馬齒莧多糖對LPS誘導小鼠急性肺損傷的實驗研究

黃小強 祝丹江 王魯豫 陳雨田 孫嘉寧 黃濤 賈安

【摘 要】 目的：研究馬齒莧多糖對脂多糖（LPS）誘導小鼠急性肺損傷（ALI）的影響。方法：將60只體重為18～20 g昆明種小鼠隨機分6組。分別為正常組，LPS組，醋酸地塞米松組[0.005 g/（kg·d）]，馬齒莧多糖低、中、高劑量組[1.5、3、6 g/kg/d，生藥量]，每組10只，先連續(xù)灌胃給藥14 d，每天1次，第14天給藥2 h后，利用LPS建立小鼠ALI動物模型，除正常組小鼠氣管滴注等量生理鹽水外，其他各組滴注LPS（10 mg/kg）溶液，12 h后酶聯(lián)免疫吸附劑法測定血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）和白介素6（IL-6）含量以及肺組織中髓過氧化物酶（MPO）活性，計算肺組織濕/干重（W/D）值，并進行肺組織病理切片檢查。結(jié)果：與正常組比較，LPS組中W/D值，TNF-α和IL-1β含量及MPO活性均顯著性升高（P<0.05或0.01）;與LPS組比較，醋酸地塞米松組、馬齒莧多糖中劑量和高劑量組中W/D值，TNF-α和IL-1β含量及MPO活性、肺損傷評分均顯著降低（P<0.05或0.01）。結(jié)論：馬齒莧多糖具有一定的保護ALI作用，其機制可能與抑制體內(nèi)炎性介質(zhì)釋放有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 馬齒莧多糖;脂多糖;急性肺損傷;小鼠

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2022）06-0035-05

Experimental Study of Purslane Polysaccharide on LPS-induced Acute Lung Injury in Mice

HUANG Xiaoqiang ZHU Danjiang WANG Luyu CHEN Yutian SUN Jianing HUANG Tao JIA An*

Medical School， Huanghe Science & Technology College， Zhengzhou 450063， China

Abstract：Objective To investigate the effects of Purslane Polysaccharide on lipopolysaccharide induced ALI in mice. Methods Sixty KM mice weighing 18-20 g were randomly divided into 6 groups： Normal group， LPS group， Dexamethasone group （0.005 g/kg/d）， Purslane Polysaccharide low-dose， medium-dose and high-dose groups （1.5， 3， 6 g/kg/d ）， with 10 mice in each group， First continuous gavage for 14 days， once a day. 2 hours after the last administration， On the 14th day， 2 hour after administration， LPS was used to establish ALI animal model， Except for the normal group， the mice were injected with the same amount of normal saline in the trachea， and the other groups were injected with LPS （10 mg/kg） solution. After 12 hours， the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in serum and the activity of myeloperoxidase （MPO） in lung tissue were measured， and pathological examination of lung tissue was performed. Results Compared with the normal group， The contents of W/D， TNF-α， IL-1β and MPO activity in LPS group were significantly increased （P<0.05， P<0.01）; Compared with LPS group， W/D value， contents of TNF - α and IL-1 β， MPO activity and lung injury score in dexamethasone acetate group， Purslane Polysaccharide medium dose group and high dose group were significantly decreased （P<0.05，P< 0.01）. Conclusion Purslane Polysaccharide can protect the acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice， and its mechanism may be related to inhibiting the release of inflammatory mediators in the body.

Key words：Purslane Polysaccharide; Lipopolysaccharide; Acute Lung Injury; Mice3279B876-4376-42C3-901C-A70546950AAD

急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）是急診科室中最常見的危重病之一，它的特點是肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，同時伴隨蛋白質(zhì)的滲出、大量炎癥介質(zhì)及因子的釋放[1]。炎癥細胞因子和相關(guān)介質(zhì)伴隨ALI的發(fā)生與發(fā)展全過程，例如TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS和NO等[2]。ALI在臨床上具有較高的死亡率和發(fā)病率，其死亡率然高達40%～60%[3]。馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧（Portulaca oleracea L.）的干燥地上部分，全國絕大地區(qū)均有分布，中國藥典（2020版）記載具有清熱解毒、涼血止血、止痢的功效[4];由于富含多種營養(yǎng)成分，其中以維生素及ω-3脂肪酸最為突出，因此馬齒莧也是一種營養(yǎng)價值較高的食物[5]。國內(nèi)外學者研究[6-8]發(fā)現(xiàn)馬齒莧的主要化學成分包括：多糖類、黃酮類、生物堿類、有機酚酸類等，同時藥理學研究[9-12]發(fā)現(xiàn)，馬齒莧多糖具有一定程度地降低炎癥因子和護肝等作用。為了探討馬齒莧多糖是否對ALI的保護作用，本研究應用馬齒莧多糖對LPS誘導ALI小鼠模型開展相關(guān)研究。為馬齒莧今后進一步深入開發(fā)和臨床應用提供一定參考。

1 材料與儀器

1.1 試藥 馬齒莧（張仲景大藥房）;脂多糖（美國Sigma公司）;醋酸地塞米松片（遂成藥業(yè)股份有限公司）;腫瘤壞死因子ɑ（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）和白介素6（IL-6）ELISA檢測試劑盒（上海西塘生物科技有限公司）;髓過氧化物酶（MPO）活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 動物 60只清潔級KM雄性小鼠，體重18～20 g，由黃河科技學院醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物房光照條件12 h/d，溫度20～23 ℃，相對濕度40%～60%，小鼠適應性飼養(yǎng)7 d后用于實驗。

1.3 儀器 多功能酶標儀（奧地利，Infinite公司）;高速臺式冷凍離心機（美國，賽默飛世爾科技有限公司）;FY135型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）;DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科技有限公司）;BS-3000A系列電子天平（上海友聲衡器有限公司）;光學顯微鏡（日本，OLYMPUS）;RM2125型石蠟切片機（德國，Leica公司）。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 馬齒莧多糖的制備[13-14] 將馬齒莧粗粉，過10目篩，稱取500 g，加入4倍量無水乙醇浸泡24 h，抽濾，60 ℃烘干藥渣，然后加入10倍量的蒸餾水，置于80 ℃水浴鍋中溫浸2 h，溫浸提取2次，合并2次濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至200 mL，然后加入800 mL無水乙醇至80%，劇烈搖勻，4 ℃低溫靜置分層，抽濾，收集沉淀，即為馬齒莧粗多糖。沉淀完全溶于蒸餾水后加入適量活性炭進行脫色，抽濾，再加入少量Sevage試劑，充分震蕩，靜置分層，收集上清液，減壓濃縮，并真空冷凍干燥，得馬齒莧多糖，-20 ℃低溫保存?zhèn)溆?。采用硫?苯酚法對馬齒莧多糖含量進行測定[15]，其工作曲線為C=3.6311A+0.0023，R2=0.9991，測定馬齒莧多糖含量為62.22%

2.1.2 醋酸地塞米松溶液的制備 取適量將醋酸地塞米松片置于研缽中，充分研磨，用生理鹽水配制成濃度為0.0005 g/mL的溶液，備用。

2.2 分組、造模與給藥 將60只清潔級KM小鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為6組：正常組，LPS型組，醋酸地塞米松組（0.005 g/kg·d），馬齒莧多糖低、中、高劑量組（1.5、3、6 g/kg/d，生藥材），每組10只，按10 mL/kg體重灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d，除正常組和LPS組小鼠給予等量常溫生理鹽水，其他各組給予相應體積的藥物。末次給藥后2 h，采用鼻腔滴注法慢慢滴注LPS生理鹽水溶液（0.5 mL/kg），正常組按照相同的方法給予相應體積的生理鹽水[16]。建立模型[17]后小鼠禁食不禁水12 h，采用眼眶取血，隨后脫臼處死，并迅速取出肺組織，備用。

2.3 肺組織W/D值計算[18] 取小鼠右肺上葉，剔除肺組織上面結(jié)締組織，同時利用濾紙吸盡組織表面水分和血液，并稱量記錄為肺組織濕重;隨后將肺組織放置于溫度為80 ℃干燥箱中連續(xù)干燥48 h后，稱量記錄為肺組織干重，計算（W/D）。

2.4 肺組織中MPO活性測定 取適量小鼠肺組織置于組織勻漿器中，按試劑盒說明書操作制備成5%的肺組織勻漿液，并檢測MPO活性。

2.5 血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量測定 取血后，在低溫條件下4000 r/min離心10 min分離血清，取上清;按照試劑盒說明書步驟，采用酶聯(lián)免疫吸附劑法測定各組血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

2.6 肺組織病理學檢查 切下右肺組織下葉經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h后，用蒸餾水沖洗至無多聚甲醛味;然后進行常規(guī)的石蠟包埋，切片厚度5 μm。進行切片脫蠟、蘇木素-伊紅染色、封片。在光學顯微鏡下進行病理學觀察分析，根據(jù)肺泡壁厚度、肺組織破壞和炎癥細胞浸潤情況進行評分[19]。評分標準：0分=最小損傷;1分=輕度損傷;2分=中度損傷;3分=重度損傷;4分=最大損傷。肺損傷評分為3個指標評得分之總和。

2.7 統(tǒng)計學方法 本實驗結(jié)果采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計處理分析，計量資料均以均數(shù)加減標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 馬齒莧多糖對肺組織W/D值的影響 與正常組比較，LPS組小鼠肺組織W/B值顯著性升高（P<0.01）。與LPS組比較，經(jīng)過馬齒莧多糖干預后各劑量組小鼠W/B值均有不同程度降低，其中中劑量和高劑量組均具有統(tǒng)計學差異（P<0.05或0.01）。見表1。3279B876-4376-42C3-901C-A70546950AAD

3.2 馬齒莧多糖對肺組織中MPO活性的影響 與正常組比較，LPS組小鼠肺組織中MPO活性顯著性升高（P<0.01）。與LPS?? 組比較，經(jīng)過馬齒莧多糖干預后各劑量組小鼠MPO活性均有不同程度降低，其中中劑量和高劑量組均具有統(tǒng)計學差異（P<0.05或<0.01）。見表2。

3.3 馬齒莧多糖對血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量影響 與正常組比較，LPS組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著性升高（P<0.01）。與LPS組比較，經(jīng)過馬齒莧多糖干預后各劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均有不同程度降低，其中中劑量和高劑量組均具有統(tǒng)計學差異（P<0.05或P<0.01）。見表3。

3.4 馬齒莧多糖對肺組織病理形態(tài)學的影響 正常組小鼠肺組織的結(jié)構(gòu)清晰、無滲出液，同時也沒有出現(xiàn)水腫及炎細胞浸潤等現(xiàn)象。LPS組小鼠的肺組織出現(xiàn)明顯的炎性浸潤，肺泡間隔增厚及間質(zhì)水腫等較為嚴重的病理損傷現(xiàn)象，與正常組比較，LPS組小鼠肺損傷評分顯著性升高（P<0.01）。與LPS組比較，經(jīng)過馬齒莧多糖干預后各劑量組小鼠肺組織損傷均有不同程度的改善，同時肺損傷評分也有不同程度降低。如圖1所示。

4 討論

該研究通過鼻腔滴注LPS溶液建立ALI小鼠動物模型。在滴注LPS后2～4 h內(nèi)可誘發(fā)ALI，在24～48 h內(nèi)便可造成最大肺損傷[20]，該種方法可有效避免由于皮下注射LPS溶液引起的全身炎癥反應和臟器官衰竭[21]。革蘭陰性菌感染導致的肺炎是ALI最常見的誘導因素之一，由于LPS刺激巨噬細胞，從而導致機體大量釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子，進一步引發(fā)急性炎癥反應[22]。目前國內(nèi)外關(guān)于ALI的致病機制尚不明確，有學者[23]認為，ALI發(fā)生的主要原因是體內(nèi)促炎和抗炎系統(tǒng)失衡。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖能夠顯著性降低TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥細胞含量，提示馬齒莧多糖對LPS誘導的ALI作用與其抑制炎癥因子分泌有關(guān)。

肺組織的W/D值大小在一定程度上反映了水腫的程度[24]，肺水腫程度與W/D值密切相關(guān)，W/D值越大則肺水腫程度越大，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖能夠顯著降低W/D值，從而緩解LPS所誘導的ALI。肺組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)LPS組小鼠肺組織損傷嚴重，通過馬齒莧多糖干預后上述病理變化明顯得到減輕。

綜上，本研究結(jié)果顯示：馬齒莧多糖能夠降低肺組織W/D值和肺組織中MPO活性，同時降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子含量，提示馬齒莧多糖對LPS所致的ALI具有一定的保護作用，其作用機制與抑制炎癥因子分泌有關(guān)。

參考文獻

[1]MARKUS B， WARD P A . Protein-based therapies for acute lung injury： targeting neutrophil extracellular traps[J]. Expert opinion on therapeutic targets， 2014，18（6）：703-714.

[2]ASCHNER Y， ZEMANS R L， YAMASHITA C M， et al. Matrix Metalloproteinases and Protein Tyrosine Kinases： Potential Novel Targets in Acute Lung Injury and ARDS[J]. Chest， 2014， 146（4）：1081-1091.

[3]盧悅，張平平，王東強，等.急性肺損傷中醫(yī)病因病機的探討[J].中國中醫(yī)急癥，2020，29（2）：280-282.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：51.

[5]ALAM M A， JURAIMI A S， RAFII M Y， et al. Genetic improvement of Purslane （Portulaca oleracea L.） and its future prospects[J]. Molecular Biology Reports， 2014，41（11）：7395-7411.

[6]李海濤，葛翎，段國梅，等.馬齒莧的化學成分及藥理活性研究進展[J].中國野生植物資源，2020，39（6）：43-47.

[7]王文舉，孔瑩.馬齒莧化學成分研究[J].遼寧師范大學學報（自然科學版），2016，39（4）：517-521.

[8]姚佳琪， 孟娜， 宋少江，等.馬齒莧的化學成分[J].沈陽藥科大學學報， 2007 （12） ：751-753.

[9]趙蕊，吳桐，陳昭，等.馬齒莧多糖對小鼠抗炎及鎮(zhèn)痛作用的實驗研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2017，29（5）：28-32.

[10]歐海玲，張秀玲，孫平良，等.馬齒莧多糖對胃癌SGC7901細胞增殖和凋亡的影響[J].中國癌癥防治雜志，2020，12（4）：431-434.

[11]黃小強，丁輝，劉順和，等.馬齒莧多糖對四氯化碳誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用[J].食品工業(yè)科技，2020，41（23）：315-319，324.

[12]梁彥，張傳軍，呂艷榮.馬齒莧多糖對高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠的作用及機制[J].食品科學，2014，35（3）：217-220.

[13]趙二勞，劉樂，楊潔，等.菜籽粕多糖提取純化及其功能活性研究進展[J].食品研究與開發(fā)，2020，41（16）：214-219.3279B876-4376-42C3-901C-A70546950AAD

[14]楊金磊.馬齒莧多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)分析[D].長春：東北師范大學，2019.

[15]陳紅惠， 牛念拉姆. 底圩茶多糖的超聲波輔助提取及其抗氧化活性[J]. 食品工業(yè)科技， 2020， 41（21）：187-192.

[16]JIANG K F， ZHANG T， YIN N N， et al. Geraniol alleviates LPS-induced acute lung injury in mice via inhibiting inflammation and apoptosis[J]. Oncotarget， 2017， 8（41）：71038-71053.

[17]曹志敏，唐明美，文強，等. 內(nèi)毒素所致急性肺損傷動物模型的研究進展[J]. 實驗動物科學， 2017， 1（34）：66-69，74.

[18]王林，李紅波，劉南，等.和厚樸酚對脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠的保護作用[J].中藥新藥與臨床藥理， 2016， 27（6）：810-815.

[19]LIU T， ZHOU Y， LI P， et al. Blocking triggering receptor expressed on myeloid cells-1 attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury via inhibiting NLRP3 inflammasome activation[J]. Scientific reports， 2016， 6（1）：39473-39480.

[20] CHEN H， BAI C， WANG X . The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine.[J]. Expert Rev Respir Med， 2010， 4（6）：773-783.

[21]褚純雋，任慧玲，李顯倫，等.野馬追提取物對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的保護作用[J].華西藥學雜志， 2015， 30（6）：653-656.

[22]郭蘇蘭，李佳娜，肖水秀.阿里紅多糖對用脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠肺組織的保護作用及相關(guān)機制[J].當代醫(yī)藥論叢， 2019，17（10）：127-130.

[23]肖歸，陳廣文，李濤，等.HSF1通過抑制中性粒細胞浸潤減輕LPS誘導的小鼠急性肺損傷[J].中國病理生理雜志，2022，38（1）：26-32.

[24]洪輝華，蔡宛如.急性肺損傷的發(fā)病機制及中醫(yī)藥治療的實驗研究進展[J].浙江中醫(yī)藥大學學報，2007，31（1）：133-135.

（收稿日期：2021-08-06 編輯：陶希睿）3279B876-4376-42C3-901C-A70546950AAD