菊花含量測定方法提高

王小芳　鄭倩倩　路麗娟

【摘 要】 目的：改進《中國藥典》中菊花含量測定方法，使其中3，5-O-二咖啡?；鼘幩崤c其同分異構(gòu)體1，5-O-二咖啡酰基奎寧酸得到良好分離，提高測定結(jié)果準確性。方法：Inertsil ODS-3 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-甲醇-0.2%冰醋酸溶液梯度洗脫，檢測波長為348 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進樣量10 μL。結(jié)果：綠原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡?；鼘幩岱蛛x良好，在12.583～314.582、12.595～314.878、15.599～389.978 μg/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r=0.9999、1.0000、0.9995）;平均加樣回收率分別為98.21%、102.18%、97.77%，RSD為1.54%、0.99%、1.01%（n=6）。結(jié)論：該方法專屬性強，準確、靈敏，解決了現(xiàn)行方法的問題。

【關(guān)鍵詞】 菊花;含量測定;3，5-O-二咖啡?；鼘幩?/p>

【中圖分類號】R927.2 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2022）01-0044-05

Improve Chinese Pharmacopoeia Contentdetermination of Chrysanthemum Morifolium Ramat.

WANG Xiaofang ZHENG Qianqian LU Lijuan

Shijiazhuang Institute for Food and Drug Control，Shijiazhuang 050011， China

Abstract：Objective To improve contentdetermination of Chrysanthemum morifolium Ramat.?in the current Chinese Pharmacopoeia to well separate 3，5-O- Dicaffeoyl quinic acid.?Methods Inertsil ODS-3 C18 （4.6×250 mm，5 μm） ，with the mobil phase comprising of acetonitrile- methanol -0.2%ice acetate flowing at 1mL/min in a gradient elution manner， and the detection wavelengths were set at 348 nm，and the column temperature was 30 ℃.Results The linear ranges of chlorogenic acid， luteolin， 3，5-O-dicaffeoyl quininic acid fell into 12.583～314.582 μg/mL （r=0.9999）、12.595～314.878 μg/mL（r=1.0000）、15.599～389.978 μg/mL（r=0.9995）respectively.The average recovery of chlorogenic acid， luteolin， 3， 5-O-dicaffeoyl quininic acid were 98.21%、102.18%、97.77%with the RSDs of 1.54%、0.99%、1.01%（n=6）.Conclusion The new mothed is specific，accurate and sensitive.?It solves the problems of the current Chinese pharmacopoeia mothed.

Key?words：

Chrysanthemum Morifolium Ramat.; Content Eetermination; 3，5- Dicaffeoylquinic Acid

菊花為菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序。具有散風清熱、平肝明目、清熱解毒的功效，用于風熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒。藥理研究表明菊花具有抗病毒、抑菌、抗炎、抗氧化等藥理作用，其主要成分為黃酮類、有機酸類、揮發(fā)油類等。

該品種現(xiàn)行標準為2020版《中國藥典》，含量測定以綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?個成分作為其質(zhì)控成分，采用高效液相色譜法，以乙腈-0.1%磷酸溶液進行梯度洗脫。但在日常檢驗中發(fā)現(xiàn)，采用藥典方法測定含量時3，5-O-二咖啡?；鼘幩崤c其同分異構(gòu)體1，5-O-二咖啡?；鼘幩岵荒苡行Х蛛x，導致計算結(jié)果偏差較大，不能真實反應該成分含量，需要對現(xiàn)有方法進行改進。雖然近年來關(guān)于菊花多成分測定的報道較多，但并未檢索到能將二者有效分離的高效液相色譜方法。因此本實驗對菊花含量測定方法進行改進，通過改變流動相對色譜條件進行改進和優(yōu)化，實現(xiàn)對3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬挠行Х蛛x，從而提高檢測結(jié)果的準確性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters ARC高效液相色譜儀（美國Waters公司）;CPA225D電子天平（德國賽多利斯公司）;Elmasonic P 超聲波清洗儀（德國Elma公司）;水浴鍋（天津泰斯特）。

1.2 試藥 綠原酸對照品（批號：110753-201716，純度以99.3%計）、木犀草苷對照品（批號：111720-201408，純度以94.8%計）、3，5-O-二咖啡?；鼘幩釋φ掌罚ㄅ枺?11782-201706，純度以97.3%計）均購自中國食品藥品檢定研究院;1，5-O-二咖啡?；鼘幩幔ㄅ枺篍-0447-18042523，上海同田生物技術(shù)股份有限公司）。乙腈、甲醇、冰醋酸、磷酸均為色譜純;水為超純水。4批菊花（購自市場）經(jīng)本中心畢飛霞老師鑒定為菊科植物菊 Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序，樣品1為杭白菊、樣品2～4為貢菊。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性 試驗Inertsil ODS-3 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-甲醇-0.2%冰醋酸溶液梯度洗脫，程序見表1，檢測波長為348 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進樣量10 μL。

本方法，綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岣鞣宓睦碚摪鍞?shù)均大于10000，分離度均大于1.5。本方法和藥典方法條件下，對照品和供試品色譜圖如圖1所示。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品儲備液和混合對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩釋φ掌愤m量，加70%甲醇分別制成含綠原酸1.5729 mg/mL、木犀草苷1.5744 mg/mL、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?.9499 mg/mL的對照品儲備液。分別精密吸取上述儲備液各1 mL，用70%甲醇定容至25 mL，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取菊花粉末（過一號篩）約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率45 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學評價

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項下的各對照品儲備液1 mL置5、10、25、50 mL量瓶、2 mL置250 mL量瓶，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得稀釋5、10、25、50、125倍的5 個濃度梯度的線性考察混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。以對照品濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度考察 取2.3.3項下制備的樣品溶液1份，按照2.1項下色譜條件進行測定，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖峰面積，測得綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岱迕娣e的RSD值分別為0.85%、0.44%、0.52%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性考察 取同一批供試品，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”色譜條件下進樣測定，測得6份樣品中綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷康腞SD值分別為0.64%、1.41%、1.03%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 回收率試驗 精密稱取同一批供試品約0.125 g，共6份，置于具塞錐形瓶中，精密加入各對照品，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表3，結(jié)果說明該方法的準確度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性考察 取2.3.3項下制備的樣品溶液1份，按照2.1項下色譜條件進行測定，分別在0、2、6、8、16、24 h進樣，記錄色譜圖，計算3種成分峰面積的RSD值，綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷康腞SD值分別為1.25%、0.66%、0.55%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.6 色譜柱耐用性試驗 取同一批樣品，照“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，對不同品牌色譜柱的耐用性進行考察，并計算含量。其中Agilent 5Tc-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱在2.1色譜條件下木犀草苷和3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬姆蛛x度均小于1.5。TechMate C18-ST（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）系統(tǒng)適用性較好，結(jié)果見表4。

2.3.7 樣品的測定 按2.2.2項下方法，制備4批菊花供試品溶液，按2.1項下色譜條件和藥典方法分別進行含量測定，記錄峰面積，按干燥品計算樣品中綠原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮?。結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 分析條件的優(yōu)化 實驗過程中首先選用了3種不同品牌色譜柱Agilent 5Tc-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）、TechMate C18-ST（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm），在藥典方法乙腈-0.1%磷酸溶液的基礎上調(diào)整流動相比例，但3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷?，5-O-二咖啡?；鼘幩峋睾显谝黄穑瑹o法分離。之后改變流動相組成，采用甲醇-磷酸溶液系統(tǒng)，可使3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和1，5-O-二咖啡?；鼘幩岱蛛x度大于1.5，但木犀草苷分離度小于1.5。后又試驗了乙腈-甲醇-0.1%磷酸系統(tǒng)和乙腈-甲醇-0.2%冰醋酸系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)，乙腈-甲醇-0.2%冰醋酸梯度洗脫各成分分離度較好，綠原酸、木犀草苷，3，5-O-二咖啡?；鼘幩岱蛛x度均大于1.5，最終選擇該系統(tǒng)梯度洗脫。

3.2 檢測波長的選擇 通過掃描200～400 nm波長范圍內(nèi)的紫外吸收，發(fā)現(xiàn)綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬淖畲笪辗謩e為326.1、348.8、327.3 nm，綠原酸和3，5-O-二咖啡?；鼘幩嵩?27 nm與348 nm處的峰面積比接近1.8，木犀草苷在327 nm與348 nm處的峰面積比接近0.8，如果檢測波長選擇327 nm對3種成分峰面積影響較小，但是由于木犀草苷的含量較低，峰面積較小，對其準確度影響較大，因此本方法還是采用藥典方法的348 nm。

3.3 2020版《中國藥典》菊花含量測定 方法中3，5-O-二咖啡?；鼘幩崤c1，5-O-二咖啡?；鼘幩岵粌H出峰時間一致，且二者混合物的紫外吸收與3，5-O-二咖啡?；鼘幩嵋餐耆恢拢ㄈ鐖D2所示），在日常檢驗中很容易誤判，造成檢驗結(jié)果的誤差。藥典菊花中3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬南薅葹椴坏蒙儆?.70%，由樣品測定結(jié)果可以看出，3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量前后相差較大，有的甚至會影響其是否合格的判定。相比藥典方法，本方法解決了3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬姆蛛x問題，檢測結(jié)果更加可靠。

本實驗采用的新方法能較好的分離菊花中的綠原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸，具有較高的靈敏度和準確度，重現(xiàn)性好，解決了現(xiàn)行方法3，5-O-二咖啡?；鼘幩崤c1，5-O-二咖啡?；鼘幩岵荒芊蛛x的問題，可作為該品種含量方法改進的參考。

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（收稿日期：2021-05-06 編輯：陶希睿）