隨后有學(xué)者將ESTIMATE算法應(yīng)用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行免疫/基質(zhì)預(yù)后相關(guān)基因篩選，獲得并證實(shí)了預(yù)測(cè)該腫瘤不良預(yù)后的基因[9]，證明了基于大數(shù)據(jù)的算法是有效且可靠的。在本研究中，我們采用ESTIMATE算法評(píng)估ccRCC基因表達(dá)數(shù)據(jù)的免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分，提取并驗(yàn)證差異表達(dá)的腫瘤微環(huán)境相關(guān)基因，以期為ccRCC的治療和預(yù)后判斷提供新的依據(jù)。

對(duì)象與方法

一、基因表達(dá)數(shù)據(jù)集

從遺傳病控制(Genetic Disease Control, GDC)網(wǎng)站(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structuralgenomics/tcga/)下載534例ccRCC患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，以及對(duì)應(yīng)的患者樣本臨床信息，臨床特征包括性別、N分期、M分期、AJCC分期、總生存(overall survival, OS)信息和無(wú)病生存(disease free survival, DFS)信息。在ESTIMATE 算法網(wǎng)站(https://bioinfor-matics.mdanderson.org/estimate/)上查看并下載所有 TCGA所對(duì)應(yīng)ccRCC樣本的基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分。整合上述兩類數(shù)據(jù)，得到同時(shí)包含OS記錄、ESTIMATE評(píng)分和表達(dá)譜信息的樣本共533例，用于后續(xù)驗(yàn)證分析。其中435例ccRCC患者具有DFS信息。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載GEO額外數(shù)據(jù)集(GSE29609)，將該數(shù)據(jù)集中基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)及臨床隨訪數(shù)據(jù)合并，得到包含OS的表達(dá)譜數(shù)據(jù)樣本共39例，用于后續(xù)驗(yàn)證分析。

二、數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

1.免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分與ccRCC患者生存的關(guān)聯(lián)分析：采用ESTTIMATE算法對(duì)ccRCC樣本數(shù)據(jù)集進(jìn)行免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分，并用箱型圖描述。根據(jù)免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分中位數(shù)，將ccRCC患者分為高分組和低分組，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)分析其與OS的關(guān)系。采用Kaplan-Meier生存曲線，并應(yīng)用log-rank test驗(yàn)證法比較兩組生存曲線的差異。

2.差異表達(dá)基因的篩選：利用R語(yǔ)言軟件包limma函數(shù)功能進(jìn)行基因表達(dá)數(shù)據(jù)差異分析。根據(jù)差異倍數(shù)和顯著性，以logFC>1和P<0.05為閾值篩選出高分組和低分組之間的差異表達(dá)基因。

3.功能富集分析：將差異表達(dá)基因列表上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇GO注釋和KEGG通路富集分析，設(shè)置P<0.05，闡明這些基因所涉及的生物進(jìn)程、分子功能和細(xì)胞組分，以及參與基因的信號(hào)通路。

4.差異表達(dá)基因的生存分析：采用Kaplan-Meier法繪制差異表達(dá)基因生存曲線，挑選出與ccRCC OS顯著相關(guān)的基因。

5.蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. string-db.org/)包含大量關(guān)于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)的信息。為了評(píng)估上述差異表達(dá)基因之間的關(guān)系，我們將差異表達(dá)基因列表上傳到 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，從而獲得差異表達(dá)基因之間的PPI網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，所得網(wǎng)絡(luò)為無(wú)向網(wǎng)絡(luò)。

6.數(shù)據(jù)集驗(yàn)證：應(yīng)用驗(yàn)證數(shù)據(jù)集GSE29609的表達(dá)矩陣和臨床特征進(jìn)行回歸分析，驗(yàn)證所篩選核心差異表達(dá)基因與ccRCC之間的關(guān)系。

結(jié) 果

一、免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分與ccRCC患者生存的關(guān)聯(lián)分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載所得534例ccRCC的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息中，有533例符合研究要求，其中435例患者具有DFS信息，患者的具體特征見表1?；贓STIMATE算法，免疫評(píng)分分布在-1 159.0～3 076.0之間，基質(zhì)評(píng)分范圍為-1 558.0～2 030.0。平均免疫評(píng)分為1 083.0，平均基質(zhì)評(píng)分為617.3(圖1A)。

表1 TCGA中533例ccRCC樣本的臨床特征

為了找出OS與免疫評(píng)分或基質(zhì)評(píng)分之間的潛在相關(guān)性，本研究根據(jù)免疫/基質(zhì)評(píng)分的中位數(shù)將ccRCC患者分為高分組和低分組。Kaplan-Meier生存曲線(圖1B)顯示，高免疫評(píng)分組患者的中位OS時(shí)間為77個(gè)月，低免疫評(píng)分組患者的中位OS時(shí)間長(zhǎng)于高免疫評(píng)分組(P=0.011)。此外，基質(zhì)評(píng)分患者的中位OS趨勢(shì)與免疫評(píng)分相似(圖1C，116.8個(gè)月 vs 74.1個(gè)月，P=0.19)。因此，ccRCC患者免疫評(píng)分與OS顯著相關(guān)(P<0.05)。

二、差異表達(dá)基因篩選

533例ccRCC樣本按照免疫評(píng)分中位數(shù)劃分為高評(píng)分組和低評(píng)分組，并進(jìn)行差異基因篩選。在P<0.05和logFC>1條件下，得到804個(gè)差異表達(dá)基因，包括720個(gè)上調(diào)基因和84個(gè)下調(diào)基因，差異表達(dá)基因熱圖如圖1D所示。一行代表一個(gè)基因，一列代表一個(gè)樣本。其中樣本按照免疫評(píng)分由高到低、從左至右排序，左側(cè)粉色組為免疫評(píng)分低評(píng)分組樣本，右側(cè)藍(lán)綠色組為免疫評(píng)分高評(píng)分組。熱圖中紅色代表基因高表達(dá)，藍(lán)色代表低表達(dá)；紅色或藍(lán)色越深則基因的差異程度越大。

A：ccRCC樣本獲得的表達(dá)數(shù)據(jù)集生成基質(zhì)和免疫評(píng)分[方框代表中位數(shù)(粗線)和四分位數(shù)(細(xì)線)，Whisker表示下四分位數(shù)或上四分位數(shù)的1.5四分位距]；B～C：Kaplan-Meier 生存曲線所示，低免疫評(píng)分組的中位OS時(shí)間長(zhǎng)于高免疫評(píng)分組(P=0.011)，低基質(zhì)評(píng)分組的中位OS時(shí)間長(zhǎng)于高基質(zhì)評(píng)分組(P=0.19)；D：差異表達(dá)基因熱圖

三、GO注釋和KEGG通路富集分析

為研究所得到差異表達(dá)基因的功能，應(yīng)用DAVID富集工具對(duì)804個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行了富集分析，其中最顯著的10個(gè)GO注釋和KEGG富集結(jié)果見圖2。如圖所示，ccRCC相關(guān)差異表達(dá)基因的分子功能主要表現(xiàn)于轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合、poly(A) RNA結(jié)合等，生物進(jìn)程中涉及的主要因素是前/后模式規(guī)范、剪接體復(fù)合物組裝、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄等。與細(xì)胞組分相關(guān)的有甲基小體、核質(zhì)、剪接體復(fù)合物等。KEGG信號(hào)通路主要包括細(xì)胞周期、TGF-β信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路。

A：分子功能；B：生物進(jìn)程；C：細(xì)胞組分；D：KEGG 通路圖

四、差異表達(dá)基因的生存分析

為篩選出與ccRCC預(yù)后相關(guān)基因，我們繪制了804個(gè)差異表達(dá)基因的生存分析曲線，其中190個(gè)與OS顯著相關(guān)(P<0.05)，圖3為部分基因生存分析結(jié)果。

A、E：顯示基因ABAT和APP高分組生存優(yōu)于低分組；B、C、D、F、G、H、I：顯示基因ACTN1、AMPD3、AMY1A、ADAM12、ALX1、ACTR1A、ANGPTL7低分組生存優(yōu)于高分組

五、蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

PPI分析發(fā)現(xiàn)88個(gè)與生存相關(guān)的基因，其中41個(gè)是獨(dú)立的。利用另外47個(gè)與生存顯著相關(guān)的基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖4所示，網(wǎng)絡(luò)由47個(gè)節(jié)點(diǎn)和42條邊組成，網(wǎng)絡(luò)的聚類系數(shù)、密度和異質(zhì)性分別為0.064、0.039和0.576。在這個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)中，我們發(fā)現(xiàn)RAC3[10]、LEP[11]和RABEP1[12]3個(gè)基因已被證明與免疫功能密切相關(guān)，其中RAC3基因是網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因，它可以調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中與生存和免疫顯著相關(guān)的基因PLXNB3。

圖4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

對(duì)190個(gè)OS相關(guān)基因的生存分析顯示，108個(gè)基因與DFS顯著相關(guān)，如表2所示。其中，11個(gè)基因(DBF4、RER1、HMBS、SNF8、LRP8、RABEP1、MCM6、BET1、USP5、HLF、RRP9)存在差異表達(dá)且在具有預(yù)后效能的PPI網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)，有望作為ccRCC治療的潛在靶點(diǎn)，特別是RABEP1被證實(shí)是免疫相關(guān)重要基因(圖5)。

表2 TCGA數(shù)據(jù)集中與OS和DFS相關(guān)基因

A、B、C、D、E、G、H、J、K：顯示基因DBF4、HMBS、MCM6、LRP8、USP5、RRP9、BET1、RER1和SNF8低分組生存優(yōu)于高分組；F、I：顯示基因RABEP1、HLF高分組生存優(yōu)于低分組

六、GEO數(shù)據(jù)集驗(yàn)證

為了確定TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定的基因在其他ccRCC病例中是否具有預(yù)后意義，將前述所得的190個(gè)OS相關(guān)基因在GEO數(shù)據(jù)集(GSE29609)中驗(yàn)證。結(jié)果表明，其中134(134/190)個(gè)基因在這組GEO數(shù)據(jù)集中同樣表達(dá)；生存分析顯示，其中16(16/134)個(gè)基因與TCGA結(jié)果一致，而且其表達(dá)水平與OS顯著相關(guān)(P<0.05)，如表3所示。其中，12(12/16)個(gè)基因(BCL3、F3、HLF、HNRNPAB、SHOX2、SNRPB2、USP5、ALX1、FAM50A、USP39、DBF4、SPIN1)出現(xiàn)在前述108個(gè)與DFS顯著相關(guān)的差異表達(dá)基因中，顯示能夠預(yù)測(cè)患者DFS。

表3 在GEO額外數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證具有預(yù)后效能的基因

討 論

在目前的工作中，我們?cè)噲D在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘與腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)的基因，這些基因?qū)cRCC患者的DFS具有重要的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。通過(guò)比較大量免疫評(píng)分高低樣本的全局基因表達(dá)，提取出804個(gè)參與免疫反應(yīng)的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)其中許多基因與腫瘤微環(huán)境有關(guān)，這與之前的報(bào)道一致，免疫細(xì)胞的功能在ccRCC構(gòu)建腫瘤微環(huán)境中是相互關(guān)聯(lián)的[13-15]。

為了找出與OS顯著相關(guān)的基因，對(duì)804個(gè)基因進(jìn)行了生存分析，鑒定出與OS顯著相關(guān)的190個(gè)基因。使用STRING軟件在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)88個(gè)基因，其中47個(gè)是非獨(dú)立的。這些基因與免疫或炎癥反應(yīng)有關(guān)，尤其是RAC3、LEP和RABEP1，已被證明與免疫功能密切相關(guān)[16]。RABEP1是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子[16-18]。圖1顯示，免疫評(píng)分高的患者中位OS時(shí)間明顯長(zhǎng)于免疫評(píng)分低的患者。因此，我們推斷RABEP1基因也通過(guò)某種機(jī)制負(fù)調(diào)控ccRCC的進(jìn)展，進(jìn)一步影響患者的DFS。對(duì)190個(gè)基因的DFS分析顯示，108個(gè)基因與DFS顯著相關(guān)。其中，11個(gè)基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中差異表達(dá)并具有預(yù)后預(yù)測(cè)作用，包括DBF4、RER1、HMBS、SNF8、LRP8、RABEP1、MCM6、BET1、USP5、HLF和RRP9。此外，使用GEO交叉驗(yàn)證，獲得了12個(gè)基因(BCL3、F3、HLF、HNRNPAB、SHOX2、SNRPB2、USP5、ALX1、FAM50A、USP39、DBF4、SPIN1)，可以預(yù)測(cè)患者的DFS。特別是，在ccRCC樣本中篩選出與免疫相關(guān)的HLF、USP5和DBF4基因既存在于TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中，也存在于差異表達(dá)和預(yù)后PPI網(wǎng)絡(luò)中，推測(cè)這3個(gè)基因可能在ccRCC免疫微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。

研究表明，髓源性抑制細(xì)胞衍生的外泌體蛋白，包括DBF4，可以調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[19]。DBF4是細(xì)胞分裂周期7相關(guān)蛋白激酶(CDC7)的調(diào)節(jié)亞基[20]。CDC7-DBF4復(fù)合物是調(diào)節(jié)DNA復(fù)制起始的必需激酶[21]。Bonte等[22]報(bào)道CDC7-DBF4在多種癌癥和腫瘤細(xì)胞系中的過(guò)表達(dá)與p53失活相關(guān)。p53的失活與ccRCC的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。CDC7-DBF4表達(dá)降低可能導(dǎo)致p53激活[22]。因此，我們推斷DBF4可能有效控制ccRCC中的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞增殖。

USP5作為DUB的泛素特異性蛋白酶家族的一員，通過(guò)與蛋白質(zhì)結(jié)合和雙鏈DNA修復(fù)，對(duì)調(diào)節(jié)未錨定的多聚泛素分解和蛋白質(zhì)去泛素化起到一定作用[23-25]。USP5在惡性程度高的肝細(xì)胞癌中高表達(dá)并與SLUG表達(dá)呈正相關(guān)。USP5的敲低抑制SLUG去泛素化并抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，而USP5的過(guò)表達(dá)在體外和體內(nèi)促進(jìn)SLUG穩(wěn)定性和EMT[25]。USP5基因的免疫評(píng)分與ccRCC患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。我們推測(cè)USP5可能是治療ccRCC的潛在靶點(diǎn)之一。

有數(shù)據(jù)顯示HLF可能是Meis1的關(guān)鍵下游靶基因[26]。Meis1可以通過(guò)維持缺氧條件來(lái)防止氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)白血病轉(zhuǎn)化。當(dāng)它缺失時(shí)，白血病細(xì)胞中的活性氧增加，伴隨著白血病細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致存活率顯著提高。HLF的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激，間接說(shuō)明Meis1促進(jìn)白血病的特性可能部分是由HLF輔助的低氧化狀態(tài)介導(dǎo)。本研究中，與HLF基因相關(guān)的Kaplan-Meier生存曲線(圖5)顯示，高免疫評(píng)分組的DFS長(zhǎng)于低免疫評(píng)分組(相反秩檢驗(yàn)P=0.000 1)。推測(cè)HLF在ccRCC進(jìn)展過(guò)程中可能具有不一樣的調(diào)節(jié)機(jī)制。

在PPI網(wǎng)絡(luò)中，我們將RAC3確定為唯一的樞紐基因。RAC3在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如肺腺癌[27]、腦腫瘤[28]、乳腺癌[29]、前列腺腫瘤[30]和宮頸癌[31]，其在癌癥發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。有研究表明RAC3通過(guò)p38 MAPK通路促進(jìn)肺腺癌的細(xì)胞侵襲、遷移和EMT[27]。盡管RAC3在ccRCC發(fā)展中的具體機(jī)制鮮有報(bào)道，但推測(cè)RAC3可能是ccRCC的潛在治療靶點(diǎn)。

以上相關(guān)文獻(xiàn)研究證明，腫瘤與腫瘤免疫微環(huán)境的相互作用嚴(yán)重影響著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和整體預(yù)后。本研究篩選出的12個(gè)基因(BCL3、F3、HLF、HNRNPAB、SHOX2、SNRPB2、USP5、ALX1、FAM50A、USP39、DBF4、SPIN1)可以預(yù)測(cè)ccRCC患者的DFS。這些基因與免疫/炎癥反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞的增殖/凋亡、血管生成、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，尤其是HLF、USP5和DBF4基因，在TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)和生存顯著相關(guān)PPI網(wǎng)絡(luò)中均顯示出潛在價(jià)值。此外，RAC3還在PPI網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐基因作用。推測(cè)這4個(gè)基因在ccRCC免疫微環(huán)境中具有重要意義。本研究認(rèn)為，通過(guò)使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的功能富集分析，并基于ESTIMATE算法，提取了與腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)的基因列表，可用于預(yù)測(cè)ccRCC患者的預(yù)后。其中，HLF、USP5、DBF4和樞紐基因RAC3可能成為ccRCC潛在的治療生物靶點(diǎn)。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步驗(yàn)證這些具有預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值的基因在ccRCC免疫微環(huán)境中的具體分子生物學(xué)功能。