楊梅枝條醇提物對A375細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其分子機(jī)制

鄭園園，俞浙萍，張淑文，李有貴，孫 鸝，鄭錫良，戚行江，*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華321004； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，浙江 杭州310021； 3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑與茶葉研究所，浙江 杭州 310021)

楊梅(Sieb et Zucc.)是我國南方著名的特產(chǎn)水果，已有2 000多年的栽培歷史，在浙江、福建、云南等地均有廣泛種植。楊梅經(jīng)濟(jì)壽命長，果實(shí)可鮮食，可加工成果酒、蜜餞，提取色素等，葉可綠化園林，提取精油等；根系發(fā)達(dá)，可保持水土，與放線菌共生形成根瘤起到固氮作用等。楊梅除了具有較高的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)、工業(yè)價(jià)值，其在藥用保健方面潛力巨大。楊梅栽培過程中，果農(nóng)每年均需要對樹體進(jìn)行不同程度修剪，修剪后的枝條被棄置或焚燒，造成資源浪費(fèi)與環(huán)境污染。

楊梅具有較高的藥用價(jià)值，其果實(shí)、葉片、核仁等不同部位含有豐富的花色苷、類黃酮、酚酸、不飽和脂肪酸等物質(zhì)，在抗氧化、抗炎癥、抑菌、抗腫瘤、預(yù)防和治療心血管疾病等方面具有一定藥效作用。楊梅樹皮中含三萜類、單寧類、二芳基庚烷類、黃酮類等活性物質(zhì)，其成分與楊梅枝條接近；研究發(fā)現(xiàn)，楊梅樹皮提取物中的主要特性成分楊梅素和楊梅苷，對人肝癌細(xì)胞HEPG2、人前列腺癌細(xì)胞PC-3和人肺腺癌細(xì)胞A549具有一定的抑制作用。

目前，針對楊梅提取物的藥物活性研究主要集中在果實(shí)、葉、核仁、樹皮等組織，還未見楊梅枝條提取物的相關(guān)研究。此外，楊梅提取物已在多種腫瘤的研究中表現(xiàn)出較好的抗癌活性，但在黑色素瘤研究方面還未見報(bào)道。黑色素瘤是一種高度惡性腫瘤，在皮膚癌中死亡率最高，發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。手術(shù)切除腫瘤、放療、化療，以及免疫和分子靶向療法常用于治療不同時(shí)期的黑色素瘤。盡管晚期黑色素瘤的免疫治療和靶向治療已取得重大進(jìn)展，但仍有相當(dāng)比例患者的治療效果不顯著或出現(xiàn)多種副作用?；谏鲜鲈颍壳袄弥参锾烊划a(chǎn)物及其衍生物治療人惡性黑色素瘤，已成為當(dāng)下研究重要熱點(diǎn)之一。

本研究以人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞為研究對象，利用超聲波輔助乙醇提取法獲得楊梅枝條醇提物MRBE，分析不同濃度MRBE處理對A375細(xì)胞抑制率、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響，以期揭示其對A375細(xì)胞增殖和凋亡的影響，及潛在作用機(jī)制。本文充分利用楊梅修枝后產(chǎn)生的廢棄枝條，開展楊梅枝條醇提物的生物活性研究，將為楊梅枝條的深度加工利用和藥用價(jià)值研究提供較好的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用楊梅枝條由樹體修剪后獲得，取自浙江省蘭溪市馬澗鎮(zhèn)下杜村楊梅基地(119°37′14′E，29°18′34″N)，收集莖粗1～2 cm東魁楊梅枝條，樣品保存于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所超低溫冰箱，-70 ℃保存。人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

試驗(yàn)所需的相關(guān)試劑如下：RPMI-1640培養(yǎng)基，GIBCO BRL公司；FBS，杭州四季青生物材料研究所；胰蛋白酶(Trypsin)、PBS(Phosphate Buffer Solution)，Amresco公司；MTT[3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide]、DMSO(Dimethyl sulfoxide)、PI(Propidium Iodide)，Sigma公司；Annexin V-EGFP/PI試劑盒，Thermo Fisher科技公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒，TaKaRa公司；qRT-PCR引物，上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

試驗(yàn)所需的儀器設(shè)備分別如下：DFY-600粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；KQ-250E型超聲儀器，昆山市超聲儀器有限公司；R-502旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)有限公司；冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；96孔和6孔培養(yǎng)板，Corning公司；CO培養(yǎng)箱，Thermo公司；TS100型倒置光學(xué)顯微鏡，Nikon公司；Infinite M200酶標(biāo)儀，TECAN公司；Cytomics FC 500 MCL流式細(xì)胞儀，Beckman Coulter公司；Real-time PCR儀器，ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MRBE制備

將修剪后的楊梅枝條去除葉片等部分，進(jìn)行清洗、剪短，60 ℃烘干至質(zhì)量不變，粉碎研磨后在室溫下用70%乙醇超聲提取4～5次，將提取液靜置24 h后用直徑9 cm快速定性濾紙(孔徑80～120 μm)過濾，反復(fù)旋蒸后靜置，冷凍干燥后獲得MRBE用于后續(xù)研究。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

利用RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中加入10% FBS、1%青霉素和鏈霉素，并置于5% CO、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 MRBE對人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的抑制實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的A375細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h使其貼壁去培養(yǎng)基。按Yu等的方法，設(shè)置空白組(不含細(xì)胞)，以不加MRBE處理的細(xì)胞為對照組，不同濃度MRBE處理(100、200、300、400 μg·mL)的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，加入100 μL培養(yǎng)液，每組設(shè)置6孔，培養(yǎng)48 h。加入20 μL的5 g·LMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm波長處測定吸光度，重復(fù)3次。按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率：

抑制率(%)=

1.3.4 PI檢測A375細(xì)胞周期分布

以不加MRBE處理的細(xì)胞為對照組，200、400 μg·mLMRBE處理的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)48 h，按Zhong等的方法進(jìn)行試驗(yàn)。利用流式細(xì)胞儀和MultiCycle軟件檢測分析，重復(fù)3次。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI檢測A375細(xì)胞凋亡

以不加MRBE處理的細(xì)胞為對照組，200、400 μg·mLMRBE處理的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)48 h，按Zhong等的方法進(jìn)行試驗(yàn)。利用流式細(xì)胞儀和MultiCycle軟件檢測細(xì)胞凋亡情況，分別調(diào)查早期凋亡率、晚期凋亡率和壞死細(xì)胞情況，重復(fù)3次。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以不加MRBE處理的細(xì)胞為對照組，200、400 μg·mLMRBE處理的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，分別培養(yǎng)6 h和48 h。按Yu等的方法，將處理后的樣品500 r·min離心10 min，棄上清，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞。按照天根生化科技(北京)有限公司的動(dòng)物組織總RNA試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR總反應(yīng)體系為20 μL，擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40次循環(huán)。以-作為內(nèi)參基因。采用2法計(jì)算基因表達(dá)水平，設(shè)置3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 MRBE濃度對A375細(xì)胞增殖抑制率的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，不同濃度MRBE(100、200、300、400 μg·mL)處理A375細(xì)胞48 h后，對細(xì)胞增殖均表現(xiàn)出顯著的抑制作用，抑制率分別達(dá)到(3.31±0.06)%、(16.42±0.06)%、(32.37±0.12)%、(49.46±0.17)%(圖1-A)，抑制率隨處理濃度的升高而增加，呈劑量依賴效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)，隨著MRBE處理濃度的升高，細(xì)胞胞質(zhì)皺縮，逐漸變小變圓，貼壁性減弱，細(xì)胞間隙增大(圖1-B)，表明MRBE在體外可以抑制A375細(xì)胞增殖。

A，不同濃度MRBE處理A375細(xì)胞48 h后的抑制率；B，不同濃度MRBE處理A375細(xì)胞48 h后的細(xì)胞形態(tài)情況。*表示0.01

2.2 MRBE處理對A375細(xì)胞周期的影響

200、400 μg·mLMRBE處理A375細(xì)胞48 h時(shí)測定細(xì)胞周期，結(jié)果如圖2所示。200 μg·mLMRBE處理的G/G期細(xì)胞比率[(79.34±1.15)%]與對照組[(82.64±1.15)%]無顯著差異，S期細(xì)胞比率[(16.64±0.58)%]極顯著高于對照組[(8.83±0.12)%]，G/M期細(xì)胞比率[(4.01±0.06)%]極顯著低于對照組[(8.53±0.12)%]。400 μg·mLMRBE處理，G/G期細(xì)胞比率[(86.39±1.73)%]與對照組[(82.64±1.15)%]無顯著差異，S期細(xì)胞比率[(8.71±0.58)%]與對照組[(8.83±0.12)%]無顯著差異，而G/M期細(xì)胞比率[(4.90±0.12)%]極顯著低于對照組[(8.53±0.12)%]。上述結(jié)果表明，400 μg·mLMRBE處理對A375細(xì)胞S期具有顯著的阻滯作用。

A，PI流式細(xì)胞術(shù)分析不同濃度MRBE對A375細(xì)胞周期的影響；B，不同細(xì)胞周期階段的細(xì)胞數(shù)量百分比。

2.3 MRBE處理對A375細(xì)胞凋亡的影響

如圖3所示，200、400 μg·mLMRBE處理A375細(xì)胞48 h，早期凋亡率從對照組的(0.83±0.06)%分別提高至(23.27±0.58)%(200 μg·mL處理)和(25.68±1.15)%(400 μg·mL處理)；晚期凋亡率從對照組的(3.07±0.58)%分別提高至(21.51±0.29)%(200 μg·mL處理)和(10.76±0.58)%(400 μg·mL處理)；壞死細(xì)胞則由對照組的(0.96±0.12)%分別提高至(4.24±0.12)%(200 μg·mL處理)和(7.44±0.23)%(400 μg·mL處理)。結(jié)果初步表明，200 μg·mL和400μg·mLMRBE處理均可顯著誘導(dǎo)和促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡。

A，Annexin V-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度MRBE對A375細(xì)胞凋亡的影響，左下為正常細(xì)胞，右下為早期調(diào)亡細(xì)胞，右上為晚期調(diào)亡細(xì)胞，左上為壞死細(xì)胞；B，不同類型細(xì)胞數(shù)量百分比。

2.4 MRBE對A375細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響

細(xì)胞的生長、發(fā)育、增殖和凋亡等生命過程，涉及關(guān)鍵信號通路上一系列基因的表達(dá)調(diào)控作用。為進(jìn)一步明確MRBE對A375細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，篩選了部分關(guān)鍵基因開展qRT-PCR試驗(yàn)。基因表達(dá)情況如圖4所示，200、400 μg·mLMRBE處理A375細(xì)胞48 h后，KIP家族成員21表達(dá)極顯著上調(diào)，細(xì)胞周期蛋白相關(guān)基因、、、表達(dá)顯著下調(diào)；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶相關(guān)基因1、6表達(dá)顯著下調(diào)，2、4、5表達(dá)極顯著下調(diào)，21基因表達(dá)極顯著下調(diào)?；谏鲜龌虻谋磉_(dá)情況，初步推測MRBE可能通過促進(jìn)21上調(diào)，同時(shí)抑制細(xì)胞周期Cyclin-CDK復(fù)合蛋白與21基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在S期，最終抑制A375細(xì)胞的增殖。

圖4 MRBE對A375細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響

200、400 μg·mLMRBE處理A375細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況如圖5所示，促凋亡蛋白相關(guān)基因、、-、表達(dá)極顯著下調(diào)；抗凋亡蛋白相關(guān)基因-和表達(dá)均顯著下調(diào)。上述結(jié)果表明，MRBE可能通過抑制-與等抗凋亡基因的表達(dá)促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡。

圖5 MRBE對A375細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 結(jié)論與討論

本研究利用修剪后的廢棄楊梅枝條醇提物MRBE，從細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和相關(guān)基因表達(dá)等方面，開展其對人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞增殖和凋亡的影響與分子機(jī)制研究。隨著濃度的增加，MRBE對A375細(xì)胞的抑制率逐漸升高，在400 μg·mL濃度下，抑制率達(dá)到最高49.46%，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)觀察，初步表明MRBE具有抗癌活性。已有研究者利用楊梅樹皮醇提物，開展其對人肺腺癌A549細(xì)胞的影響，在100、200 mg·L濃度處理下，抑制率分別達(dá)到70.0%和87.0%，均顯著高于相同濃度MRBE處理下的細(xì)胞增殖抑制率(3.31%和16.42%)，其原因可能與不同癌細(xì)胞的形態(tài)和生理差異、楊梅枝條和樹皮有效特性成分不同等相關(guān)。本研究中MRBE對A375細(xì)胞周期的阻滯主要發(fā)生在G/M期。與前人針對人膀胱癌細(xì)胞YTS-1細(xì)胞周期的研究結(jié)果一致，利用楊梅樹皮發(fā)現(xiàn)其對YTS-1細(xì)胞的阻滯作用也發(fā)生在S期。然而，當(dāng)利用楊梅素和楊梅苷開展其對人前列腺細(xì)胞PC-3的阻滯作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)主要在G/G期表現(xiàn)出顯著的阻滯作用。上述研究表明，以楊梅為原材料的有效成分，對不同類型癌細(xì)胞的阻滯作用時(shí)期不同，推測其作用機(jī)制存在差異。本研究中，200、400 μg·mLMRBE處理的A375細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著高于對照組，表明MRBE對A375細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用?；谏鲜鯩RBE對A375細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，明確了MRBE的抗癌活性作用，表明楊梅枝條存在一定的藥用價(jià)值，后期可以充分利用修剪后的楊梅枝條，為研發(fā)相關(guān)抗癌候選藥物提供原材料。然而，楊梅枝條的具體活性成分還不明確，需進(jìn)一步通過試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

細(xì)胞凋亡是受遺傳機(jī)制控制的程序性細(xì)胞死亡，其過程受一系列基因表達(dá)、信號通路調(diào)控等作用。前人研究表明，細(xì)胞周期的失調(diào)是由致癌基因和腫瘤抑制基因之間的功能失衡引起，細(xì)胞周期Cyclin-CDK復(fù)合蛋白主要作用是磷酸化抑癌基因，同時(shí)釋放被抑制的轉(zhuǎn)錄因子21，促進(jìn)細(xì)胞周期由G期進(jìn)展到S期。qRT-PCR結(jié)果表明，MRBE處理下，細(xì)胞周期蛋白基因和蛋白依賴性激酶基因均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)表達(dá)，同時(shí)21顯著下調(diào)(圖4)。細(xì)胞周期重要調(diào)控因子21基因在癌細(xì)胞中控制細(xì)胞周期G、S、G期的致癌活性，隨著21基因表達(dá)的上調(diào)，與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合起到抑制作用。此外，研究者利用香瓜醇提物處理乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可通過上調(diào)21、27、1、1、基因的表達(dá)，下調(diào)下游、、2基因表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞生長；同時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞在五氟利多作用下生長和轉(zhuǎn)移受到抑制，21和27表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，Cyclin-CDK復(fù)合物蛋白基因表達(dá)顯著下調(diào)。與前人研究結(jié)果基本一致，MRBE處理后，21基因表達(dá)顯著上調(diào)，初步揭示了MRBE對A375細(xì)胞的抑制機(jī)理，即MRBE通過上調(diào)21表達(dá)，進(jìn)而抑制-、21等基因表達(dá)，使A375細(xì)胞停滯在S期。

MRBE處理后，A375細(xì)胞促凋亡基因、、-、表達(dá)極顯著下調(diào)，同時(shí)抗凋亡基因-、也出現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)。已有研究表明，可與凋亡抑制基因-2和-蛋白結(jié)合，最終使對應(yīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。在本研究中，-2和-表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)，但與對照組相比差異不顯著。進(jìn)一步研究表明，Bcl-2家族通過與線粒體外膜直接相互作用控制細(xì)胞凋亡，其調(diào)節(jié)依賴于多種抗凋亡基因的表達(dá)，如-、-2、-等。-的上調(diào)促進(jìn)腫瘤發(fā)生，而-的下調(diào)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，這與本研究結(jié)果基本一致，明確了MRBE處理下-基因的下調(diào)表達(dá)與癌細(xì)胞凋亡間的緊密聯(lián)系。Ras/Raf/MEK/ERK通路在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，大約在70%的人類黑色素瘤中發(fā)生突變，大量研究表明基因過度表達(dá)或激活是癌癥的關(guān)鍵指標(biāo)。在本研究中，MRBE處理后，基因顯著下調(diào)表達(dá)，表明其與人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡密切關(guān)聯(lián)?；谏鲜鲅芯砍晒?，可知MRBE對A375細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的一系列調(diào)控作用，后期可以將挖掘到的顯著差異表達(dá)基因，作為治療人惡性黑色素瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

本研究充分利用果樹修枝產(chǎn)生的廢棄楊梅枝條，解析楊梅枝條醇提物MRBE對人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞增殖和凋亡的作用及其分子機(jī)制，推測MRBE可能通過調(diào)控p21/Cyclin-CDK/E2F1信號途徑使A375細(xì)胞阻滯在S期，同時(shí)抑制抗凋亡蛋白基因-和的表達(dá)，促使A375細(xì)胞發(fā)生凋亡，最終實(shí)現(xiàn)對A375細(xì)胞的抑制作用。本研究為楊梅枝條藥用價(jià)值的開發(fā)利用提供重要技術(shù)支撐，有助于實(shí)現(xiàn)楊梅資源的高值化全利用。