RNA結(jié)合蛋白R(shí)bm38在小鼠胚胎造血發(fā)育中的功能研究*

吳知曉， 寧小偉， 趙海鑫， 周 杰， 柳 迪， 劉 兵，△， 蘭 雨△

（1暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院血液學(xué)研究所，廣東 廣州 510632；2中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院，北京 100850；3解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心，北京 100071；4北京大學(xué)生命科學(xué)中心，北京 100871）

血液是生命的源泉，在機(jī)體生命活動(dòng)中需要源源不斷地產(chǎn)生，從而維持機(jī)體的不同需求。造血干細(xì)胞是一群具有自我更新能力及多系分化潛能的細(xì)胞［1］，是補(bǔ)給這些血液細(xì)胞的關(guān)鍵來源。在哺乳動(dòng)物中，造血干細(xì)胞主要發(fā)生于胚胎主動(dòng)脈-性腺-中腎（aorta-gonad-mesonephros，AGM）區(qū)。這些造血干細(xì)胞被證明是由一群具有生血潛能的內(nèi)皮細(xì)胞［2-3］，即生血內(nèi)皮細(xì)胞，通過內(nèi)皮造血轉(zhuǎn)化（endothelial-to-hematopoietic transition，EHT）過程發(fā)育而來［3-4］。隨后，這些新生成的造血干細(xì)胞會(huì)通過血液循環(huán)進(jìn)入胎肝擴(kuò)增，并最終定植于骨髓發(fā)揮造血作用。由于參與內(nèi)皮造血轉(zhuǎn)化過程的細(xì)胞數(shù)量十分稀少，且時(shí)間窗口轉(zhuǎn)瞬即逝［5］，目前對(duì)造血干細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控機(jī)制研究仍存在較多未知性。

RNA 是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的生物大分子，除了作為遺傳物質(zhì)參與基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程外，其在不同的時(shí)間與空間范圍內(nèi)會(huì)呈現(xiàn)出多種表達(dá)與修飾狀態(tài)，從而精確地調(diào)控細(xì)胞的命運(yùn)。哺乳動(dòng)物，包括人與小鼠的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果顯示，造血干細(xì)胞發(fā)育過程中，尤其是生血內(nèi)皮細(xì)胞和造血干細(xì)胞前體階段，均能夠顯著富集RNA 代謝、加工等生物學(xué)事件［6-7］，這提示轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在造血干細(xì)胞生成過程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。進(jìn)一步地，Wang 等［8］系統(tǒng)描繪了小鼠造血干細(xì)胞發(fā)育全程的RNA 剪接圖譜，發(fā)現(xiàn)小鼠造血干細(xì)胞在發(fā)育的不同時(shí)段會(huì)表達(dá)階段特異性的轉(zhuǎn)錄本，這些可變剪接通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Runx1 及Myb 的表達(dá)，進(jìn)而推動(dòng)造血干細(xì)胞的正常發(fā)生。同樣的，也有報(bào)道RNA 的m6A 甲基化修飾狀態(tài)影響內(nèi)皮與造血基因的表達(dá)平衡，從而決定著細(xì)胞的內(nèi)皮與造血命運(yùn)［9］。除mRNA 外，非編碼RNA，如長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），在內(nèi)皮向造血轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵群體中也呈現(xiàn)出階段性的表達(dá)模式。H19 lncRNA 在造血干細(xì)胞前體階段中特異性高表達(dá)，通過抑制甲基轉(zhuǎn)移酶的活性去甲基化造血轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子區(qū)域，從而激活目的基因的表達(dá)，促進(jìn)造血干細(xì)胞前體向造血干細(xì)胞的特化［10］。

RNA 結(jié)合蛋白（RNA-binding protein，RBP）是一類通過結(jié)合RNA 參與RNA 轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（包括剪接、多聚腺苷酸化、定位、降解和翻譯）的蛋白，在RNA 介導(dǎo)的細(xì)胞命運(yùn)決定中扮演著關(guān)鍵角色，如usashi-2 通過調(diào)控靶RNA（如TGF-β）的代謝和轉(zhuǎn)錄維持造血干細(xì)胞的自我更新、穩(wěn)態(tài)及髓系偏向分化［11］。近期，Ren 等［12］的研究顯示RNA 結(jié)合蛋白還能夠通過RNA 非依賴的方式調(diào)控單核細(xì)胞的分化，QKI5 可直接結(jié)合染色質(zhì)DNA 促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄過程。這些研究結(jié)果提示，RNA 結(jié)合蛋白在造血干細(xì)胞發(fā)生的命運(yùn)選擇過程中可能也發(fā)揮了重要的作用，但是目前還缺乏足夠的證據(jù)。

Rbm38（Rnpc1）已被報(bào)道能夠調(diào)控多種腫瘤抑制因子，如p53 和p21 的mRNA 翻譯，從而參與細(xì)胞周期及細(xì)胞分化的過程，因而受到了廣泛的關(guān)注［13］。近些年發(fā)現(xiàn)，其在造血系統(tǒng)中發(fā)揮著部分作用。例如，2017年，Alvarez-Dominguez 等［14］的研究結(jié)果顯示Rbm38 是一種紅系特異的翻譯調(diào)節(jié)子，在紅系終末分化階段表達(dá)上調(diào)，可通過與翻譯啟動(dòng)子復(fù)合物的相互作用促進(jìn)紅細(xì)胞內(nèi)的蛋白翻譯。敲除Rbm38能夠引起成體小鼠血紅蛋白降低、脾大、髓外造血增加等多種血液系統(tǒng)缺陷［15］。以上結(jié)果提示Rbm38在部分造血譜系分化的過程中起到調(diào)控作用，但其功能仍有待進(jìn)一步解析，尤其是Rbm38 在造血干細(xì)胞發(fā)生時(shí)期的功能更是鮮有報(bào)道。本項(xiàng)工作將通過分析造血干細(xì)胞發(fā)育過程中各群體的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析Rbm38 在內(nèi)皮向造血干細(xì)胞前體轉(zhuǎn)化階段的表達(dá)，并結(jié)合體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)探究Rbm38 在造血干細(xì)胞發(fā)生過程中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10～11 周齡無特定病原體（specific pathogen-free，SPF）級(jí)雌雄F1 代Rbm38基因敲除小鼠（C57 背景來源）由北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司構(gòu)建【動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（京）2019-0001】，20～22 g，雌雄各3 只。SPF 級(jí)10～11 周齡雌性C57 背景的CD45.1/2 受體小鼠（共6 只），體重20～22 g，由 本 實(shí) 驗(yàn) 室 繁 育 得 來。10～11 周 齡SPF 雌 性C57/BL6小鼠若干，體重18～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司【動(dòng)物質(zhì)量合格許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010】，用于繁殖基因型為Rbm38+/-的雌雄鼠。所有小鼠均飼養(yǎng)在軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF 級(jí)小鼠飼養(yǎng)房【動(dòng)物關(guān)懷及使用許可證號(hào)（IACUC）：IACUC-DWZX-2021-056】。

1.2 主要試劑 α-MEM 培養(yǎng)液購自Gibico；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、Ⅰ型膠原酶（collagenaseⅠ，COL Ⅰ）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）均購自Sigma；青/鏈霉素（penicillin streptomycin，PS）購自HyClone；D-PBS 溶液購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；甲基纖維素半固體培養(yǎng) 基 購 自STEMCELL；2×BlueStar Master Mix 購 自MCLAB；CD45.1 APC 和CD45.2 PE流式抗體均購自eBioscience；小鼠基因型快速鑒定試劑盒購自北京陽光英銳生物科技公司；紅細(xì)胞裂解液和抗凝劑為實(shí)驗(yàn)室自配。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠胚胎AGM 區(qū)及卵黃囊（yolk sac，YS）取材 10～11周齡SPF級(jí)基因型為Rbm38+/-的雜合型雌雄鼠（C57 背景），體重20～22 g，將雌雄鼠合籠后，次日中午見到白色陰栓記為胚胎期0.5 d（embryonic day 0.5，E0.5）。頸椎脫臼（斷頸）處死E11.5 基因型為Rbm38+/-的雌鼠（共5 只），在75%乙醇中浸泡3 min，將小鼠平放在10 cm皿上充分暴露腹部皮膚，用剪刀和鑷子將腹部皮膚剪開，取出串珠樣孕囊，在解剖顯微鏡下分離成單個(gè)孕囊，從單個(gè)孕囊的兩側(cè)子宮角撕開，分離胎盤，獲得由卵黃囊包裹的胚胎，用鑷子撕開卵黃囊，截?cái)嗄氀芎吐腰S血管后分離E11.5小鼠胚胎（體節(jié)數(shù)約為46～47個(gè)）和卵黃囊（用作備用），從胚胎上肢芽下方和下肢芽上方截?cái)啾臣箓?cè)，分離原腸后得到含有AGM 區(qū)的組織，將組織平放，可以看到AGM 區(qū)與周圍組織存在明顯界限，鈍性分離后即得到實(shí)驗(yàn)所需AGM區(qū)，分別將AGM區(qū)和卵黃囊放進(jìn)已提前加入200 μL 含10% FBS α-MEM培養(yǎng)液的1.5 mL小型離心管中，編號(hào)后以作備用。

2.2 單細(xì)胞懸液制備 將含有目的組織（AGM區(qū)和卵黃囊）的離心管，310×g離心3 min，棄上清，卵黃囊組織每管加入400 μL 0.1%Ⅰ型膠原酶，AGM 區(qū)組織每管加入200 μL 0.1%Ⅰ型膠原酶，用力搖晃1 min，37 ℃金屬浴消化20～30 min，每隔5 min 搖晃一次樣品管觀察消化效果，消化結(jié)束后向得到的均一液體中加入雙倍體積含10% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)液進(jìn)行中和，310×g離心6 min，棄上清，用1 mL 含2%FBS/PBS 的溶液重懸獲得單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，以作備用。

2.3 PCR鑒定小鼠胚胎/成體小鼠基因型

2.3.1 小鼠胚胎組織基因型鑒定 在解剖顯微鏡下取出小鼠胚胎鼠尾放進(jìn)已提前加入50 μL 新鮮配制組織消化液的1.5 mL EP 管中，75 ℃金屬浴15 min，待樣本冷卻，13 523 ×g離心2 min，上清液即為小鼠胚胎組織的DNA 樣本，按照20 μL 配制PCR 反應(yīng)體系，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃3 min；94 ℃10 s、62 ℃10 s、72 ℃20 s，反應(yīng)32 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min，冷卻至4 ℃，待反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物點(diǎn)樣至提前配制并冷卻好的2%瓊脂糖凝膠中，電泳30 min 后，通過全自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀觀察條帶的大小和位置以鑒定基因型。將鑒定結(jié)果按照基因型的不同將實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組小鼠胚胎基因型為Rbm38-/-，認(rèn)為是敲除型胚胎，對(duì)照組小鼠胚胎基因型為Rbm38+/+和Rbm38+/-，分別認(rèn)為是野生型胚胎和雜合型胚胎。

2.3.2 成體小鼠鼠尾基因型鑒定 用剪刀剪取新生3 周齡成體小鼠鼠尾尖端放入1.5 mL 離心管，后續(xù)操作同小鼠胚胎組織基因型鑒定。認(rèn)為基因型為Rbm38-/-是敲除型小鼠，認(rèn)為基因型是Rbm38+/+是野生型小鼠，認(rèn)為基因型Rbm38+/-是雜合型小鼠。根據(jù)基因型鑒定結(jié)果保留基因型為Rbm38+/-的雜合型雌雄鼠。

2.4 體外造血細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 采用前期已經(jīng)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法［16-17］。每個(gè)35 mm 培養(yǎng)皿（Petri dish）中加入2 mL 甲基纖維素半固體培養(yǎng)基，分別將實(shí)驗(yàn)組（共計(jì)獲得5 個(gè)基因型為Rbm38-/-的敲除型胚胎）和對(duì)照組（共計(jì)獲得5個(gè)胚胎，其中有2個(gè)基因型為Rbm38+/-的雜合型胚胎，3 個(gè)基因型為Rbm38+/+的野生型胚胎）中消化好的AGM 區(qū)和卵黃囊的單細(xì)胞懸液分別按照1 個(gè)和1/2 個(gè)胚胎當(dāng)量（embryo equivalent，ee）接種至培養(yǎng)皿中，輕柔吹打混勻，避免產(chǎn)生過多氣泡，做好標(biāo)記，將培養(yǎng)皿放置在5% CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d 后，觀察各類集落形態(tài)，包括粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落（colony-forming unit-granulocyte and macrophage，CFU-GM）和混合系細(xì)胞集落（colony-forming unit-mix，CFU-Mix）形態(tài)，并記錄集落數(shù)量。

2.5 受體移植實(shí)驗(yàn)（AGM區(qū)直接移植）

2.5.1 受體小鼠準(zhǔn)備 采用前期已經(jīng)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法［18-19］。將10～11 周齡雌性C57 背景的CD45.1/2受體小鼠（n=6），體重20～22 g，置于照射專用鼠盒，放置于照射專用臺(tái)進(jìn)行小鼠全身60Co 照射，4.5 Gy兩次劑量照射（每次間隔2 h），照射結(jié)束后放回SPF級(jí)小鼠動(dòng)物房，在4 h內(nèi)完成受體小鼠的移植。

2.5.2 供體細(xì)胞制備 同方法2.2 制備AGM 區(qū)單細(xì)胞懸液，放于4 ℃冰箱備用?？傆?jì)獲得3個(gè)基因型為Rbm38-/-的敲除型胚胎，2 個(gè)基因型為Rbm38+/-的雜合型胚胎和1個(gè)基因型為Rbm38+/+的野生型胚胎。

2.5.3 保護(hù)細(xì)胞制備 頸椎脫臼（斷頸）處死一只CD45.1/2小鼠，取一條股骨用2%FBS/PBS 反復(fù)沖洗至股骨發(fā)白，吹打混勻并計(jì)數(shù)，置于4 ℃冰箱備用。

2.5.4 尾靜脈注射 按照每個(gè)受體鼠2×104個(gè)骨髓保護(hù)細(xì)胞與供體細(xì)胞混合均勻后經(jīng)尾靜脈注射移植入受體小鼠體內(nèi)。

2.5.5 外周血嵌合率檢測(cè) 分別在第4、8、12 和16周對(duì)各受體小鼠進(jìn)行尾靜脈采血（約20 μL），置于已加入200 μL 抗凝劑的1.5 mL 離心管中，310×g離心6 min，棄上清，按照CD45.1 APC 和CD45.2 PE 流式抗體說明書配制抗體，4 ℃避光15 min，然后加入800 μL 紅細(xì)胞裂解液裂解10～15 min（視采血量多少而定），用雙倍體積的PBS 溶液進(jìn)行中和，310×g離心6 min，棄上清，加入100 μL PBS 溶液重懸細(xì)胞，用BD FACSCalibur 檢測(cè)外周血嵌合率，以評(píng)估供體細(xì)胞是否重建了受體小鼠的造血系統(tǒng)（認(rèn)為嵌合率≥5%為重建成功）。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

流式數(shù)據(jù)由FlowJo_V10分析。其余實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由GraphPad Prism 8.3.0 處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。用秩和檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 Rbm38 分子在造血干細(xì)胞發(fā)育過程中不同階段的表達(dá)情況

造血干細(xì)胞發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，基于前期本實(shí)驗(yàn)室在單細(xì)胞水平上用CD41-CD43-CD45-CD3 1+CD201-Kit-CD44+［8］，CD41-CD43-CD45-CD31+CD20 1+Kit+CD44+［18］， CD31+CD45-CD41lowKit+CD201high、CD31+CD45+Kit+CD201high、 Lin-Sca-1+Kit+CD201+和CD45+CD201+CD48-CD150+（ESLAM）［7］這幾組細(xì)胞表面分子標(biāo)志組合分別實(shí)現(xiàn)了對(duì)造血干細(xì)胞發(fā)育過程中的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（arterial endothelial cell，AEC）、生血內(nèi)皮細(xì)胞（hemogenic endothelial cell，HEC）、Ⅰ型造血干細(xì)胞前體（type 1 pre-hematopoietic stem cell，T1 pre-HSC）、Ⅱ型造血干細(xì)胞前體（type2 prehematopoietic stem cell，T2 pre-HSC）、胚胎12 d 造血干 細(xì) 胞（embryo 12 hematopoietic stem cell，E12-HSC）、胚胎14 d 造血干細(xì)胞（embryo 14 hematopoietic stem cell，E14-HSC）以及成體造血干細(xì)胞（adult hematopoietic stem cell，Adult HSC）這7 個(gè)群體的高度富集，并對(duì)這7 個(gè)群體進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過數(shù)據(jù)分析顯示約30 種RNA 結(jié)合蛋白基因在造血干細(xì)胞發(fā)育過程中具有差異性表達(dá)，且不同的RNA 結(jié)合蛋白具有不同的表達(dá)模式，其中Rbm38分子差異表達(dá)較為明顯，見圖1A。尤其是在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞向生血內(nèi)皮細(xì)胞和Ⅰ型造血干細(xì)胞前體的轉(zhuǎn)化過程中，Rbm38的RNA水平顯著增加，并且在后續(xù)造血干細(xì)胞成熟的過程中維持高水平表達(dá)，見圖1B。

2 Rbm38基因敲除小鼠模型的構(gòu)建

基于上述單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了Rbm38基因敲除小鼠模型。通過在NM_019547 轉(zhuǎn)錄本的1 號(hào)外顯子上游和3 號(hào)外顯子下游的非保守區(qū)域設(shè)計(jì)了兩條小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA），從而在Rbm38基因中產(chǎn)生4 kb 的染色體缺失，這種染色體片段的缺失會(huì)導(dǎo)致Rbm38基因無法正常轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而造成該基因的敲除，見圖2。Rbm38雜合型敲除小鼠發(fā)育正常，且能夠正常繁育。本實(shí)驗(yàn)室將獲得的雜合型敲除小鼠相互自交，從而獲得E11.5Rbm38敲除小鼠胚胎。利用PCR 方法鑒定胚胎基因型用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 Rbm38 對(duì)AGM 區(qū)和卵黃囊生成造血祖細(xì)胞的能力的影響

取材實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組E11.5 小鼠胚胎顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組胚胎均發(fā)育正常，體節(jié)大小相近（46～47 個(gè)體節(jié)），見圖3A。CFU-C 實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均產(chǎn)生較多數(shù)量的粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落和以紅系為主的混合系細(xì)胞集落，形態(tài)上均無顯著差異，見圖3B。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組集落形成數(shù)量進(jìn)行秩和檢驗(yàn)差異性分析，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，AGM區(qū)和卵黃囊在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中形成的集落數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖3C、表1。

表1 AGM區(qū)和YS體外集落形成數(shù)量Table 1. Numbers of colony-forming units of aorta-gonad-mesonephrosn（AGM）region and YS（n=5）

Figure 1. Expression of Rbm38 molecule at different stages during hematopoietic stem cell development. A：heat map of RNA-binding protein gene expression in different cell types during hematopoietic stem cell development，colors represent the intensity of gene expression；B：violin plot showing the expression of RNA-binding protein Rbm38 in 7 cell clusters related to generation and maturation of hematopoietic stem cell. The result suggests the Rbm38 was significantly up-regulated during the transition from arterial endothelial cell to hemogenic endothelial cell and maintained at a relatively high level during subsequent hematopoietic stem cell maturation.圖1 Rbm38分子在造血干細(xì)胞發(fā)育過程中不同階段的表達(dá)情況

4 Rbm38對(duì)AGM區(qū)產(chǎn)生造血干細(xì)胞的作用

為進(jìn)一步探究敲除Rbm38是否會(huì)影響AGM 區(qū)產(chǎn)生功能性的造血干細(xì)胞（具有移植重建能力）。流式分析結(jié)果顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組AGM 區(qū)來源的細(xì)胞均能夠在受體小鼠體內(nèi)重建造血系統(tǒng)（嵌合率≥5%），見圖4A；對(duì)外周血嵌合率進(jìn)行t檢驗(yàn)差異性分析，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組外周血嵌合率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖4B。

討論

本項(xiàng)工作通過分析小鼠造血干細(xì)胞起源相關(guān)細(xì)胞群體的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示RNA 結(jié)合蛋白分子Rbm38在動(dòng)脈內(nèi)皮向生血內(nèi)皮轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)水平明顯升高，且在后續(xù)造血干細(xì)胞成熟過程中維持較高水平表達(dá)，提示其在內(nèi)皮-造血轉(zhuǎn)化的起始階段具有潛在的調(diào)控功能以及在造血干細(xì)胞的分化和成熟過程中可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。而以往關(guān)于Rbm38的研究主要報(bào)道它通過穩(wěn)定細(xì)胞周期蛋白p21 等從而在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的調(diào)控作用［20-21］。已知在小鼠胚胎期內(nèi)皮向造血轉(zhuǎn)化階段細(xì)胞周期活躍［18］，再結(jié)合Zhang 等［15］報(bào)道了Rbm38 對(duì)小鼠成體穩(wěn)態(tài)造血至關(guān)重要，于是我們構(gòu)建了Rbm38基因全敲除小鼠，結(jié)合體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步探討Rbm38對(duì)胚胎期造血干細(xì)胞生成過程的影響。

在造血祖細(xì)胞生成相對(duì)豐富的E11.5 發(fā)育階段，我們沒有觀察到明顯的胚胎發(fā)育異常。同時(shí)，體外造血細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)提示，敲除Rbm38并不影響AGM 區(qū)和卵黃囊造血祖細(xì)胞的生成數(shù)量和分化功能。進(jìn)一步的體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)表明敲除Rbm38不影響AGM 區(qū)產(chǎn)生功能性的造血干細(xì)胞。這些結(jié)果說明Rbm38對(duì)胚胎期造血干細(xì)胞的生成沒有明顯的影響，本項(xiàng)工作初步探索了Rbm38 在胚胎期造血干細(xì)胞生成過程中的作用，為未來研究RNA 結(jié)合蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對(duì)于造血干細(xì)胞生成的影響提供了分子基礎(chǔ)。

Figure 2. The targeting strategy of Rbm38 gene knockout mice. Two sgRNAs were designed to generate a 4 kb chromosomal deletion at the Rbm38 locus in the mouse genome. Note：this design is based on transcript NM_019547 of gene Rbm38.圖2 Rbm38基因敲除小鼠模型的構(gòu)建

Figure 3. The effect of Rbm38 in generating hematopoietic progenitor cell of aorta-gonad-mesonephrosn（AGM）region and yolk sac（YS）. A：representative images of E11.5 Rbm38+/+and Rbm38-/-embryos；B：representative images of colony-forming units（CFU）of E11.5 AGM region and YS，the genotypes of the embryos were listed on the left；C：numbers of CFU of E11.5 AGM region and YS with the indicated genotype determined by methylcellulose CFU-culture assay. Mean±SD. n=5.圖3 Rbm38對(duì)AGM區(qū)和卵黃囊生成造血祖細(xì)胞能力的影響

通過對(duì)胚胎和成體階段造血干細(xì)胞的比較性分析，目前已有研究報(bào)道了一系列階段特異性的造血調(diào)控關(guān)鍵分子，例如Bmi-1［22］和Lin28b［23］等，這些調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)了胚胎期和成體期造血干細(xì)胞的細(xì)胞特性轉(zhuǎn)變。因此，我們猜測(cè)，Rbm38在胚胎期和成體期可能對(duì)造血系統(tǒng)存在功能上的差異。另一方面，我們的單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)分析結(jié)果與2021年許亞菲等［24］的研究結(jié)果類似，多種RNA 結(jié)合蛋白分子在生血內(nèi)皮細(xì)胞及Ⅰ型造血干細(xì)胞前體階段特異性高表達(dá)，考慮到此時(shí)RNA 的代謝以及加工事件十分活躍［18］，我們推測(cè)，多種RNA 結(jié)合蛋白分子很可能在內(nèi)皮造血轉(zhuǎn)化過程中協(xié)同促進(jìn)了RNA 有關(guān)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程。一方面其他關(guān)鍵的RNA 結(jié)合蛋白在Rbm38敲除后可能代償了其RNA加工方面的部分作用；另一方面，RNA 結(jié)合蛋白發(fā)揮作用的時(shí)期可能貫穿造血干細(xì)胞發(fā)生、成熟以及發(fā)揮造血功能等多個(gè)時(shí)期，Rbm38 是否參與造血干細(xì)胞在胎肝中的擴(kuò)增以及后續(xù)的譜系分化值得我們進(jìn)一步關(guān)注。有趣的是，RNA 結(jié)合蛋白分子ZFP36 家族成員Zfp36l2，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)表明該分子的編碼基因Zfp36l2顯著表達(dá)于E12～E14胎肝中，敲除ZFP36I2的E14.5胎肝中造血祖細(xì)胞的數(shù)量明顯減少［25］，提示RNA 結(jié)合蛋白分子的確可能影響了胎肝中造血干細(xì)胞的生成。

Figure 4. Identifying the specific role of Rbm38 in generating functional hematopoietic stem cell in aorta-gonad-mesonephrosn（AGM）region by in vivo transplantation assay. A：representative FACS plots display the donor chimerism of peripheral blood at 4 to 16 weeks post-transplantation in the indicated genotype；B：statistic analysis showing the donor chimerism at 4 to 16 weeks in the indicated genotype. Mean±SD. n=3.圖4 Rbm38對(duì)AGM區(qū)產(chǎn)生造血干細(xì)胞的作用

傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為RNA 結(jié)合蛋白只能通過結(jié)合RNA 來間接調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，然而近期越來越多的證據(jù)表明RNA 結(jié)合蛋白還可直接與染色質(zhì)相互作用，影響靶基因的表達(dá)，可見RNA 結(jié)合蛋白分子的調(diào)控模式是十分復(fù)雜的。在后續(xù)的研究中，除了對(duì)已有單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的挖掘外，系統(tǒng)描繪造血發(fā)生過程中與染色質(zhì)相互作用的RNA 結(jié)合蛋白分布圖譜，可能更有助于我們深入地理解RNA 結(jié)合蛋白調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制，從而鑒定出內(nèi)皮造血轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的RNA 結(jié)合蛋白分子，為解析造血干細(xì)胞起源和成熟過程中的分子調(diào)控規(guī)律和優(yōu)化造血干細(xì)胞體外再生策略提供參考。