四川省部分地區(qū)肉牛源產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌的分離鑒定與耐藥性分析

李 姍，黃方園，張玉龍，才冬杰，左之才

(四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 溫江 611130)

肺炎克雷伯菌(，Kp)是腸桿菌科克雷伯氏菌屬的成員，是一種會引起人與動物發(fā)病的革蘭氏陰性條件性致病菌。據(jù)報道，肺炎克雷伯菌能夠引起人和動物傷口感染、肺炎、腦膜炎、泌尿系統(tǒng)發(fā)炎，甚至敗血癥等病癥。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，該菌已出現(xiàn)了多重耐藥現(xiàn)象，其中，產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)菌株的感染問題日趨嚴重，其對藥物的敏感性逐年下降。目前，在肺炎克雷伯菌中所發(fā)現(xiàn)的ESBLs主要以、、-基因為主。研究發(fā)現(xiàn)，該類菌對多種抗菌藥物均已產(chǎn)生較強的耐藥性，發(fā)病率和死亡率明顯升高，臨床治療難度增大，給養(yǎng)殖業(yè)造成的損失日趨嚴重。莢膜抗原(K抗原)是肺炎克雷伯菌重要的毒力因子之一，莢膜結(jié)構(gòu)被覆菌體表面，可保護菌體不被吞噬。根據(jù)K抗原型細菌莢膜多糖結(jié)構(gòu)及其抗原性的不同，可將肺炎克雷伯菌劃分為不同的K血清型，其中，K1、K2、K5、K20、K54、K57為強毒力型肺炎克雷伯菌。

四川是肉牛重要的輸出地。為此，本研究從四川省內(nèi)15個養(yǎng)殖場采集222份肉牛鼻腔拭子樣本，針對肺炎克雷伯菌開展分離鑒定、藥物敏感性試驗、耐藥基因檢測、小鼠致病性試驗、毒力基因檢測等，旨在為臨床預(yù)防和控制產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的傳播，以及深入研究該菌耐藥和毒力變化的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從四川省宜賓、瀘州等地15個肉牛養(yǎng)殖場采集222份肉牛源鼻腔拭子樣本，低溫保存并運輸至實驗室。

分子量標記(DL2000 DNA marker)、2×PCR Master Mix(blue)、滅菌雙蒸水(ddHO)，均購于成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司。LB培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基，均購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；麥康凱培養(yǎng)基，購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；CHROMagar ESBL顯色培養(yǎng)基，購于上海欣中生物工程有限公司；瓊脂粉，購于上海伊卡生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片，購于英國Oxoid公司。

SimpliAmpPCR儀，美國Thermo Fisher公司；DYY-6D型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；GelDoc全自動凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

C57BL/6無菌小鼠，購自成都達碩生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離純化

將采集的鼻腔拭子樣本劃線于麥康凱培養(yǎng)基，挑選培養(yǎng)基上的紅色菌落接種于CHROMagar ESBL顯色培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～20 h后，挑取深藍色菌落于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，再劃線于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，在麥康凱培養(yǎng)基上進行純化。

1.2.2 16S rRNA序列測定

取已純化的分離菌菌液，直接用PCR擴增其16S rRNA。擴增所用的通用引物序列如下：上游引物F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物R，5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×PCR Master Mix 12.5 μL，去離子水8.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，純化菌液2.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，取PCR陽性產(chǎn)物送成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。將分離菌株測序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的序列進行Blast比對，分析分離株的同源性關(guān)系。

1.2.3 細菌表型篩選

參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)推薦的雙紙片協(xié)同擴散試驗，對疑似產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌菌株進行篩選確認。將待測菌制成0.5麥氏濁度的菌懸液，用無菌棉棒均勻涂布于MH平板上，貼上頭孢他啶(30 μg)、頭孢他啶/克拉維酸(30 μg/10 μg)、頭孢噻肟(30 μg)、頭孢噻肟/克拉維酸(30 μg/10 μg)藥敏紙片，37 ℃孵育18～24 h后觀察結(jié)果。頭孢他啶/克拉維酸或頭孢噻肟/克拉維酸的單個圓盤直徑與頭孢他啶或頭孢噻肟的差值≥5 mm，認為是陽性。

1.2.4 藥物敏感性試驗

參照CLSI推薦的K-B紙片擴散法對分離株進行藥敏試驗。將上述分離確認的產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h后，將所得菌液配置為0.5麥氏濁度，用無菌棉棒蘸取菌液均勻涂布整個平板，夾取藥敏紙片貼于平板表面，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24 h，記錄抑菌圈直徑。

1.2.5 耐藥基因檢測

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，選取-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、磺胺類、四環(huán)素類耐藥基因進行PCR檢測(表1)。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL，ddHO 8.5 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司進行測序，將測序結(jié)果與GenBank中已有序列進行比對。

表1 用于擴增耐藥基因的引物信息

1.2.6 血清型分型與毒力基因檢測

對分離株進行K1、K2、K5、K20、K54、K57強毒力莢膜血清型分型，及、、、、等5種毒力基因檢測(表2)。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL，ddHO 8.5 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司純化和測序，將測序結(jié)果與GenBank中已有序列進行比對。

表2 用于莢膜血清型與毒力基因檢測的引物信息

1.2.7 小鼠致病性試驗

將分離株接種于LB培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h后取出，用平板計數(shù)法測定菌液濃度，待其為1.2×10CFU·mL時，備用。

取C57BL/6小鼠34只，分為17組，每組2只(雌雄各一)，設(shè)置空白對照組。吸取上述備用菌液0.2 mL腹腔注射小鼠，空白對照組注射等體積無菌生理鹽水。觀察小鼠臨床癥狀和死亡情況，并及時剖解小鼠，取各組小鼠組織器官，置于4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定，送往成都里來生物科技有限公司制作病理組織切片。

1.2.8 小鼠各器官細菌載量測定

將檢測出K5、K20、K1莢膜血清型的毒株劃分為強毒力菌株組，其余歸為弱毒力菌株組。分別在強毒力菌株組、弱毒力菌株組內(nèi)各隨機選取3只剛死亡小鼠，采集小鼠肺、脾、肝、心、腎，稱重、研磨，并進行梯度稀釋，取稀釋度為10、10、10的組織菌液均勻涂布于LB平板，每個稀釋度重復(fù)2次，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，記錄在可計數(shù)區(qū)間內(nèi)的菌落總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的分離鑒定

對肉牛的鼻腔拭子樣本進行細菌的分離培養(yǎng)，分離株在CHROMagar ESBL顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)深藍色菌落(圖1)，在麥康凱培養(yǎng)基上生長為黏液型紅色菌落，在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上生長的菌落大而厚實、光亮，呈凸起、灰白色黏液型菌落。

圖1 分離株在產(chǎn)ESBL顯色培養(yǎng)基(A)、麥康凱培養(yǎng)基(B)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(C)上的菌落形態(tài)

2.2 菌株的16S rRNA分子鑒定

16S rRNA基因擴增結(jié)果顯示，PCR擴增產(chǎn)物約為1 500 bp(圖2)，與預(yù)期目的片段大小一致。對分離株16S rRNA基因測序結(jié)果進行Blast比對分析，結(jié)果顯示，與肺炎克雷伯菌的一致性均在99%以上，確認分離株均為肺炎克雷伯菌。

M，DL2000 DNA marker；1～2，陽性樣品；3，陰性對照。

2.3 菌株的藥物敏感性

依據(jù)雙紙片協(xié)同擴散試驗結(jié)果，分離株均為產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌。藥物敏感性試驗顯示，分離株對青霉素類、頭孢類、四環(huán)素類、磺胺和氨基糖苷類普遍耐藥，對苯唑西林、阿莫西林、四環(huán)素、鏈霉素的耐藥率在62.50%～93.75%，但對亞胺培南敏感。將分離得到的全部16株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的耐藥譜整理于表3，其中，菌株根據(jù)來源地進行編號，瀘州地區(qū)菌株編號為LZ1～LZ4，宜賓地區(qū)菌株編號為YB1～YB12。

表3 肺炎克雷伯菌分離株的耐藥結(jié)果

對分離株進行磺胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因的擴增檢測(圖3、圖4)，結(jié)果顯示：-內(nèi)酰胺類耐藥基因、、-、--1、--9、--2的檢出率分別為68.75%、62.50%、68.75%、87.50%、87.50%、18.75%，1、2、(3)-Ⅱ、(6′)-Ⅰ、和的檢出率均為100%，(3′)-Ⅰ、、(3)-Ⅰ的檢出率分別為87.50%、68.75%、6.25%。

M，DL2000 DNA marker；泳道1～16，sul2基因陽性樣品；17，陰性對照。

M，DL2000 DNA marker；泳道1～3、5～6、8～10、13～15，TEM基因陽性樣品；泳道4、7、11、12、16，陰性樣品；17，陰性對照。

2.4 菌株的血清型分型和毒力基因檢測結(jié)果

在16株分離株中，針對莢膜血清型K1、K2、K5、K20、K54、K57，血清型K1和K20分別檢出1株，K5檢出3株。毒力基因有16株，檢出率為100%；有15株，檢出率為93.75%；有14株，檢出率為87.50%；有12株，檢出率為75.00%；僅1株。由莢膜血清型和毒力基因的結(jié)果推測，部分分離株具有較強的致病性。部分基因擴增結(jié)果如圖5、6所示。

M，DL2000 DNA marker；泳道10、13、15，莢膜血清型K5基因陽性樣品；泳道1～9、11～12、14、16，陰性樣品；17，陰性對照。

2.5 菌株對小鼠的致病性

M，DL2000 DNA marker；泳道2～16，毒力基因mrkD基因陽性樣品；泳道1，陰性樣品；17，陰性對照。

將各菌株對小鼠的致病性整理于表4。攻毒4 h后，強毒力菌株組小鼠反應(yīng)遲鈍，扎堆；弱毒力菌株組小鼠無明顯異常。攻毒12 h后，強毒力菌株組小鼠死亡率100%(10/10)；弱毒力菌株組小鼠死亡率72.7%(16/22)，未死亡小鼠也表現(xiàn)抽搐、蜷縮等臨床癥狀。解剖觀察發(fā)現(xiàn)，弱毒力菌株組小鼠心、肺、肝、腎、脾充血腫脹，強毒力菌株組腫大和淤血的情況更加明顯，而空白對照組小鼠表現(xiàn)正常，解剖未發(fā)現(xiàn)組織病變(圖7、圖8)。

A，空白對照組小鼠剖檢整體情況無異常；B，弱毒力菌株組小鼠剖檢整體情況為膽囊腫大，腸道積氣積液、腫大；C，強毒力菌株組小鼠整體剖檢情況為明顯膽囊腫大，腸道積氣積液、腫大。

A，空白對照組小鼠的肺無異常；A1，弱毒力菌株組小鼠肺充血腫大；A2，強毒力菌株組小鼠肺明顯充血腫大。B，空白對照組小鼠脾無異常；B1，弱毒力菌株組小鼠脾淤血腫大；B2，強毒力菌株組小鼠脾明顯淤血腫大。C，空白對照組小鼠肝無異常；C1，弱毒力菌株組小鼠肝淤血腫大；C2，強毒力菌株組小鼠肝明顯淤血腫大。D，空白對照組小鼠腎無異常；D1，弱毒力菌株組小鼠腎充血腫大；D2，強毒力菌株組小鼠腎明顯充血腫大。

表4 菌株對小鼠的致病性

空白對照組小鼠各器官未分離出細菌，但在攻毒小鼠的心、肝、脾、肺、腎中，強毒力菌株組的平均細菌含量分別為3.82×10、4.03×10、8.62×10、9.07×10、4.90×10CFU·g，弱毒力菌株組的平均細菌含量分別為3.60×10、1.07×10、

2.53×10、8.00×10、4.87×10CFU·g。綜合細菌定殖情況和載菌量分析，強、弱毒株均可感染小鼠的心、肝、脾、肺、腎等多種內(nèi)臟實質(zhì)器官，對肺的侵襲力相對最強，且強毒力菌株較弱毒力菌株對小鼠的侵襲力更強。

觀察病理組織切片發(fā)現(xiàn)：小鼠心臟未見明顯病理改變；肝輕度淤血，伴有少量中性粒細胞浸潤；脾中組織被膜輕度增厚，白髓部分細胞壞死，呈“星空現(xiàn)象”，由大而不規(guī)則、淺染的巨噬細胞吞噬細胞碎片形成；肺呈輕度炎性浸潤，局部區(qū)域肺泡膈輕微增厚；腎小球腫大，腎小囊腔幾乎不可見，且腎中集合管局部出現(xiàn)絮狀物沉積等病理改變(圖9)。

A，肝淤血(100×)；B，肝胞核固縮，中性粒細胞(400×)；C，脾被膜增厚(100×)；D，脾細胞壞死形成“星空現(xiàn)象”(400×)；E，肺泡膈輕微增厚(100×)；F，肺中性粒細胞增多(400×)；G，腎小球腫大，絮狀物沉積(100×)；H，腎小球腫大(400×)。

3 討論

本試驗從四川部分地區(qū)222份肉牛源樣品中分離出16株(7.21%)產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌，通過藥敏試驗、耐藥基因和毒力基因檢測，以及相關(guān)致病性試驗，期望能夠在一定程度上反映臨床用藥情況和菌株的致病性情況，從而為肉牛源產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌病的治療和預(yù)防提供參考依據(jù)。近年來，隨著-內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛應(yīng)用，肺炎克雷伯菌對-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性逐年下降，臨床上的多重耐藥現(xiàn)象也日趨嚴重，但國內(nèi)有關(guān)動物源感染產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的報道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)查地區(qū)的臨床分離株對-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥情況嚴重，且多重耐藥現(xiàn)象普遍。刀麗梅等報道，重慶地區(qū)牛源肺炎克雷伯菌中可檢測出產(chǎn)ESBLs的耐藥基因型有、、-，以為主；張穎欣等報道，在其調(diào)查的13個省份中，奶牛源產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌耐藥基因型以-為主。本試驗對比了-內(nèi)酰胺酶耐藥基因在菌株中的檢出率，檢出率較高的類型有--1(87.50%)、--9(87.50%)、(68.75%)、-(68.75%)、(62.50%)，總體來看，以--1、--9亞型為主。-型ESBLs是一類對頭孢類具有強大水解能力的酶。據(jù)報道，-型ESBLs耐藥基因可以通過質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等可移動元件，在質(zhì)粒與染色體間，或從一個質(zhì)粒到另一個質(zhì)粒，或從一種細菌到另一種細菌進行轉(zhuǎn)移，具有復(fù)雜的遺傳傳播背景。為有效控制肺炎克雷伯菌產(chǎn)生ESBLs和治療產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的臨床菌株感染，肉牛養(yǎng)殖場應(yīng)當減少臨床中抗生素的使用頻次，并注意合理科學用藥。蒙正群等研究發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌對-內(nèi)酰胺類、二代頭孢菌素、磺胺類藥物耐藥。本試驗發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯臨床菌株，不僅對-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，而且還對四環(huán)素類、磺胺類和氨基糖苷類普遍耐藥(四環(huán)素類、氨基糖苷類、鏈霉素、磺胺類耐藥基因的檢出率均接近100%，且與菌株藥敏紙片試驗結(jié)果相符)，說明產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌可攜帶其他類型的耐藥基因傳播，這也是造成分離株耐藥性增強的原因之一。綜上，產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌株具有較強的獲得耐藥性、克隆傳播的能力和致病性，準確及時地開展分子流行病學監(jiān)測，對于控制臨床產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌株感染的暴發(fā)流行，和及時準確查明傳染源等具有重要意義。

根據(jù)細菌莢膜多糖K抗原進行血清學分型，其中，K1、K2、K5、K20、K54和K57為動物臨床常見的強毒力血清型，其臨床致病能力強。本試驗對分離菌株的血清型進行檢測，發(fā)現(xiàn)強毒力菌株5株，其中屬于K5型的有3株，這與多項研究報道的K1和K2型為常見的強毒力型菌株的結(jié)論有差異，推測可能與調(diào)查地區(qū)和感染的宿主有關(guān)。、、、、是肺炎克雷伯菌常攜帶的5個毒力基因，但這幾種毒力因子只是肺炎克雷伯菌作為機會致病菌的低致病力的毒力因子，其中：和編碼合成菌毛上的黏附素，位于菌毛頂端，該黏附素可激發(fā)機體的保護性免疫反應(yīng)；與脂多糖的合成有關(guān)，以維持菌株細胞壁結(jié)構(gòu)；是尿素酶基因。本研究發(fā)現(xiàn)，分離株攜帶、、、毒力因子比較多，推斷是分離株產(chǎn)生較強毒力的原因之一。本研究獲得的分離株中，攜帶的僅1株。有研究報道，是莢膜多糖合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因，可調(diào)控多種血清型合成，一般認為與K1、K2型肺炎克雷伯菌株有關(guān)，這從另一個側(cè)面說明，該地區(qū)確實K1、K2血清型菌株的數(shù)量較少。

據(jù)報道，豬源肺炎克雷伯菌可引起小鼠肝、脾、肺病變；扭角羚源肺炎克雷伯菌引起肺、脾病變；肉牛上呼吸道肺炎克雷伯菌引起肺、肝和腸道病變。本試驗選取全部肺炎克雷伯菌分離株進行小鼠致病性試驗，病理剖檢可見，死亡小鼠的肺、肝、脾、腎等實質(zhì)器官均出現(xiàn)腫大、出血，腸道積氣、積液、出血等病變。除心臟未見明顯病理改變外，肝見輕度淤血、炎性浸潤，脾中白髓部分細胞壞死，肺呈輕度炎性浸潤，腎中的腎小球出現(xiàn)腫大和集合管局部絮狀物沉積等病理改變，其中，強毒力菌株對小鼠組織造成的病理現(xiàn)象更加明顯，推測強毒力菌株對肉牛的臨床危害更加嚴重，應(yīng)注重對強毒力菌株的預(yù)防和治療。有研究表明，肺炎克雷伯菌能與中性粒細胞相互作用。中性粒細胞是機體抗擊病原微生物最重要的固有免疫細胞，而菌體表面的厚莢膜可抵抗吞噬細胞的吞噬作用，是肺炎克雷伯菌重要的毒力機制之一。與菌體有關(guān)的脂多糖、黏附素和鐵載體等都會引起機體致病，并且未被機體免疫系統(tǒng)殺滅的細菌能發(fā)生遠處擴散和轉(zhuǎn)移，這也是導致該菌雖然是呼吸道機會致病菌，卻也能引起機體其他器官受損的原因之一。