Hippo-YAP信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞衰老的分子機(jī)制*

詹永通， 吳桂豪， 范旭紅， 陳路苗， 陳同生， 王小平△

（1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院疼痛科，廣東 廣州 510630；2華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，廣東 廣州 510631）

作為Hippo 信號(hào)通路的主要效應(yīng)蛋白，Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）主要通過與轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)相關(guān)結(jié)構(gòu)域（transcriptional enhanced associate domain，TEAD）/非TEAD 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的方式調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄［1］。YAP 蛋白的結(jié)構(gòu)主要包括WW 結(jié)構(gòu)域（介導(dǎo)非TEAD 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合）、TEAD 結(jié)合域（介導(dǎo)TEAD 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合）、C 端轉(zhuǎn)錄激活域（介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活）、C 末端PDZ 結(jié)合域（核定位所需）、卷曲螺旋域（介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用）、N 末端富含脯氨酸基序（抑制轉(zhuǎn)錄活性）和SH3 結(jié)合基序（介導(dǎo)含SH3 結(jié)構(gòu)域蛋白的相互作用）［2］。YAP 廣泛參與細(xì)胞增殖與細(xì)胞分化的調(diào)控，是不同器官生長與再生所必需的轉(zhuǎn)錄共激活因子，在器官再生與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛研究［3］。同時(shí)YAP 通過調(diào)控細(xì)胞增殖以及凋亡，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移，是目前腫瘤相關(guān)研究的重點(diǎn)［4］。另外，近年來YAP 調(diào)控細(xì)胞衰老的研究也逐漸增多［5-7］。

細(xì)胞衰老是細(xì)胞應(yīng)激因素誘導(dǎo)的細(xì)胞周期永久性停滯狀態(tài)［8］。細(xì)胞衰老分為復(fù)制性衰老和壓力誘導(dǎo)的過早衰老。端粒短縮、DNA 損傷、氧化應(yīng)激、炎癥、原癌基因激活等促衰老因素主要通過p53-p21-RB（retinoblastoma protein）和p16INK4A-RB 兩種信號(hào)通路的激活來誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。細(xì)胞發(fā)生衰老后具有永久性生長停滯、分泌衰老相關(guān)表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）及抵抗凋亡等特征。急性衰老細(xì)胞具有修復(fù)受損組織以及預(yù)防惡性腫瘤發(fā)生等積極作用［9-10］。而慢性衰老細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致衰老細(xì)胞的積累以及衰老相關(guān)分泌表型的長期影響，最終導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生［11］。研究表明慢性細(xì)胞衰老與癌癥［12］、動(dòng)脈粥樣硬化［13］、骨關(guān)節(jié)炎［14］等年齡相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。選擇性清除衰老細(xì)胞可以延緩小鼠腫瘤的進(jìn)展，改善動(dòng)脈粥樣硬化［13］，減輕骨關(guān)節(jié)炎的疾病進(jìn)展［15］以及延長小鼠健康壽命等作用［16］。Hippo-YAP 信號(hào)通路主要與組織發(fā)育、再生以及穩(wěn)態(tài)等方面有關(guān)［1］。同時(shí)研究提示Hippo-YAP 信號(hào)通路與細(xì)胞衰老的發(fā)生存在一定的聯(lián)系，可能是調(diào)控細(xì)胞衰老的新途徑［5-7］。

本文介紹了Hippo-YAP 信號(hào)通路的結(jié)構(gòu)及功能、Hippo-YAP 信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞衰老的分子機(jī)制以及Hippo-YAP 信號(hào)通路對(duì)衰老相關(guān)疾病的治療現(xiàn)狀的研究進(jìn)展，期望為衰老相關(guān)疾病的分子機(jī)制研究及臨床疾病治療提供參考。

1 Hippo-YAP信號(hào)通路

作為Hippo信號(hào)通路的主要效應(yīng)蛋白，YAP廣泛參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展、細(xì)胞的增殖與分化以及細(xì)胞的凋亡與衰老的調(diào)控［17］。YAP 是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，需要與細(xì)胞核內(nèi)的TEAD/非TEAD 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后才可調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。當(dāng)Hippo 信號(hào)通路被激活，通過一系列激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，YAP 發(fā)生磷酸化被滯留在細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而被蛋白酶水解而失活［3］。而當(dāng)Hippo信號(hào)通路失活，未被磷酸化的YAP會(huì)被轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞核與TEAD 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮其多種生物學(xué)作用。YAP 作為協(xié)調(diào)生物力學(xué)信號(hào)、能量代謝及發(fā)育信號(hào)級(jí)聯(lián)之間的紐帶，在細(xì)胞生長發(fā)育中發(fā)揮重要的作用［18］。

1.1 YAP 激活過程 YAP 的激活過程包括經(jīng)典的Hippo 信號(hào)通路以及非依賴Hippo 信號(hào)通路兩種途徑。生物力學(xué)信號(hào)，可溶性配體，應(yīng)激以及組織損傷與炎癥等上游激活因素可通過經(jīng)典Hippo 信號(hào)通路調(diào)節(jié)YAP 的活性［19-22］。上述激活因素可引起哺乳動(dòng)物不育系20 樣激酶1/2（mammalian sterile 20-like kinase 1/2，Mst1/2）發(fā)生磷酸化激活，然后引起薩爾瓦多家族同源物1（Salvador homolog 1，SAV1）及MOB（Mps one binder）1A/B 的磷酸化［23］。磷酸化的SAV1與磷酸化的Mst1/2 形成復(fù)合體后可招募大腫瘤抑制因子1/2（large tumor suppressor 1/2，LATS1/2）并使其磷酸化而激活。激活后的LATS1/2 與前面被激活的MOB1A/B 形成的蛋白聚合物可導(dǎo)致YAP 發(fā)生磷酸化（圖1）［18］。其中MST1/2 和LATS1/2 的磷酸化是經(jīng)典Hippo 信號(hào)通路的關(guān)鍵步驟。部分上游調(diào)節(jié)因素也可以直接引起LATS1/2 磷酸化。磷酸化的YAP 與14-3-3 蛋白結(jié)合后滯留在細(xì)胞質(zhì)中，被酪蛋白激酶1δ/1ε 進(jìn)一步磷酸化和SCFβ-TRCPE3 泛素連接酶復(fù)合物泛素化，最后被蛋白酶體降解［24］（圖1）。若Hippo信號(hào)通路被抑制，不被磷酸化的YAP 會(huì)被轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞核而激活。除了經(jīng)典的Hippo信號(hào)通路，上游激活因素也可以通過非依賴Hippo 信號(hào)通路激活YAP。非依賴Hippo 信號(hào)通路不依賴于MST1/2 及LATS1/2等關(guān)鍵酶的激活，而是通過肌動(dòng)蛋白的張力傳導(dǎo)改變細(xì)胞核孔的滲透性或者其他蛋白直接磷酸化YAP來調(diào)控YAP 的活性。目前研究表明，黏著斑（focal adhesion，F(xiàn)A）、黏附連接（adherens junctions，AJs）、緊密連接（tight junctions，TJs）、Wnt-β-連環(huán)蛋白、甲基化與磷酸化、Notch 信號(hào)通路及TGF-β 信號(hào)通路可以不依賴Hippo信號(hào)通路調(diào)節(jié)YAP的激活［25-27］。

Figure 1. Activation of Hippo-Yes-associated protein （YAP）signaling pathway. MST1/2：mammalian sterile 20-like kinase 1/2；SAV1：Salvador homolog 1；MOB1A/B：Mps one binder 1A/B；LATS1/2：large tumor suppressor 1/2；P：phosphorylation.圖1 Hippo-YAP信號(hào)通路激活過程

1.2 參與Hippo-YAP 信號(hào)通路調(diào)節(jié)的上游激活因素

1.2.1 生物力學(xué)信號(hào) 細(xì)胞外基質(zhì)硬度、細(xì)胞密度及流體剪切力三部分生物力學(xué)信號(hào)通過機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，將細(xì)胞外壞境的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)換為生物化學(xué)信號(hào)，引起細(xì)胞YAP 活性的改變，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞適應(yīng)外壞境的變化［28-29］。

細(xì)胞外基質(zhì)主要通過改變LATS1/2 活性及細(xì)胞核孔通透性來調(diào)節(jié)YAP 的活性。一方面，細(xì)胞外基質(zhì)的硬度可以作用于細(xì)胞表面的FA 和其他黏附蛋白，影響應(yīng)力纖維細(xì)胞骨架的張力狀態(tài)，通過一系列酶的激活，引起LATS1/2 活性的改變，進(jìn)而最終影響YAP 的活性。根據(jù)細(xì)胞類型的不同可分為兩種途徑：整合素（integrin）-FA 激酶（FA kinase，F(xiàn)AK）-SRC（steroid receptor coactivator）-PI3K（phosphatidylinositol 3-kinase）-PDK1（3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1）［30］和 整 合 素-FAK-p130Cas-Rac1-PAK（p21-activated kinase）-merlin［31］。另一方面，F(xiàn)A 感受到細(xì)胞外基質(zhì)硬度改變后，會(huì)引起應(yīng)力纖維細(xì)胞骨架的張力狀態(tài)發(fā)生改變，通過細(xì)胞核骨架和細(xì)胞骨架的連接子（linker of nucleoskeleton and cytoskeleton，LINC）來調(diào)節(jié)YAP 活性。當(dāng)細(xì)胞在硬的細(xì)胞外基質(zhì)中，應(yīng)力纖維和LINC 形成的粘連將機(jī)械力傳遞到細(xì)胞核，導(dǎo)致細(xì)胞核的拉伸，進(jìn)而增加核孔的滲透性，引起YAP進(jìn)入細(xì)胞核增多而激活［25］；當(dāng)細(xì)胞在軟的細(xì)胞外基質(zhì)中，應(yīng)力纖維與LINC 解偶聯(lián)，無法通過LINC 將機(jī)械力轉(zhuǎn)遞給細(xì)胞核，細(xì)胞核孔不發(fā)生改變，YAP滯留在細(xì)胞質(zhì)而被降解［32］。

細(xì)胞密度主要通過FA、AJs 及TJs 三種途徑來改變YAP 活性。細(xì)胞密度的FA 途徑與細(xì)胞外基質(zhì)硬度的調(diào)節(jié)相似。當(dāng)細(xì)胞密度降低時(shí)，每個(gè)細(xì)胞表面的FA 數(shù)量增加，引起連接到FA 上的F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的張力增加，LATS1/2活性或者細(xì)胞核孔大小發(fā)生改變［33］。細(xì)胞密度的AJs 途徑主要通過α-連環(huán)蛋白結(jié)合merlin 蛋白來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)細(xì)胞密度增加，α-連環(huán)蛋白作為AJs 的成分之一隨之增加，結(jié)合的merlin 蛋白增加；merlin 蛋白可以結(jié)合并隔離LATS1/2，但是會(huì)引起LATS1/2 反饋性增加，引起YAP 磷酸化增加，YAP 活性降低，細(xì)胞增殖受到抑制［34］。細(xì)胞密度的TJs 途徑主要通過血管動(dòng)蛋白樣蛋白2（angiomotin-like protein 2，AMOTL2）介導(dǎo)。AMOTL2可以直接激活LATS2并促進(jìn)LATS2與YAP結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞密度增加，AMOTL2 數(shù)量增加，活化的LATS2 增加，磷酸化的YAP增加，細(xì)胞增殖同樣受到抑制［35］。

流體剪切力同樣可以改變YAP的活性。研究表明，層流液體所致的剪切力會(huì)抑制YAP活性，而湍流液體所致的剪切力會(huì)促進(jìn)YAP進(jìn)入細(xì)胞核。同時(shí)流體剪切力也可以影響間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的YAP 表達(dá)水平。研究表明，流體剪切力主要是通過整合素、Gα13和Rho起作用的［36］。

1.2.2 可溶性配體 可溶性配體（細(xì)胞外配體）通過與對(duì)應(yīng)的細(xì)胞表面受體結(jié)合，引起MST1/2 或LATS1/2 活性改變來調(diào)節(jié)YAP 的磷酸化。根據(jù)細(xì)胞表面受體的不同，主要分為兩類：G 蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptor，GPCR）可溶性配體和受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）可溶性配體。一方面，溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）、鞘 氨 醇-1- 磷 酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）、胰高血糖素和腎上腺素等配體與GPCR 結(jié)合后，激活異源三聚體G12/13、Gq/11 和Gi/o，進(jìn)而抑制LATS1/2 磷酸化，促進(jìn)YAP 轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞核增加［20］。上述配體也可以激活異源三聚體Gs，引起LATS1/2磷酸化增加，YAP 活性降低［20］。另一方面，表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）結(jié)合RTK 后通過PI3K-PDK1 信號(hào)通路抑制MST1/2 的磷酸化作用，進(jìn)而使LATS1/2活化，促進(jìn)YAP轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞核增加［30］。

1.2.3 能量應(yīng)激、滲透壓應(yīng)激和缺氧應(yīng)激 能量應(yīng)激、滲透壓應(yīng)激及缺氧應(yīng)激等細(xì)胞微壞境壓力也將影響YAP的活性。在營養(yǎng)缺乏和ATP抑制劑等能量應(yīng)激的情況下，胞質(zhì)中的AMP 活化蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）活 化，活 化 后 的AMPK 一方面可以引起LATS1/2 激活而增加YAP 的磷酸化，另一方面可以直接磷酸化YAP 的第94 位絲氨酸殘基，阻礙YAP 與TEAD 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而抑制YAP 功 能［37］。滲 透 壓 應(yīng) 激 通 過Nemo 樣 激 酶（Nemo-like kinase，NLK）引起YAP 第128 位絲氨酸發(fā)生磷酸化，從而抑制14-3-3 與YAP 的結(jié)合并促進(jìn)YAP 轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞核［38］。14-3-3 通過結(jié)合YAP 而促進(jìn)YAP 在胞質(zhì)降解，所以抑制14-3-3 與YAP 的結(jié)合也促進(jìn)了YAP 的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移［38］。此外，缺氧應(yīng)激則通過SIAH2 泛素E3 連接酶抑制LAST2 的功能來促進(jìn)YAP的核轉(zhuǎn)移［39］。

1.2.4 炎癥和組織損傷 肝、皮膚、心肌及腸上皮的損傷會(huì)引起活化的YAP 增加，進(jìn)而促進(jìn)損傷組織的修復(fù)［40］。同時(shí)炎癥細(xì)胞因子，如前列腺素E2和腫瘤壞死因子也可激活YAP［22］。目前炎癥及組織損傷如何調(diào)控YAP的活性尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

1.3 YAP 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子 YAP 作為轉(zhuǎn)錄共激活蛋白，需與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后才能發(fā)揮其生物學(xué)功能。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子是否含有TEAD 分為TEAD 轉(zhuǎn)錄因子和非TEAD 轉(zhuǎn)錄因子。TEAD 轉(zhuǎn)錄因子在哺乳動(dòng)物中可分為4 型：TEAD1、TEAD2、TEAD3 和TEAD4，幾乎在所有類型的組織中均有表達(dá)［41］。TEAD 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)包括N 端的DNA 結(jié)合域（DNA binding domain，DBD）、C 端的YAP 結(jié)合域（YAP binding domain，YBD）及 富 含 脯 氨 酸 的 氨 基 酸 序 列［42］。TEAD1～4 具有61%～73%的整體同源性，并且DBD及YBD 具有90%以上的同源性［41］。TEAD1 與心肌細(xì)胞分化發(fā)育的關(guān)系較大，TEAD2 可能會(huì)影響神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，TEAD3 主要功能的相關(guān)研究仍較少，TEAD4 主要影響胚胎植入相關(guān)基因的表達(dá)［43］。YAP 與TEAD1～4 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后，影響下游基因表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及衰老等細(xì)胞行為進(jìn)行調(diào)控。YAP 結(jié)合的非TEAD 轉(zhuǎn)錄因子主要包 括Smad2/3、RUNX2/3、p63、p73、octamer-binding transcription factor 4 （OCT4）、PR/SET domain 4（PRDM4）、MYC、Krüppel-like factor 5（KLF5）、Erb-B2 receptor tyrosine kinase 4（ERBB4）和early growth response-1（EGR-1），并且上述非TEAD 轉(zhuǎn)錄因子主要與腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)［44］。

1.4 YAP的主要生物學(xué)作用

1.4.1 YAP 參與調(diào)控腫瘤發(fā)生與發(fā)展 研究表明，除了血液系統(tǒng)惡性腫瘤和睪丸癌以外，YAP 在肺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、子宮頸鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤等大部分腫瘤中被異常激活［45］。YAP 被異常激活后，通過與p63、MYC 等促腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，影響細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞的強(qiáng)烈增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［46］（圖2）。在肺癌中，YAP 的高表達(dá)或活性增高與肺癌的高惡性程度和不良預(yù)后存在聯(lián)系［47］。在乳腺癌中，條件性敲除YAP可以減少小鼠乳腺癌的生長［48］，而YAP的過表達(dá)則可以賦予良性乳腺腫瘤肺轉(zhuǎn)移的能力［49］。在肝細(xì)胞癌中，敲減YAP或TAZ有效抑制人和小鼠肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的皮下腫瘤生長［50］，而YAP過表達(dá)則導(dǎo)致非致瘤性人肝細(xì)胞系出現(xiàn)致瘤性［46］。在膀胱癌中，使用敲減YAP表達(dá)水平可降低膀胱癌細(xì)胞活力并促進(jìn)其凋亡［51］。但是在頭頸癌的研究中顯示，YAP 主要發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的作用，并且敲減YAP增強(qiáng)了頭頸癌細(xì)胞系的增殖、存活、遷移和對(duì)順鉑的抗性［52］。在早幼粒細(xì)胞白血病中，YAP-1 作為一種腫瘤抑制因子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［53］。目前YAP在腫瘤中的作用仍存在爭議，不同腫瘤類型中YAP作用的差異可能與組織和細(xì)胞環(huán)境特異性有關(guān)［54-55］。

1.4.2 YAP 參與調(diào)控細(xì)胞增殖與分化 YAP 在體內(nèi)外可以促進(jìn)不同類型的細(xì)胞增殖。一方面，YAP與TEAD 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合可以直接影響有絲分裂激酶、DNA 復(fù)制蛋白及DNA 修復(fù)酶等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，維持細(xì)胞的增殖能力［56-57］（圖2）；另一方面，YAP 通過增加下游基因（如MYC等）的表達(dá)間接影響細(xì)胞增殖［58］。同時(shí)YAP 可以上調(diào)BCL-2（B-cell leukemia/lymphoma-2）、MCL-1（myeloid cell leukemia-1）等抗凋亡基因的表達(dá)，來維持細(xì)胞的存活［59］（圖2）。在小鼠體內(nèi)模型敲減MST1和MST1/2，或過表達(dá)YAP可以驅(qū)動(dòng)肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞的增殖，使肝臟和心臟過度生長。除了驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖，YAP還可以促進(jìn)細(xì)胞去分化以及獲得干細(xì)胞特性。研究表明YAP 在各種干細(xì)胞中高表達(dá)，而在分化細(xì)胞中低表達(dá)［60］。在體外，通過基因編輯手段過度激活YAP可以誘導(dǎo)細(xì)胞去分化并且重新成為干細(xì)胞［3］。

1.4.3 YAP 參與調(diào)控細(xì)胞凋亡與衰老 YAP 除了參與調(diào)控腫瘤發(fā)生和細(xì)胞增殖外，還參與調(diào)控細(xì)胞凋亡與細(xì)胞衰老。在調(diào)控細(xì)胞凋亡方面，YAP 通過影響抗凋亡和促凋亡基因的表達(dá)水平來發(fā)揮抗凋亡作用和促凋亡作用，這種作用差異主要取決于YAP結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子類型［55］。一方面，YAP 與TEAD 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)BCL-2、MCL-1、環(huán)加氧酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）、存活蛋白（survivin）及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter 1，Glut1）等抗凋亡基因的表達(dá)來抵抗凋亡的發(fā)生［61-62］（圖2）；另一方面，YAP 通過與非TEAD 轉(zhuǎn)錄因子p73 結(jié)合，促進(jìn)BAX（BCL-2-associated X protein）、PUMA（p53-upregulated modulator of apoptosis）等促凋亡基因的表達(dá)來發(fā)揮促凋亡作用［53，63］（圖2）。在調(diào)控細(xì)胞衰老方面，YAP 通過影響p53、p16和CDK6（cyclin-dependent kinase 6）等下游基因的表達(dá)水平或者細(xì)胞的自噬水平等途徑調(diào)控細(xì)胞衰老的發(fā)生（圖2）。在IMR90 細(xì)胞中，YAP 通過依賴TEAD 轉(zhuǎn)錄因子、p53、p16 和CDK6的方式抑制細(xì)胞衰老的發(fā)生，其中CDK6是YAP 調(diào)控細(xì)胞衰老的直接下游靶基因［64］。在HCT116 細(xì)胞中，Werner 綜合征蛋白（Werner syndrome protein，WRN）的缺失會(huì)引起YAP 的激活，從而加速細(xì)胞衰老的發(fā)生［65］。在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，YAP 通過促進(jìn)CDK6 蛋白的表達(dá)水平來抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的衰老［66］。在內(nèi)皮細(xì)胞中，YAP 通過阻斷自噬流和激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和血管組織的衰老［6］。因此，YAP 調(diào)控細(xì)胞衰老的作用與細(xì)胞類型相關(guān)［6，64-67］。

2 Hippo-YAP信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞衰老的機(jī)制

2.1 YAP-ATM（ataxia-telangiectasia mutated）-p53-p21 ATM-p53-p21 是細(xì)胞衰老發(fā)生的主要信號(hào)通路之一。細(xì)胞復(fù)制過程中或者氧化應(yīng)激等條件下，會(huì)引起DNA 的損傷以及隨后的DNA 損傷應(yīng)答（DNA damage response，DDR）。DDR 會(huì)激活A(yù)TM 激酶，隨后ATM 激酶通過依賴細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶2（cell cycle checkpoint kinase 2，CHK2）的方式磷酸化p53。磷酸化的p53 可以避免MDM2（mouse double minute 2）介導(dǎo)的蛋白酶體降解，并且激活下游靶基因CDKN1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A），引起p21 的表達(dá)水平增加［68］。p21 作為CDK 抑制劑，最終引起了細(xì)胞周期的停滯［69］（圖3）。Hippo信號(hào)通路核心成分與p53 之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，共同控制干細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老等過程。在細(xì)胞衰老方面，Hippo信號(hào)通路核心成分LATS2通過結(jié)合并抑制MDM2功能，從而穩(wěn)定p53不被降解并激活p53 的功能，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的發(fā)生［70］（圖3）。并且p53 作為轉(zhuǎn)錄因子作用下游靶基因引起LATS2 的表達(dá)增加，從而在p53 與LATS2 之間形成一種正反饋調(diào)節(jié)，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞衰老的發(fā)生［71］。Hippo信號(hào)通路的主要效應(yīng)蛋白YAP 同樣與p53 之間存在相互作用并調(diào)控細(xì)胞衰老的發(fā)生。研究表明，胞質(zhì)中的p53凋亡刺激蛋白1（apoptosis-stimulating protein of p53 1，ASPP1）可以結(jié)合并抑制LATS1的功能，引起YAP核積累增加。核內(nèi)的YAP 與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后導(dǎo)致LATS2 表達(dá)降低，從而降低了p53 誘導(dǎo)的p21 表達(dá)，阻止細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞衰老發(fā)生［72］（圖3）。同時(shí)，研究表明YAP 與p73 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后促進(jìn)PML（promyelocytic leukemia protein）的表達(dá)，PML 蛋白與YAP 之間形成的復(fù)合物可以保護(hù)YAP 免于降解，并且該復(fù)合物促進(jìn)了p53 的活化，最終促進(jìn)細(xì)胞衰老的發(fā)生［65］。另外，YAP 作為轉(zhuǎn)錄共激活因子，可以直接影響p53基因的表達(dá)水平，從而影響p53 的功能［73］（圖3）。

Figure 2. Yes-associated protein-transcription factors（YAP-TF）regulate cell proliferation，differentiation，apoptosis，senescence and tumorigenesis and development. BCL-2：B-cell leukemia/lymphoma-2；BAX：BCL-2-associated X protein；PUMA：p53-upregulated modulator of apoptosis；MCL-1：myeloid cell leukemia-1；Pol II：polymerase II；CDK9：cyclin-dependent protein kinase 9；AP-1：activating protein-1；SOX2：sex-determining region Y-box 2；OCT4：octamer-binding transcription factor 4.圖2 YAP-轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老及腫瘤發(fā)生發(fā)展

2.2 YAP-p16INK4A-CDK-RB p16INK4A-CDK-RB 是細(xì)胞衰老發(fā)生的另一主要信號(hào)通路。DNA 損傷、氧化應(yīng)激等促衰老因素分別通過p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）［74］和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）控制B 細(xì)胞特異性Moloney 鼠白血病病毒插入位點(diǎn)1（B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1，BMI1）和轉(zhuǎn)錄因子ETS1/2，引起p16INK4A表達(dá)增加［75］。隨后p16INK4A抑制CDK4 和CDK6 磷酸化RB 的能力，使RB 維持在低磷酸化狀態(tài)。低磷酸化的RB 結(jié)合和隔離轉(zhuǎn)錄因子E2F、DP1及DP2，抑制S 期基因的表達(dá)，引起細(xì)胞周期停滯［68］（圖3）。IMR90 成纖維細(xì)胞的研究表明，敲減YAP通過TEAD 和p53/p16/CDK6 依賴的方式促進(jìn)細(xì)胞衰老，并且CDK6作為YAP-TEAD 轉(zhuǎn)錄因子的下游靶基因參與細(xì)胞衰老的調(diào)控［64］（圖3）。YAP缺乏導(dǎo)致的衰老IMR90 細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中可以觀察到磷酸化RB 水平降低，并且敲減RB可以顯著降低YAP缺失誘導(dǎo)的IMR90 細(xì)胞衰老，表明YAP 通過CDK6 調(diào)控細(xì)胞衰老是RB 依賴的［64］。老年鼠和阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）模型小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞以及D-半乳糖或百草枯誘導(dǎo)的衰老星形膠質(zhì)細(xì)胞中YAP 水平都下調(diào)并且失活增加。與IMR90成纖維細(xì)胞相似，星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老的發(fā)生也與YAP 調(diào)控CDK6 的表達(dá)水平相關(guān)。除了與正常細(xì)胞的衰老有關(guān)，YAP調(diào)控的CDK6信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的衰老中也發(fā)揮重要的作用。在膠質(zhì)瘤的研究中顯示，低濃度的β-欖香烯通過抑制YAP-TEAD-CDK6 信號(hào)通路，降低了CDK6 的表達(dá)，從而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生衰老［76］。同時(shí)D-半乳糖也可以通過YAP-TEADCDK6 通路誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞衰老的發(fā)生［77］（圖3）。

2.3 YAP-自噬 自噬與衰老之間的關(guān)系尚存在一定的爭議，部分研究表明自噬抑制衰老的發(fā)生，但是同時(shí)也有研究提示自噬促進(jìn)衰老的發(fā)生。在抑制衰老方面，研究顯示衰老細(xì)胞的自噬水平明顯降低，自噬水平降低后會(huì)引起功能缺陷的線粒體在細(xì)胞內(nèi)積累，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙及活性氧（reactive oxygen species，ROS）相關(guān)的細(xì)胞衰老發(fā)生［78］。在促進(jìn)衰老方面，研究表明自噬通過啟動(dòng)細(xì)胞衰老來阻止黑色素瘤的發(fā)生［79］。同時(shí)自噬發(fā)生后，在溶酶體的幫助下產(chǎn)生大量的氨基酸，這些氨基酸可用于合成SASP因子來促進(jìn)衰老的發(fā)生［80］。Hippo-YAP信號(hào)通路與自噬之間存在廣泛的相互作用，并且Hippo信號(hào)通路的核心成分MST1、MST2 和YAP-TEAD 都參與了自噬調(diào)控，從而在衰老調(diào)控中發(fā)揮作用。MST1 可以直接磷酸化beclin-1，顯著減弱beclin-1-Vps34 和beclin-1-Atg14L的相互作用，在一定程度上抑制了自噬的發(fā)生［81］。但是與此同時(shí)，MST1/2 也可以通過磷酸化LC3-II 促進(jìn)自噬的發(fā)生［82］。另外，自噬作為YAP-TEAD的下游調(diào)控靶標(biāo)，YAP-TEAD通過影響自噬相關(guān)基因的表達(dá)影響自噬的水平［83］。Pan 等［6］的研究顯示，YAP過表達(dá)通過YAP-轉(zhuǎn)錄因子阻斷自噬或通過激活mTOR 信號(hào)通路間接阻斷自噬的方式，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和血管組織的衰老（圖3）。

Figure 3. The main mechanism of cellular senescence regulated by Yes-associated protein（YAP）. TEAD：transcriptional enhanced associate domain transcription factors；ATM：ataxia-telangiectasia mutated；CDK：cyclin-dependent protein kinase；RB：retinoblastoma protein；MAPK：mitogen-activated protein kinase；ERK：extracellular signal-regulated kinase；BMI1：Bcell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1；ASPP1：apoptosis-stimulating protein of p53；MDM2：mouse double minute 2；PML：promyelocytic leukemia protein；LATS：large tumor suppressor；mTOR：mammalian target of rapamycin.圖3 YAP調(diào)控細(xì)胞衰老的主要機(jī)制

2.4 YAP 調(diào)控細(xì)胞衰老的其他分子機(jī)制 Hippo-YAP 信 號(hào) 通 路 可 能 通 過AMPK、mTOR、sirtuin-1（SIRT1）、叉頭框蛋白D1（forkhead box protein D1，F(xiàn)OXD1）和轉(zhuǎn)錄因子SLUG來調(diào)控細(xì)胞衰老［84］。作為一種長壽相關(guān)激酶，AMPK 的激活可以延長生物模型的壽命［85］。AMPK 與YAP 之間存在廣泛的聯(lián)系，AMPK 可以在多個(gè)位點(diǎn)磷酸化YAP 并抑制其轉(zhuǎn)錄活性［37］，并且在第94 位絲氨酸磷酸化YAP 從而破壞YAP-TEAD 的相互作用［37］。mTOR 可以感受細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)和能量代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及衰老，研究提示消耗mTOR 可以延長中年小鼠的健康壽命［86］。Hippo-YAP信號(hào)通路是mTOR 的上游調(diào)節(jié)因素［87］，過表達(dá)YAP會(huì)增加mTOR 活性，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管組織衰老［6］。SIRT1 具有抗衰老和延長小鼠壽命的作用［88］。激活SIRT1 可以引起YAP 發(fā)生去乙?；瑴p少YAP的激活和核積累，從而中斷動(dòng)脈粥樣硬化斑塊地形成［89］。同時(shí)YAP 也可以激活SIRT1，誘導(dǎo)p53 的去乙酰化，從而抑制p53 相關(guān)的G0/G1細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)A549 細(xì)胞存活［90］。YAP與TEAD 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后可以激活FOXD1 的表達(dá)，從而使衰老的間充質(zhì)干細(xì)胞恢復(fù)活力［91］。同時(shí)，YAP-TEAD 結(jié)合SLUG 轉(zhuǎn)錄因子直接抑制促凋亡蛋白BCL-2 修飾因子（BCL-2 modifying factor，BMF）的產(chǎn)生，從而介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌衰老樣休眠狀態(tài)［92］。

3 靶向Hippo-YAP治療衰老相關(guān)疾病

3.1 YAP 加重或減輕骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA） OA 是一種關(guān)節(jié)退行性疾病，與細(xì)胞衰老存在一定的關(guān)聯(lián)性。膝關(guān)節(jié)組織中衰老細(xì)胞數(shù)量的積累與骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展有關(guān)［93］。將衰老軟骨細(xì)胞移植到正常小鼠的骨關(guān)節(jié)中，該關(guān)節(jié)也出現(xiàn)了OA 樣病理改變和癥狀［94］。另外，局部清除衰老細(xì)胞緩解了創(chuàng)傷后OA 的進(jìn)展并創(chuàng)造了一個(gè)促進(jìn)軟骨再生的環(huán)境［15］。目前靶向Hippo-YAP 治療骨關(guān)節(jié)炎的研究還處于基礎(chǔ)研究階段。Fu 等［91］的研究提示，YAP 以TEAD 依賴的方式，通過上調(diào)FOXD1 來抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老。通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射過表達(dá)YAP的慢病毒，可以觀察到衰老細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，并且減輕了前交叉韌帶橫斷手術(shù)構(gòu)建的OA 模型的病理損傷，減緩創(chuàng)傷后OA 的進(jìn)展（圖4A）。同時(shí)，沉默MST1/2或過表達(dá)YAP也可以維持小鼠OA 模型的關(guān)節(jié)軟骨完整性，提示YAP 是維持OA 軟骨穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵［95］。但是也有部分研究認(rèn)為YAP 會(huì)加重OA 的進(jìn)展。siRNA 抑制YAP的表達(dá)減少了軟骨退化和異常軟骨下骨形成，改善了OA 的病理表現(xiàn)［96］（圖4A）。同樣的，Zhang等［97］的研究也觀察到Y(jié)AP 在小鼠OA 加重過程中被激活，使得軟骨細(xì)胞逐漸退化。條件性敲除YAP或使用YAP選擇性抑制劑verteporfin 可以保護(hù)小鼠OA模型中退化的軟骨，并減輕OA 的病理表現(xiàn)。另外，阻斷ROR2 受體通過抑制YAP 信號(hào)通路也可以減輕OA 模型小鼠的關(guān)節(jié)疼痛，改善軟骨完整性［98］（圖4A）?？傊?，Hippo-YAP 信號(hào)通路在OA 中的作用尚存在一定的矛盾，還有待進(jìn)一步的研究予以證實(shí)。

3.2 抑制YAP 可減緩動(dòng)脈粥樣硬化的疾病進(jìn)展細(xì)胞衰老（主要是內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞）是導(dǎo)致心血管功能障礙和心血管疾病進(jìn)展的主要危險(xiǎn)因素［99］。內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的衰老與動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈瘤、高血壓等心血管疾病的進(jìn)展相關(guān)。以動(dòng)脈粥樣硬化為例，衰老的平滑肌細(xì)胞會(huì)釋放促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的聚集而加重粥樣斑塊的炎癥，并且釋放的基質(zhì)金屬蛋白酶會(huì)減少膠原蛋白的含量而促進(jìn)斑塊破裂。同時(shí)YAP與動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理也具有廣泛的聯(lián)系。相關(guān)研究表明，血管內(nèi)血液的單向?qū)恿鞔龠M(jìn)YAP磷酸化，減少YAP 的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制YAP 下游靶基因CTGF（connective tissue growth factor）和Cyr61（cysteine-rich angiogenic inducer 61）的表達(dá)，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生［100］（圖4B）。靶向Hippo-YAP 治療衰老相關(guān)的心血管疾病是目前研究的熱點(diǎn)。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞和血管組織中使用siRNA 敲低YAP或使用verteporfin 選擇性抑制YAP 功能可以緩解自噬阻斷，抑制內(nèi)皮細(xì)胞及體外培養(yǎng)的血管組織衰老［6］。同時(shí)在分離的粥樣硬化動(dòng)脈組織中使用YAP選擇性抑制劑verteporfin 減輕了動(dòng)脈粥樣硬化的程度［101］，并且在小鼠體內(nèi)使用他汀類藥物部分抑制YAP激活也可以減輕動(dòng)脈粥樣硬化［102］（圖4B）。YAP 除了在動(dòng)脈粥樣硬化中具有治療前景，在心肌再生方面也有一定的研究價(jià)值。成人的心肌細(xì)胞處于高度分化和增殖停滯的狀態(tài)，在一定程度上限制了受損心肌的修復(fù)。通過重新編程小鼠基因激活YAP，可使增殖停滯的心肌細(xì)胞重新進(jìn)入增殖狀態(tài)［103］。因此，YAP可能是衰老相關(guān)心血管疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

3.3 YAP 可能是治療AD 的有效靶點(diǎn) 衰老是AD的主要危險(xiǎn)因素［104］。衰老的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨著年齡的增長而積累并導(dǎo)致腦功能障礙和AD 等疾病的發(fā)生［105］。Xu 等［66］在體內(nèi)外敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞的YAP，可以通過減少CDK6 的表達(dá)水平促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老；使用MST1/2 抑制劑XMU-MP-1 激活YAP信號(hào)部分緩解了星形膠質(zhì)細(xì)胞的衰老并改善了衰老和AD 模型小鼠的認(rèn)知功能（圖4C）。同時(shí)AD 小鼠腦組織的基因表達(dá)譜分析顯示，YAP1是早期AD 相關(guān)的最活躍基因，相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示YAP1的表達(dá)水平降低可以通過影響整個(gè)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)來促進(jìn)早期AD的進(jìn)展［106］。在小膠質(zhì)細(xì)胞中，使用XMU-MP-1（YAP部分激動(dòng)劑）或過表達(dá)YAP有利于減少β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子［107］。在神經(jīng)元中，Aβ 可以使YAP 轉(zhuǎn)移出細(xì)胞核，從而降低細(xì)胞核的YAP 水平，引起Hippo 通路依賴的神經(jīng)元壞死［108］。而使用S1P和YAPdeltaC61（神經(jīng)元特有的同種型YAP）來增加神經(jīng)元細(xì)胞核YAP水平，可以減輕Hippo依賴的神經(jīng)元壞死、Aβ聚集和AD小鼠的認(rèn)知功能障礙［108］。在Aβ1-42誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡和AD 小鼠模型的研究顯示，右美托咪定可以通過miR-129靶向YAP并破壞其與Jagged1蛋白的相互作用，引起海馬神經(jīng)元凋亡減少及AD 模型小鼠認(rèn)知功能障礙［109］。

3.4 YAP 影響特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）和肝纖維化進(jìn)展 IPF的患病率隨著年齡的增長而增長，并且與肺泡上皮細(xì)胞的衰老有關(guān)［110］。氣管內(nèi)注射shRNA 的腺病毒敲減YAP1的表達(dá)，減少了肺泡上皮細(xì)胞的衰老，并且減輕了IPF小鼠的病理改變及臨床癥狀［111］（圖4C）。與IPF 相反，星狀細(xì)胞的衰老有利于逆轉(zhuǎn)肝纖維化［112］。四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TMP）通過抑制YAP 來促進(jìn)p53 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞衰老，緩解了大鼠的肝纖維化［73］（圖4C）。在非酒精性脂肪肝炎模型中，選擇性阻斷巨噬細(xì)胞中的YAP 可以減輕嚙齒動(dòng)物和大型動(dòng)物模型的肝纖維化［113］。而在小鼠缺血再灌注損傷模型中，激活YAP 可以抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成并減少肝星狀細(xì)胞的激活；抑制YAP 可以增強(qiáng)肝星狀細(xì)胞的激活，加重肝纖維化［114］。

Figure 4. Targeting Hippo-Yes-associated protein（YAP）for the treament of aging-related diseases. A：targeting Hippo-YAP for the treament of osteoarthritis（OA）；B：targeting Hippo-YAP for the treament of atherosclerosis（AS）；C：targeting Hippo-YAP for the treament of Alzheimer disease（AD），idiopathic pulmonary fibrosis（IPF）and liver fibrosis（LF）. MST：mammalian sterile20-like kinase；HMSCs：human mesenchymal stem/stromal cells；HUVECs：human umbilical vein endothelial cells；AECs：alveolar epithelial cells；HSC：hepatic stellate cell；FOXD1：forkhead box D1；ROR2：receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2；OS：oscillatory shear stress；LS：laminar shear stress；CDK：cyclin-dependent protein kinase；CTGF：connective tissue growth factor；CYR61：cysteine-rich angiogenic inducer 61；si-MST：MST siRNA；si-YAP：YAP siRNA；sh-YAP：YAP shRNA；Ad-YAP：YAP adenovirus.圖4 靶向Hippo-YAP治療衰老相關(guān)疾病（骨性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、特發(fā)性肺纖維化和肝纖維化）

4 總結(jié)與展望

上游激活因素通過經(jīng)典Hippo 信號(hào)通路或非依賴Hippo 信號(hào)通路影響YAP 的磷酸化水平來調(diào)控YAP 的活性，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和衰老等過程。在調(diào)控細(xì)胞衰老方面，Hippo-YAP 信號(hào)通路通過YAP-ATM-p53-p21、p16INK4A-CDK-RB 和YAP-自噬等多種途徑調(diào)控細(xì)胞衰老的發(fā)生，廣泛參與OA、心血管疾病、AD 等衰老相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展，是治療衰老相關(guān)疾病重要的靶點(diǎn)之一。YAP 對(duì)細(xì)胞衰老的作用因細(xì)胞類型的不同而存在差異，可能與YAP 作用于不同的信號(hào)通路、YAP 敏感性存在差異、TEAD1～4轉(zhuǎn)錄因子存在不同比例等因素有關(guān)［18］。深入研究Hippo-YAP 信號(hào)通路與衰老之間精確分子調(diào)控機(jī)制，有利于為衰老相關(guān)疾病的治療靶點(diǎn)提供參考。