5種瑞香科植提取物對7種植物病原真菌的抑菌活性測定

陳云坤，胡春艷，張知宇，趙艷芳，曹 揮

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西晉中 030801）

0 引言

植物生長過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物常含可抑菌、殺蟲等活性成分[1]，而植物源農(nóng)藥正是利用植物某些部位的提取物所制成的農(nóng)藥，其原藥大多為天然活性成分[2-4]。在當(dāng)前可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略背景下，推進(jìn)化學(xué)農(nóng)藥減量化以及推廣植物源農(nóng)藥的使用[5]，是貫徹由高毒到綠色、從高風(fēng)險(xiǎn)到生態(tài)安全的綠色發(fā)展理念的重要組成部分。

瑞香科是被子植物門雙子葉植物綱薔薇亞綱桃金娘目的一科，在熱帶和亞熱帶均有廣泛分布[6]，在國內(nèi)共有10屬，分別為瑞香屬(Daphne)、蕘花屬(Wikstroemia)、沉香屬(Aquilaria)、結(jié)香屬(Edgeworthia)、鼠皮樹屬(Rhamnoneuron)、毛管花屬(Eriosolena)、狼毒屬 (Stellera)、假 狼 毒 屬 (Stelleropsis)、歐 瑞 香 屬(Thymelaea)和草瑞香屬(Diarthron)，主要分布于長江流域以南，大多數(shù)種類的韌皮纖維較發(fā)達(dá)，瑞香科的10屬中瑞香屬與蕘花屬種類最多，在中國分別分布有52種和49種[7-8]。同科植物中主要成分類似主要是由于水分、光照、溫度等生長環(huán)境會對植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理代謝造成影響[9]，在瑞香科植物中瑞香屬、狼毒屬、蕘花屬和結(jié)香屬研究較多，4屬植物中主要成分為香豆素、黃酮、萜類等化合物，且多數(shù)化合物具有顯著的生理活性[10]。

瑞香狼毒為瑞香科狼毒屬植物，在國內(nèi)已廣泛用于農(nóng)業(yè)病蟲害的防治，試驗(yàn)室前期研究表明，瑞香狼毒提取物對西瓜枯萎病原真菌以及山楂葉螨等病蟲害均有良好的生物活性，其主要成分狼毒素A對TMV的增殖擴(kuò)散也有明顯的抑制作用。筆者在瑞香科研究較多的4屬植物中，選取瑞香狼毒（狼毒屬）、南嶺蕘花（蕘花屬）、祖師麻（瑞香屬植物黃瑞香的根皮及莖皮）、芫花（瑞香屬）以及夢花（結(jié)香屬植物結(jié)香的花）5種植物作為代表，研究其乙醇提取物抑制病原真菌的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

1.1.1 儀器與試劑 氣引式粉碎機(jī)（佑崎有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀IKA（上海亞榮生化儀器廠）、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海皓莊儀器有限公司）、電子天平（龍騰電子有限公司）、高壓滅菌鍋（西安儀創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司）、葡萄糖（天津市北辰方正試劑廠）、瓊脂粉（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.2 供試菌株及植株 茄子枯萎(Fusarium oxysporumf.sp.)、黃瓜枯萎(Fusarium oxysporumsp.)、黃瓜炭疽(Colletotrichum orbiculare)、黃 瓜 靶 斑 (Corynesporacassiicola)、草莓紅中柱(Phytophthora fragariae)、番茄枯萎(Fusarium oxysporumf.sp.)、辣椒枯萎(Fusarium oxysporumf.sp.)所有菌種均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理試驗(yàn)室分離鑒定并提供，供試植株名稱及部位見表1。

表1 供試植株名稱及部位

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物提取物的制備方法 將各種植物材料磨碎成粉末狀，各稱量800 g，將其以每瓶200 g分裝在廣口瓶中與乙醇1:2混合放置72 h初步浸提，后在30℃的條件下進(jìn)行30 min的超聲波浸提，將混合物放入真空抽濾裝置進(jìn)行分離，收集到的液體即為植物的初提物，將粉末狀物質(zhì)進(jìn)行回收分裝后再次與乙醇混合，重復(fù)以上步驟4次，混合提取液進(jìn)行濃縮，并測定濃縮后提取液的提取率及濃度（表2）。

表2 供試植物提取物提取率以及提取物濃度

1.2.2 5種植物提取物的抑菌活性測定 在超凈工作臺中利用渦旋震蕩儀將各個(gè)提取物制作成8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg/mL的含藥PDA平板，以加入等體積乙醇的平板作為空白對照，每種處理重復(fù)5次。將已活化的病原真菌的菌落邊緣打孔(0.7 cm)，挑取至平板后，放入27℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。利用十字交叉法測量不同培養(yǎng)時(shí)間的菌落直徑，當(dāng)空白對照的菌落長到平板直徑的3/4處時(shí)進(jìn)行最后一次測量，并將各處理的菌落狀態(tài)拍照備用，利用DPS軟件完成毒力分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種瑞香科植物提取物對7種病原真菌的抑制效果

5種瑞香科植物8 mg/mL提取物對7種病原真菌的抑制效果見表3。瑞香狼毒和夢花2種提取物生物活性較強(qiáng)，對所有病原菌的抑制效果在8 mg/mL下達(dá)到100%。所有瑞香科植物提取物在8 mg/mL時(shí)對番茄枯萎和黃瓜炭疽的抑制率都達(dá)到了100%，南嶺蕘花提取物對其余5種病原真菌的抑制率沒有達(dá)到100%，但大部分接近90%。綜合來看，瑞香科提取物對黃瓜靶斑的抑制率低，均為所有病原真菌中最差，但都不低于65%。

表3 5種瑞香科8 mg/mL提取物對7種病原菌絲生長的抑菌效果

如圖1，茄子枯萎菌在96 h時(shí)CK長到約平板的3/4處，此時(shí)夢花與瑞香狼毒提取物在8 mg/mL對菌落的抑制率為100%，祖師麻、芫花提取物在高濃度下抑制率較差，均小于90%。隨著濃度的降低各提取物對菌落的抑制效果也每況愈下，但在中濃度2 mg/mL時(shí)夢花提取物的表現(xiàn)最佳，其抑制率仍在80%以上。低濃度0.5 mg/mL時(shí)芫花和瑞香狼毒的表現(xiàn)較好，抑制率均高于20%。

圖1 不同濃度瑞香科植物提取物對茄子枯萎的菌落抑制效果

如圖2，茄子枯萎菌在120 h時(shí)CK長到約平板的3/4處，此時(shí)在高濃度8、4 mg/mL下，夢花與瑞香狼毒提取物的表現(xiàn)最好，抑制率均達(dá)到了100%，在中濃度2 mg/mL時(shí)2種提取物也保持著較好的抑制效果，但夢花提取物的抑菌表現(xiàn)略好于瑞香狼毒提取物。低濃度時(shí)夢花提取物的表現(xiàn)逐漸變差，但瑞香狼毒的抑制率在所有提取物中表現(xiàn)最佳，在0.5 mg/mL時(shí)抑制率仍接近30%。

圖2 不同濃度瑞香科植物提取物對黃瓜枯萎的菌落抑制效果

黃瓜炭疽病原菌在96 h時(shí)CK長到約平板的3/4處，此時(shí)在高濃度8 mg/mL時(shí)，所有提取物的抑菌效果均為100%，由圖3可知，隨著提取物濃度的降低，瑞香狼毒提取物的抑制率保持著較高的水平。其余4種提取物的表現(xiàn)較為均衡，都有著不錯(cuò)的抑菌效果，尤其是夢花提取物在4 mg/mL時(shí)的抑菌率仍為100%。

圖3 不同濃度瑞香科植物提取物對黃瓜炭疽的菌落抑制效果

如圖4，黃瓜靶斑病原菌在120 h時(shí)CK長到約平板的3/4處，在高濃度8 mg/mL下瑞香狼毒與夢花提取物的抑制率均為100%，但隨著濃度的降低，夢花提取物的抑制效果大幅減弱。芫花與祖師麻提取物在高濃度時(shí)表現(xiàn)不太理想，但是濃度的降低并未對其抑菌率產(chǎn)生大幅影響，在最低濃度時(shí)2種提取物的抑菌率仍大于30%。所有提取物中，南嶺蕘花的表現(xiàn)較差，在低濃度時(shí)基本沒有抑菌效果。

圖4 不同濃度瑞香科植物提取物對黃瓜靶斑的菌落抑制效果

草莓紅中柱病原菌在120 h時(shí)CK長到約平板的3/4處，由圖5可明顯看出南嶺蕘花提取物的抑菌效果不佳，在高濃度4 mg/mL下的抑制率僅為30%。最低濃度時(shí)瑞香狼毒和祖師麻提取物的抑菌率較高，均高于20%，夢花提取物雖然在低濃度時(shí)表現(xiàn)不理想但在高濃度時(shí)的抑菌效果較好，僅次于瑞香狼毒提取物。

圖5 不同濃度瑞香科植物提取物對草莓紅中柱的菌落抑制效果

由圖6可知，辣椒枯萎病菌在120 h時(shí)CK長到約平板的3/4處，除南嶺蕘花外其余提取物在8 mg/mL時(shí)的抑制率均為100%，中濃度1 mg/mL時(shí)，夢花、祖師麻提取物的抑菌效果迅速變差，但瑞香狼毒提取物的抑菌率仍在較高水平，當(dāng)濃度降低至0.5 mg/mL時(shí)，僅瑞香狼毒提取物的抑菌率達(dá)到30%以上。

圖6 不同濃度瑞香科植物提取物對辣椒枯萎的菌落抑制效果

由圖7可知，番茄枯萎在96 h時(shí)CK長到約平板的3/4處，在高濃度時(shí)夢花與瑞香狼毒提取物的表現(xiàn)最佳，隨著濃度的降低瑞香狼毒提取物仍有著較好的表現(xiàn)，而夢花提取物的抑制效果出現(xiàn)斷崖式下跌，芫花提取物在低濃度0.5、0.25 mg/mL時(shí)的抑制效果僅次于瑞香狼毒。

圖7 不同濃度瑞香科植物提取物對番茄枯萎的菌落抑制效果

2.2 5種瑞香科植物提取物對7種病原真菌的毒力測定

由表4～8綜合來看，在對茄子枯萎菌、黃瓜炭疽和番茄枯萎的毒力測定中，瑞香狼毒與夢花在所有提取物中效果最好，EC50值均小于0.81 mg/mL，祖師麻提取物對黃瓜靶斑與草莓紅中柱的抑制率在所有提取物中最強(qiáng)，EC50值為0.92 mg/mL左右，夢花對草莓紅中柱的抑制活性次之，其EC50值為0.983 mg/mL。芫花提取物對黃瓜靶斑的抑制作用僅次于祖師麻，但對茄子枯萎與黃瓜枯萎的抑制效果在所有提取物中最弱，EC50值分別為1.141、2.259 mg/mL。對于黃瓜枯萎和辣椒枯萎來說，抑制作用最強(qiáng)的分別是夢花與瑞香狼毒的提取物，EC50值為0.754、0.736 mg/mL。南嶺蕘花相對于其他提取物來說表現(xiàn)不佳，對黃瓜靶斑、草莓紅中柱、番茄枯萎、辣椒枯萎4種菌的抑制活性均為所有提取物中最弱，EC50值分別為2.182、2.710、1.065、1.950 mg/mL。

表4 瑞香狼毒提取物對7種病原真菌的毒力測定

表5 南嶺蕘花提取物對7種病原真菌的毒力測定

表6 祖師麻提取物對7種病原真菌的毒力測定

3 結(jié)論與討論

中國有著十分悠久的中藥文化，在人們對綠色食品日益增長的需求中以及國家政策等力量的推動(dòng)下，利用植物中活性成分制成的植物源農(nóng)藥，已成為當(dāng)今熱門的研究[11]。

本試驗(yàn)所選取的瑞香科植物為落葉或常綠灌木或小喬木，其中許多植物均有藥用價(jià)值。在中藥中，瑞香狼毒、狼毒大戟或月腺大戟的干燥根均可作為狼毒入藥，具有止痛、抗病毒、抗癲癇等多種功效[12]，對大腸桿菌、同心性毛癬菌等人源細(xì)菌、真菌也有良好的抑制效果[13]。且瑞香狼毒提取物對番茄晚疫病菌、玉米大斑病菌、辣椒疫霉菌[14]、小麥赤霉病菌和黃瓜枯萎菌[15]等多種植物病原真菌有良好的生物活性，研究表明黃酮和香豆素類化合物為其主要的抑菌活性物質(zhì)[16]。本試驗(yàn)中，瑞香狼毒在5種瑞香科植物提取物中表現(xiàn)良好，在8、4 mg/mL時(shí)的抑制效果大多都達(dá)到了100%，對茄子枯萎、番茄枯萎和辣椒枯萎3種枯萎菌的抑制中濃度均小于0.90 mg/mL。

表7 芫花提取物對7種病原真菌的毒力測定

表8 夢花提取物對7種病原真菌的毒力測定

南嶺蕘花又名了哥王，耐干旱，生于山坡的路旁或荒草地中[17]，黃酮類、香豆素類等為其主要次生代謝成分[18]。有學(xué)者研究表明，了哥王乙酸乙酯提取部位具有廣譜的抑制細(xì)菌活性[19]，且具有較好的鎮(zhèn)痛抗炎效果[20]。此外，了哥王中分離的許多活性成分（如西瑞香素、芫花素等）具有明顯的抗腫瘤活性，對消炎、抗病毒以及改善心肌血流量等也有良好的功效[21]。查閱資料發(fā)現(xiàn)，南嶺蕘花對真菌，尤其是對病原真菌的抑制效果及機(jī)理方面的研究較少，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)南嶺蕘花在5種瑞香科植物提取物中表現(xiàn)最差，但對番茄枯萎和黃瓜炭疽的抑制效果良好，在高濃度下抑制率達(dá)到了100%，且EC50值均小于1.10 mg/mL，具有一定的研究價(jià)值。

祖師麻主要由瑞香科植物黃瑞香、陜甘瑞香及凹葉瑞香的根皮及莖皮組成，長白瑞香及結(jié)香均可作中藥祖師麻入藥[22]，主要成分為香豆素類、黃酮類、木脂素類等化合物[23]，在民間被廣泛用于治療跌打損傷、風(fēng)濕和支氣管炎等癥狀[24]，也具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛以及抗腫瘤活性[25-26]。有研究表明，黃瑞香的水提物對小麥條銹病菌的抑制作用良好[27]，其乙醇提取物對小麥紋枯病菌和小麥赤霉菌有顯著的抑制效果，且具有良好的熱穩(wěn)定性[28]。本試驗(yàn)中祖師麻的抑菌效果良好，尤其是對黃瓜靶斑和草莓紅中柱2種病原菌的抑制作用尤為顯著，EC50值均小于0.93 mg/mL，但對枯萎菌的生物活性在5種瑞香科植物提取物中沒有明顯的優(yōu)勢。

芫花在國內(nèi)分布廣泛，常用作中藥，有治療痰飲積聚、氣逆喘咳之效，其化學(xué)成分結(jié)構(gòu)多變，具有極大的研究意義[29]?，F(xiàn)代藥理試驗(yàn)顯示芫花具有抗腫瘤、抗炎等多種活性[30-31]。Tadataka等[32]從芫花中分離出4種黃酮類化合物，其中木犀草素和芹菜素2種化合物具有很強(qiáng)的抗氧化活性。賈俐莉[33]通過流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)，了哥王、芫花和黃芫花的醇提物均對HIV-1潛伏感染有再激活作用。研究表明芫花的乙醇提取物對小麥全蝕病菌、辣椒疫霉病菌和番茄灰霉病表現(xiàn)出較好的持續(xù)抑菌效果[34]。本試驗(yàn)中芫花對4種枯萎病的抑制活性較差，但對其余3種病原菌的抑制中濃度均小于1.1 mg/mL。

結(jié)香與其他樹種相比，易種植且有很強(qiáng)的抗病蟲害能力，目前尚未發(fā)現(xiàn)被病蟲危害現(xiàn)象[35]。據(jù)目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，從結(jié)香的根莖及花中分離的化合物主要包括有機(jī)酸、黃酮類、香豆素類及香氣化合物等[36]。結(jié)香花蕾與中藥材密蒙花的性狀以及藥用價(jià)值較為相似，所以常被作為密蒙花的替代品。韓佳[37-38]通過乙醇浸泡回流，后經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后，發(fā)現(xiàn)各萃取物對大腸桿菌、金色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌、枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌均有不同程度的抑制作用，且結(jié)香花的提取物具一定的抗氧化活性，與其總黃酮含量呈顯著的濃度依賴性。近年來，隨著人們對結(jié)香化學(xué)成分的提取、分離與結(jié)構(gòu)鑒定，以及對其提取物的藥理藥效試驗(yàn)研究的深入，結(jié)香在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展[39]，但與南嶺蕘花、祖師麻、芫花類似，在抑制病害真菌方面的研究較少。本試驗(yàn)中，夢花提取物對茄子枯萎、黃瓜枯萎、番茄枯萎的抑制效果最佳，且在較高的濃度下對7種病原菌的抑制作用都接近100%。綜上所述，夢花與瑞香狼毒在供試的5種植物材料中抑菌效果最佳，尤其是在抗枯萎病方面，夢花有著極高的研究價(jià)值。

本試驗(yàn)采用菌絲生長速率法研究了瑞香狼毒、南嶺蕘花、祖師麻、芫花以及夢花5種瑞香科植物提取物對7種病原真菌的抑菌活性，旨在尋找出一類有潛力的植物資源用以防治植物病害。結(jié)果表明5種瑞香科提取物針對不同病原真菌普遍都有較好的抑菌活性，其中夢花與瑞香狼毒的提取物在針對各種枯萎菌的抑制中，有著突出的表現(xiàn)。雖然南嶺蕘花在所有供試提取物中表現(xiàn)最差，但除了抑制黃瓜靶斑、草莓紅中柱兩種病原菌的效果欠佳，對其余5種病原真菌的抑制中濃度均小于2 mg/mL。瑞香科植株生境相似，其次生代謝活性成分也普遍為黃酮類、香豆素類等，甚至有些同科植物在中藥學(xué)中可以同等入藥，結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果表明，瑞香科植物有成為防治植物病原真菌的新型植物源農(nóng)藥的潛力。