利多卡因預(yù)處理減輕阿霉素引起的小鼠急性心肌損傷的效果及機(jī)制研究

劉海波，劉岳鵬，朱 霞，劉文濤，程 月，何學(xué)明*

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬連云港東方醫(yī)院老年科，江蘇 連云港 222042;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬連云港東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，江蘇 連云港 222042；3.南京醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211100；4.南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院，江蘇 連云港 222000)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種臨床上常用的化療藥物，對(duì)于多種癌癥(如肺癌、乳腺癌等)有比較好的療效，但其心臟毒性嚴(yán)重限制了其在臨床上的應(yīng)用。DOX心損傷的機(jī)制不明，目前最流行的假說是氧化應(yīng)激假說[1]。然而，已經(jīng)有研究者提出，氧化應(yīng)激可能不是DOX引起的心臟損傷的核心，因?yàn)殍F螯合劑，如右丙亞胺，應(yīng)該可以減少氧化應(yīng)激，但有研究表明其治療效果仍存在爭(zhēng)議[2]。此外DOX可引起心臟傳導(dǎo)異常，導(dǎo)致心律失常。目前機(jī)制尚不明確。心律失常的兩個(gè)分支，包括心臟起搏和傳導(dǎo)的異常，這可能在阿霉素誘導(dǎo)的心臟病中同時(shí)存在。在DOX心肌損傷小鼠模型中，引起的急性心臟毒性表現(xiàn)為異常傳導(dǎo)，包括心動(dòng)過緩、QT間期延長(zhǎng)[3]。磷酸化縫隙連接蛋白43(phosphorylated connexin 43，p-Cx43)是完整的膜蛋白，在心肌細(xì)胞間形成間隙連接，介導(dǎo)相鄰細(xì)胞之間的信息和物質(zhì)交換，心臟動(dòng)作電位的傳播和規(guī)則搏動(dòng)節(jié)律的維持是由縫隙連接參與介導(dǎo)的[4]。目前已有研究表明在阿霉素心臟毒性模型中p-Cx43明顯升高，這將導(dǎo)致其構(gòu)象改變，并隨之產(chǎn)生電和化學(xué)解偶聯(lián)，使細(xì)胞間的縫隙連接通訊中斷，并最終引起心率及心功能異常[5]。此外炎癥反應(yīng)也參與在阿霉素心肌損傷，近期文獻(xiàn)報(bào)道在阿霉素心肌損傷模型中白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎癥因子明顯升高[6]。因此，調(diào)節(jié)Cx43磷酸化水平以及減輕炎癥反應(yīng)可能是改善DOX引起的傳導(dǎo)異常及心臟損傷的潛在策略。利多卡因(lidocaine，LIDO)是一種臨床上常用的局部麻醉藥，對(duì)心臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[7]，本研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LIDO具有保護(hù)DOX引起的心臟損傷的作用。本實(shí)驗(yàn)首先觀察LIDO預(yù)處理對(duì)DOX引起的心臟毒性的影響，進(jìn)而通過觀察心肌組織中磷酸化磷酸腺苷活化蛋白激酶(phosphorylated adenosine phosphate activated protein kinase，p-AMPK)以及p-Cx43在DOX導(dǎo)致的小鼠心肌損傷模型中的變化及LIDO對(duì)其影響，來探究LIDO保護(hù)心肌損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 體重 20～23 g，6 周齡，雄性，SPF 級(jí) ICR 小鼠，購(gòu)買自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠可以自由獲取食物和水，環(huán)境溫度21～25 ℃，相對(duì)適度50%～60%，每籠 5～6只，下有柔軟的墊層。實(shí)驗(yàn)中小鼠飼養(yǎng)及取材均符合相關(guān)規(guī)定。30 只小鼠隨機(jī)分為3組(n=10)，分別為對(duì)照組、DOX 組、DOX+LIDO 組。

1.2主要試劑和儀器 鹽酸多柔比星(即DOX)購(gòu)自深圳萬(wàn)樂藥業(yè)有限公司(生產(chǎn)批號(hào)1912E1)，LIDO購(gòu)自湖北天藥藥業(yè)股份有限公司(生產(chǎn)批號(hào)D32001021)，p-AMPK 抗體購(gòu)自Abcam公司，p-Cx43抗體購(gòu)自CST公司，酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Western 一抗稀釋液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào) P0023A)Western 二抗稀釋液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)P0023D)小鼠cTn-T檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司公司(貨號(hào)H149-4)，小動(dòng)物心電圖機(jī)購(gòu)自成都泰盟軟件有限公司(型號(hào) BL-420S)。

1.3模型建立 30只小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為對(duì)照組(單次腹腔注射生理鹽水1 mL/100 g)、DOX組(單次腹腔注射 DOX 10 mg/kg建立模型)、DOX+LIDO組(尾靜脈注射 LIDO 6 mg/kg，間隔30 min后腹腔注射DOX 10 mg/kg，然后每24 h尾靜脈注射一次LIDO，連續(xù)7 d)LIDO給藥劑量參照文獻(xiàn)[8]。每天觀測(cè)小鼠體重及病死率并記錄。

1.4心電圖檢測(cè) 分別于小鼠注射DOX前2 h和注射后7 d用氣麻機(jī)麻醉小鼠(麻藥是七氟烷)后進(jìn)行心電圖心率分析。將電極置于右后肢、右前肢和左后肢的皮膚下，使用小動(dòng)物心電圖機(jī)器記錄結(jié)果，待小鼠心率穩(wěn)定后開始記錄，每次記錄的持續(xù)時(shí)間至少為2 min。

1.5心肌細(xì)胞損傷評(píng)估 7 d提取小鼠中血液樣本，制備成血漿并儲(chǔ)存在 80 ℃下以供進(jìn)一步分析。按照使用說明書分別準(zhǔn)備試劑、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品及生物素抗原，37 ℃孵育30 min，洗滌5次；再加入親和素繼續(xù)孵育30 min，最后洗滌加入顯色液及中止液并于10 min之內(nèi)讀取OD值。制作標(biāo)曲計(jì)算出cTn-T值。

1.6ELISA試劑盒 檢測(cè)血漿IL-1β、IL-6、TNF-α分泌量7 d提取小鼠血液樣本并制備成血漿待用。按照ELISA試劑盒說明書完成檢測(cè)步驟。最終通過標(biāo)曲計(jì)算出血漿IL-1β、IL-6、TNF-α分泌量。

1.7Western blot 法 測(cè)定心肌組織中蛋白的表達(dá)7 d提取樣品(心臟組織)在放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitationassay，RIPA)裂解緩沖液中進(jìn)行裂解。蛋白質(zhì)濃度由 BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)定。裝載蛋白質(zhì)并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離后在電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上。膜在室溫下用 5%牛血清白蛋白封閉 2 h，在 4 ℃下用一級(jí)抗體孵育過夜，洗滌3次每次10 min，使用的主要抗體包括p-AMPK(1∶1 000)、p-Cx43(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)；然后用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二級(jí)抗體孵育。洗膜3次，加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色，并進(jìn)行圖像采集。用ImageJ軟件對(duì)進(jìn)行灰度分析并統(tǒng)計(jì)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS25.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用單因素方差分析、Tukey法和重復(fù)測(cè)量方差分析；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠體重及存活率比較 三組小鼠7 d內(nèi)體重的差異。DOX組和DOX+LIDO組較對(duì)照組體重均呈逐漸降低趨勢(shì)，但是DOX組降低的更多，組間、時(shí)點(diǎn)間、組間·時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，接受不同的處理措施的小鼠在體重上存在差異。采用Tukey校正的兩兩比較中，DOX組小鼠體重比對(duì)照組小鼠體重低4.50 g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.066,P<0.01)；DOX+LIDO組小鼠體重比DOX組小鼠體重高1.50 g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.689,P=0.050)，見表1。造模后7 d，DOX 組死亡5只小鼠，DOX+LIDO 組死亡1只，對(duì)照組無(wú)死亡。LIDO 預(yù)處理后小鼠體重及存活率顯著改善(P<0.01)，見表 2。

表1 造模后7 d時(shí)各組小鼠體重

表2 造模后7 d各組小鼠存活情況

2.2造模后7 d各組小鼠心率比較 心電圖顯示 DOX 降低了小鼠的心功能，表現(xiàn)為心率明顯減慢，與對(duì)照組相比DOX組心率降低(P<0.01)；而用 LIDO 預(yù)處理有效地防止了 DOX 誘導(dǎo)的心率減慢，與DOX組相比心率增加(P<0.01)，見圖1，表 3。

圖1 各組小鼠典型心電圖比較

表3 造模后7 d小鼠心率比較

2.3各組小鼠cTn-T變化血漿 cTn-T結(jié)果顯示 DOX 明顯損害小鼠心肌細(xì)胞，與對(duì)照組相比DOX組cTn-T明顯增高(P<0.01)；而用 LIDO 預(yù)處理有效地防止了 DOX 誘導(dǎo)的心肌損害，與DOX組相比血漿cTn-T降低(P<0.01)，見表4。

表4 各組小鼠cTn-T變化

2.4各組小鼠血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α變化血漿 IL-1β、IL-6、TNF-α結(jié)果顯示 DOX 明顯增加小鼠血漿中炎癥因子分泌，與對(duì)照組相比DOX組IL-1β、IL-6、TNF-α明顯增高(P<0.01)；而用 LIDO 預(yù)處理有效地防止了 DOX 誘導(dǎo)的炎癥因子升高，與DOX組相比血漿IL-1β、IL-6、TNF-α降低(P<0.05)，見表5。

表5 各組小鼠血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α變化

2.5心肌組織中p-AMPK和p-Cx43表達(dá)水平比較 DOX組p-AMPK表達(dá)量明顯較其他組明顯降低(P<0.01)而LIDO預(yù)處理后明顯升高(P<0.05)而p-Cx43表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，LIDO預(yù)處理后明顯降低(P<0.05)，見圖2，表6。

圖2 各組心肌組織中p-AMPK、p-Cx43表達(dá)水平

表6 各組小鼠心肌組織中p-AMPK、p-Cx43表達(dá)水平比較

3 討 論

在目前癌癥的臨床治療中，盡管各組靶向藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用，但化療仍占有重要地位。蒽環(huán)類化療藥物是一類重要的化療藥物，DOX是其中的代表藥物。是治療各種成人和兒童癌癥(乳腺癌、霍奇金病、淋巴母細(xì)胞白血病)的最有效藥物之一。然而，其嚴(yán)重的心臟毒性(如心律失常、充血性心力衰竭)嚴(yán)重限制其使用[9]。目前臨床上對(duì)于DOX心臟毒性仍沒有較好的藥物預(yù)防或者治療[10]，因此臨床上亟需一種藥物來預(yù)防或者治療DOX的心臟毒性。本研究首次報(bào)道了LIDO預(yù)處理可以預(yù)防DOX心臟毒性，為臨床化療過程中預(yù)防DOX心臟毒性提供了參考。

LIDO預(yù)處理可以預(yù)防DOX引起的心臟毒性。LIDO是一種臨床上常用的麻醉劑，有研究表明在心肌缺血和再灌注的動(dòng)物模型中，利多卡因可以減少心肌梗死面積和肌鈣蛋白的釋放[11]。另一項(xiàng)研究報(bào)道利多卡因在缺血再灌注損傷模型中可以減少心肌細(xì)胞凋亡從而改善心肌功能[7]。此外，在本研究顯示LIDO預(yù)處理顯著提高了小鼠的存活率和體重，降低了血漿cTn-T、IL-1β、IL-6、TNF-α的水平以及緩解小鼠緩慢性心律失常，表明LIDO能夠減輕DOX引起的心臟毒性。

LIDO預(yù)處理減輕DOX引起的心臟毒性的機(jī)制還不清楚。有報(bào)道提示DOX小鼠損傷模型中AMPK的活性被抑制[12]，而二甲雙胍激活A(yù)MPK已被證實(shí)對(duì) DOX 心臟毒損傷具有保護(hù)作用[13]。最近研究證實(shí) LIDO 可以激活A(yù)MPK對(duì)炎癥起到保護(hù)作用[14]。此外還有研究表明LIDO可以降低TNF-α等炎癥因子水平達(dá)到改善炎癥目的[8]?；谶@些結(jié)果，認(rèn)為L(zhǎng)IDO減輕DOX心臟損傷的機(jī)制可能是LIDO預(yù)處理抑制了DOX對(duì)AMPK活性的抑制。作為證據(jù)支持，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LIDO+DOX組的AMPK的活性高于DOX組。另外，Cx43是縫隙連接通道主要成分，縫隙連接是心臟細(xì)胞間直接電和分子信號(hào)傳輸?shù)幕A(chǔ)，可確保同步心肌收縮[4]?？p隙連接的作用依賴于Cx43的磷酸化狀態(tài)，連接蛋白磷酸化是蛋白激酶和磷酸酶之間的相互作用，但確切的途徑尚不清楚[15]。刺激Cx43磷酸化可降低心肌細(xì)胞縫隙連接通透性，Cx43磷酸化改變也可能導(dǎo)致心力衰竭、傳導(dǎo)速度減慢和心律失常的縫隙連接功能障礙[3]。研究表明DOX化療可導(dǎo)致p-Cx43的上調(diào)，被認(rèn)為是DOX引起心臟毒性的關(guān)鍵因素之一[16]。而DOX心肌損傷過程與高度保守的細(xì)胞內(nèi)AMPK蛋白有關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到，DOX可以引起p-Cx43表達(dá)的上調(diào)，而LIDO預(yù)處理可以減少p-Cx43表達(dá)的上調(diào)，提示抑制p-Cx43表達(dá)可能是LIDO預(yù)處理減輕DOX心臟毒性機(jī)制中重要的環(huán)節(jié)之一。此外DOX化療導(dǎo)致IL-1β、IL-6、TNF-α增加，已有研究表明炎癥因子參與心肌細(xì)胞的凋亡等反應(yīng)，降低炎癥因子水平有助于改善心肌功能[17]。而LIDO預(yù)處理有效降低了血漿IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌量，提示降低炎癥因子水平可能是LIDO改善心肌損傷的另一個(gè)重要環(huán)節(jié)。在人體內(nèi)，靜脈注射利多卡因的常見不良反應(yīng)包括低血壓和血管擴(kuò)張，這兩種情況在腫瘤患者中都值得關(guān)注，雖然有證據(jù)表明低劑量利多卡因已被證明對(duì)無(wú)嚴(yán)重心臟病的患者是安全的[18]，但臨床上對(duì)于LIDO預(yù)處理方面的研究較少，仍需要近一步探究。

預(yù)處理可以改善DOX誘導(dǎo)的緩慢性心律失常等心臟毒性，其機(jī)制可能是LIDO預(yù)處理減輕了DOX對(duì)AMPK活性的抑制，進(jìn)而減輕了DOX引起的 p-Cx43上調(diào)及降低IL-1β、IL-6、TNF-α來減輕DOX誘導(dǎo)的心臟毒性，所以，在應(yīng)用DOX治療腫瘤之前進(jìn)行LIDO預(yù)處理可能是一種有效緩解DOX心臟毒性的方法，但這種新的治療策略在臨床上的潛在價(jià)值有待進(jìn)一步分析。