5-氮雜胞苷調(diào)節(jié)植物基因表達(dá)研究進(jìn)展與應(yīng)用展望

方學(xué)良，付 銘，陳 正，白云秀，何 瑩，曾漢來(lái)

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中下游作物生理生態(tài)與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430070）

0 引言

表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)可遺傳變化的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科。表觀遺傳現(xiàn)象廣泛存在且類型較多，主要有核酸甲基化修飾、基因組印記(genomic imprinting)、母體效應(yīng) (maternal effects)、基 因 沉 默(gene silencing)、核仁顯性、休眠轉(zhuǎn)座子激活和RNA編輯(RNA editing)等。核酸甲基化修飾調(diào)控基因的表達(dá)是一種普遍存在的表觀遺傳現(xiàn)象，根據(jù)甲基化的對(duì)象和方式又分為DNA甲基化、RNA甲基化和組蛋白甲基化，甲基化修飾的位點(diǎn)及其修飾豐度均能參與基因的表達(dá)調(diào)控，從而改變生物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。DNA甲基化是指DNA復(fù)制過(guò)程后，通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)將 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)分子上的甲基(CH3-)基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA的CpG序列的胞嘧啶上進(jìn)行DNA甲基化修飾，一般可形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)、N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)以及7-甲基鳥嘌呤(7-mG)。目前研究所關(guān)注的熱點(diǎn)是胞嘧啶上的C-5上發(fā)生甲基化修飾形成5-mC。

5-氮雜胞苷(Azacitidine，5-Aza)是一種DNA甲基化抑制劑，其作用是能降低DNMTs的活性，從而使得甲基轉(zhuǎn)移效率下降，使基因組的甲基化水平下降。近年來(lái)5-Aza在動(dòng)物基因表達(dá)調(diào)節(jié)和醫(yī)療技術(shù)上有廣泛的研究和應(yīng)用，并直接作為腫瘤治療劑進(jìn)行臨床應(yīng)用。但在植物上的研究和應(yīng)用相對(duì)滯后，僅有零星報(bào)道，從已有的文獻(xiàn)也能說(shuō)明5-Aza對(duì)植物基因組甲基化水平有抑制作用，并能調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)和生理特性。

1 DNA甲基化發(fā)生類型

DNA甲基化主要是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下產(chǎn)生的結(jié)果，目前在植物中已知的模式有從頭甲基化和維持甲基化2種。DNA甲基化主要發(fā)生在轉(zhuǎn)座子(TEs)和重復(fù)序列，從而沉默這些區(qū)域的表達(dá)，具有穩(wěn)定基因組的作用[1]。在一些特定區(qū)域的DNA甲基化也可以在有絲分裂或減數(shù)分裂中穩(wěn)定遺傳起到“脅迫記憶”的作用，這些脅迫記憶與細(xì)胞程序性死亡、發(fā)育或應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，可以幫助植物抵御持續(xù)的脅迫。DNA甲基化主要發(fā)生在3種序列當(dāng)中，即對(duì)稱序列CG、CHG和非對(duì)稱序列CHG（H=A或C或T）[2]。不同物種之間全基因組甲基化水平也有所不同，模式植物擬南芥中測(cè)定總胞嘧啶甲基化水平為5%，而小麥胚芽中水平卻高于20%，甲基化水平不同是重復(fù)序列的差異導(dǎo)致的[3]。

從頭甲基化是指在甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下將DNA鏈上未被甲基化的部分進(jìn)行甲基化，在這個(gè)過(guò)程當(dāng)中參與的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是植物所特有的結(jié)構(gòu)域重排酶(DRMs)，主要發(fā)生在非對(duì)稱的序列CHH中。植物DNA從頭甲基化的啟動(dòng)是通過(guò)RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)干擾RNA(siRNA)，依賴siRNA指導(dǎo)以及DRMs參與識(shí)別特異性位點(diǎn)且介導(dǎo)DNA甲基化發(fā)生。

維持甲基化是指發(fā)生甲基化的DNA通過(guò)半保留復(fù)制所產(chǎn)生的一條子鏈在相同的位置發(fā)生甲基化，所發(fā)生的甲基化位置與親鏈相同。其主要發(fā)生在對(duì)稱序列CG與CHG中出現(xiàn)，而甲基轉(zhuǎn)移酶(METs)和染色質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶(CMTs)參與這2個(gè)序列的甲基化活動(dòng)[4]。CG甲基化的維持是由MET1起作用，而MET1突變體還有延遲花期的作用[5]，CMTs是維持CHG位點(diǎn)的DNA甲基化，它是植物特異性DNA甲基化酶。其家族有3個(gè)成員（MET1、MTE2和MET3），均參與維持CHG甲基化，MTE3的活性受H3K9me2甲基化轉(zhuǎn)移酶(SUVH4)的活性水平?jīng)Q定，因此SUVH4也是維持CHG甲基化的一個(gè)重要蛋白[6]。

2 DNA甲基化水平的影響因素

植物在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期所處的調(diào)控狀況不同，會(huì)響應(yīng)不同發(fā)育行為，都取決于基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，因而不同發(fā)育時(shí)期的DNA甲基化水平變化在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。植物不同發(fā)育階段的DNA甲基化水平不同，在細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中，DNA甲基化水平變化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子的分布重組。研究發(fā)現(xiàn)，在4℃預(yù)處理的大麥孢子重塑到胚胎發(fā)育以及花粉發(fā)育過(guò)程中，小孢子時(shí)期的DNA甲基化水平較低，DNA甲基化信號(hào)隨著胚發(fā)育與分化過(guò)程逐漸增加[7]。通過(guò)對(duì)綠化樹種馬占相思(Acacia mangium)的全基因進(jìn)行DNA甲基化測(cè)定發(fā)現(xiàn)，幼嫩組織和成熟組織間DNA甲基化水平存在差異，幼嫩葉片比成熟葉片的甲基化水平高1.7%[8]。對(duì)多種植物DNA甲基化與發(fā)育時(shí)期的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，通常成年植株DNA甲基化水平比幼年植株要高，但也在一些植物上表現(xiàn)存在相反的結(jié)果，仍可說(shuō)明DNA甲基化與植物發(fā)育進(jìn)程是密切相關(guān)的。

環(huán)境因素可調(diào)控植物體內(nèi)DNA甲基化水平，不同環(huán)境中植物體內(nèi)DNA甲基化水平存在著差異。干旱會(huì)影響到植物正常的生理生化過(guò)程，可能會(huì)導(dǎo)致光合速率下降、滲透失調(diào)和細(xì)胞過(guò)氧化等。有研究表明，木材毛果樣干旱時(shí)的DNA甲基化水平會(huì)產(chǎn)生變化，會(huì)導(dǎo)致許多干旱脅迫基因的表達(dá)模式改變。利用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫顯著增加芝麻DNA甲基化水平，比對(duì)照增加了11.44%，當(dāng)脅迫解除后甲基化水平也逐漸恢復(fù)到對(duì)照的水平[9]。也有研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)芥菜品種(RH30、RSPR01)在干旱時(shí)，整體的甲基化水平會(huì)出現(xiàn)下降的趨勢(shì)[10]。

溫度是制約作物產(chǎn)量與品質(zhì)的主要環(huán)境因素之一，高溫和低溫都會(huì)造成一定程度減產(chǎn)。在高溫脅迫下通過(guò)表觀遺傳學(xué)可以調(diào)控?zé)犴憫?yīng)基因的表達(dá)，有研究表明熱脅迫會(huì)誘導(dǎo)抗性基因的甲基化水平改變[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，油菜在熱脅迫下22個(gè)DNA甲基化酶相關(guān)的基因表達(dá)量出現(xiàn)顯著改變[12]。蘋果在不同程度低溫脅迫下，總甲基化百分比隨低溫不同而發(fā)生變化，而基因表達(dá)量也存在差異，推斷甲基化變化與施加的低溫是存在相關(guān)性的，其有可能調(diào)控蘋果的表觀遺傳[13]。低溫處理會(huì)改變玉米的甲基化水平，在幼苗的根部檢測(cè)到低的甲基化，甲基化水平從38.4%下降到24.7%，說(shuō)明低溫造成了甲基化水平下降[14]。模式植物擬南芥受到低溫處理后甲基化水平下降了22%，表明低溫可導(dǎo)致去甲基化[15]。不同環(huán)境下DNA甲基化水平存在差異，有可能參與一個(gè)或多個(gè)生物調(diào)節(jié)途徑，需要更加深入的探索。

化學(xué)物質(zhì)可以調(diào)控DNA甲基化水平，不同化學(xué)物質(zhì)所導(dǎo)致的結(jié)果存在差異，存在正向調(diào)節(jié)與負(fù)向調(diào)節(jié)。姜科植物中的姜黃素可以使DNA甲基化水平降低15%～20%[16]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與胞嘧啶和5-Aza類似。綠茶中的茶多酚和生物黃酮都能調(diào)控DNA甲基化水平，它們主要對(duì)DNMTs的活性起到抑制作用，也抑制DNMTs基因表達(dá)[17]。觀賞植物小白菊的主要成分倍半萜內(nèi)酯可以被烷基化，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變影響轉(zhuǎn)錄因子Sp1的轉(zhuǎn)移效率，使DNMT1相關(guān)的Sp1的數(shù)量減少，降低DNMT1活性，從而降低DNA甲基化水平[18]。中藥砒霜中的主要成分三氧化二砷則可以通過(guò)提高自發(fā)性狼瘡小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞DNMT1相關(guān)基因表達(dá)水平來(lái)提升DNA甲基化水平[19]。以上研究表明，DNA甲基化水平可以被多種化學(xué)物質(zhì)調(diào)控，為研究甲基化機(jī)理提供了更多的途徑。

3 DNA甲基化對(duì)植物基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用

以往許多研究都提出了一個(gè)觀點(diǎn)，DNA甲基化水平與基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[20-21]。啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化，能通過(guò)阻止轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合而直接抑制轉(zhuǎn)錄起始或者通過(guò)調(diào)控組蛋白修飾間接抑制轉(zhuǎn)錄[22]。深入研究發(fā)現(xiàn)，并非所有的啟動(dòng)子甲基化都能抑制轉(zhuǎn)錄，部分基因轉(zhuǎn)錄對(duì)啟動(dòng)子甲基化水平并不敏感。對(duì)植物的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在327種轉(zhuǎn)錄因子中，24%轉(zhuǎn)錄因子不受甲基化抑制或受甲基化抑制作用較弱[23]。另有研究發(fā)現(xiàn)甲基化的啟動(dòng)子對(duì)基因轉(zhuǎn)錄有促進(jìn)作用，這些轉(zhuǎn)錄因子往往具有甲基結(jié)合域(methyl-binding domain，MBD)，能特異性識(shí)別特定甲基化的啟動(dòng)子[24]。轉(zhuǎn)座子會(huì)以高度甲基化來(lái)維持基因組穩(wěn)定性，在擬南芥中轉(zhuǎn)座子也存在于染色體上基因富集的區(qū)域，有研究認(rèn)為這種DNA甲基化對(duì)轉(zhuǎn)錄的激活效應(yīng)是植物中一種避免轉(zhuǎn)座子高度甲基化給鄰近基因帶來(lái)沉默的機(jī)制[25]。轉(zhuǎn)錄調(diào)控與DNA甲基化之間的關(guān)系，有人提出DNA甲基化是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的結(jié)果而不是原因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子能招募甲基轉(zhuǎn)移酶使DNA甲基化[24]，而轉(zhuǎn)錄因子對(duì)DNA甲基化的調(diào)控也有相關(guān)論述[26]。

啟動(dòng)子甲基化對(duì)基因表達(dá)有重要調(diào)控作用，但在擬南芥中，只有大約5%的基因在啟動(dòng)子區(qū)域被甲基化[22]，而超過(guò)1/3的基因本體被甲基化[27]。基因本體甲基化中，絕大多數(shù)為CG甲基化，CHH、CHG甲基化模式占比極少，并且外顯子中甲基化程度大于內(nèi)含子，而轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)的甲基化相對(duì)較少[28]?；虮倔w的甲基化作用有抑制轉(zhuǎn)錄延伸[29]、調(diào)控可變啟動(dòng)子[30]、抑制基因內(nèi)異常轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)[31-32]幾種觀點(diǎn)?；騼?nèi)異常轉(zhuǎn)錄的抑制作用與一項(xiàng)研究[33]結(jié)果相吻合，異常轉(zhuǎn)錄還與組蛋白修飾有關(guān)[34]。基因本體的甲基化對(duì)基因表達(dá)穩(wěn)定性具有調(diào)控作用，對(duì)一種能孤雌生殖的小龍蝦（美洲龍紋螯蝦，Procambarus virginalis）的研究顯示，基因本體甲基化與染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)穩(wěn)定性相關(guān)，甲基化水平低的基因往往具有較高的染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)的變異性，這也證實(shí)了管家基因本體中較高的甲基化水平的原因[35]。基因本體的甲基化水平與染色質(zhì)可及性之間相關(guān)性可能與組蛋白H1在CG序列區(qū)域富集有關(guān)，基因本體上CG往往被甲基化，可是染色質(zhì)可及性似乎又和基因表達(dá)沒(méi)有直接關(guān)系，組蛋白H1突變體的異染色質(zhì)本身變得更松散，功能上卻沒(méi)有改變[32]，表明基因本體的甲基化對(duì)基因表達(dá)穩(wěn)定性的調(diào)控或許還有除染色質(zhì)可及性以外的途徑。在人的骨骼肌細(xì)胞中，外顯子CG甲基化有利于轉(zhuǎn)錄[36]，而在植物中，第6外顯子CG的甲基化反而抑制葉片遠(yuǎn)軸決定基因ETT/ARF3的表達(dá)[37]。對(duì)8種禾本科植物DNA甲基化的研究表明，基因本體的CG甲基化在進(jìn)化上比較保守[38]，基因本體的甲基化功能還需進(jìn)一步的研究來(lái)闡明機(jī)制。

4 DNA去甲基化

DNA去甲基化可以將基因從沉默狀態(tài)激活。DNA去甲基化存在被動(dòng)去甲基化和主動(dòng)去甲基化2種模式。被動(dòng)去甲基化主要是在DNA復(fù)制過(guò)程中，半保留的復(fù)制方式中依賴甲基轉(zhuǎn)移酶活性，酶的活性受到抑制或者含量偏低時(shí)，使新鏈中本該甲基化的位點(diǎn)未發(fā)生甲基化，從而造成甲基化水平降低的模式。主動(dòng)去甲基化是由DNA糖基化酶/裂解酶參與的特殊酶促反應(yīng)，植物基因組上的5-mC可以由DNA糖基化酶等剪切[39]，之后通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成一個(gè)新的未被甲基化的位點(diǎn)，從而降低基因組的DNA甲基化水平的一種DNA去甲基化模式。

5 DNA甲基化抑制劑

DNA甲基化抑制劑主要作用都是在代謝過(guò)程中與DNMTs結(jié)合，從而降低酶的活性，阻礙甲基化進(jìn)程，達(dá)到降低甲基化水平的效應(yīng)。DNMTs抑制劑主要包括核苷類和非核苷類2類，目前已報(bào)道的有5-氮雜胞苷（阿扎胞苷，Azacitidine，5-Aza）、5-氮雜脫氧胞苷（地西他濱，5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-dc）、折布拉林(zebularine)、法扎拉濱(fazarabine)、氨基苯甲酸類（普魯卡因、普魯卡因胺）、茶多酚類（表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酯酸）、肼類（肼屈嗪）、鄰苯二酰胺類(RG108)、反義寡核苷酸類(MG98)、三氧化二砷(Arsenic trioxide)等都具有抑制DNMTs的作用。

目前的研究熱點(diǎn)主要集中在核苷類，它可以作為一種腫瘤治療劑被廣泛研究。核苷類抑制劑有5-Aza和5-Aza-dc，進(jìn)入體內(nèi)可隨機(jī)摻入到DNA鏈中，其嘧啶環(huán)上的第5位氮原子無(wú)法結(jié)合甲基實(shí)現(xiàn)去甲基化，從而恢復(fù)某些關(guān)鍵抑癌基因或DNA修復(fù)基因的轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí)，DNMTs會(huì)結(jié)合5-Aza-dc和SAM的甲基基團(tuán)形成一個(gè)穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合體，但不能完成甲基化轉(zhuǎn)移的催化反應(yīng)，使DNMTs的甲基轉(zhuǎn)移效率整體下降，從而降低全基因組的甲基化水平。5-Aza和5-Azadc在細(xì)胞內(nèi)的作用對(duì)象有所差別，前者主要作用于RNA，部分作用于DNA的甲基化抑制；而后者主要以形成磷酸鹽的方式對(duì)DNA進(jìn)行甲基化抑制作用。已有研究表明，低劑量、低毒性的DNA甲基化抑制劑5-Aza和5-Aza-dc[40]治療血液腫瘤是有效的。其不同于傳統(tǒng)化療藥物，低濃度的藥物劑量可降低細(xì)胞內(nèi)DNMTs表達(dá)，使基因的甲基化程度降低，并不直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而是通過(guò)重新活化被甲基化沉默的抑癌基因，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[41]。近年來(lái)關(guān)于5-Aza的應(yīng)用研究開始成為熱點(diǎn)，其作為一種甲基化抑制劑在植物上的應(yīng)用也開始備受到關(guān)注。

6 5-Aza對(duì)植物基因表達(dá)的調(diào)節(jié)與應(yīng)用效果

近年的研究表明，5-Aza對(duì)植物的DNA甲基化同樣具有抑制作用，可以有效調(diào)控植物基因組的甲基化水平，并使植物隨甲基化水平的變化表現(xiàn)出性狀上的效應(yīng)。已有研究表明，5-Aza對(duì)棉花、小麥、水稻和玉米等多種植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫、生殖生長(zhǎng)、光合作用和品質(zhì)性狀等均有調(diào)節(jié)作用，預(yù)示其在植物上將有廣泛的潛在應(yīng)用價(jià)值。部分相關(guān)研究實(shí)例見(jiàn)表1。

表1 5-Aza對(duì)植物的調(diào)節(jié)效應(yīng)研究進(jìn)展

7 展望

隨著甲基化檢測(cè)技術(shù)的更新?lián)Q代，甲基化檢測(cè)技術(shù)從甲基敏感酶進(jìn)行核酸雜交(Southern blotting)與酶切PCR(CHOP PCR)檢測(cè)、染色質(zhì)免疫共沉淀序列分析(ChP-seq)，發(fā)展到如今廣泛使用的全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序(whole genome heavy sulfite sequencing)技術(shù)，為甲基化位點(diǎn)確定提供了更加精準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)。生物多組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和生物信息學(xué)分析方法在不斷完善和發(fā)展中，使整體甲基化水平與單個(gè)甲基化位點(diǎn)的生物學(xué)功能分析更加準(zhǔn)確。5-Aza作為一種DNA甲基化抑制劑，為動(dòng)物腫瘤、骨質(zhì)增生等疾病的治療提供了新的醫(yī)治途徑，提高了靶向治療準(zhǔn)確性和治愈效果。在植物方面可以調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性、提高植物愈傷組織分化和再生能力、能促進(jìn)花器官發(fā)育提高花粉育性和結(jié)實(shí)率等效應(yīng)，已表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用前景。

DNA甲基化抑制劑在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)上的研究目前還是處于起始階段，需要加強(qiáng)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用技術(shù)研發(fā)，確定5-Aza安全合理的使用劑量與使用時(shí)期、減弱或消除毒害作用、改進(jìn)施用方式，還需深入探索其對(duì)基因調(diào)控的作用機(jī)理。應(yīng)用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)以及代謝組學(xué)聯(lián)合分析5-Aza的作用靶標(biāo)基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從基因表達(dá)與代謝調(diào)節(jié)層次上解析5-Aza的處理效應(yīng)，為作物品種改良和栽培調(diào)節(jié)提供表觀遺傳修飾方面的理論依據(jù)與應(yīng)用技術(shù)。