蓮心堿對大鼠非酒精性脂肪肝組織的保護作用及機制研究

李俊雅 梁曉

【摘要】目的：研究蓮心堿對非酒精性脂肪肝（NAFLD）肝細胞炎癥以及NF-κB、TNF-α凋亡相關蛋白表達的影響，探討蓮心堿對NAFLD的治療作用和機制。方法：高脂飼料喂養(yǎng)大鼠8周構建NAFLD模型，模型構建成功后隨機分為正常空白組、高脂模型組、蓮心堿低劑量組和高劑量組，每組8只。喂養(yǎng)至12周末麻醉處死后取材，HE染色觀察大鼠肝組織病理學改變情況，檢測肝組織血清谷丙轉氨酶（ALT）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）表達水平，NF-κB、TNF-α表達情況。結果：高脂模型組NF-κB、TNF-α、ALT、TC、TG水平顯著高于正常對照組（P<0.05）。相比高脂模型組，蓮心堿高、低劑量組水平降低（P<0.05），且劑量越高降低越明顯。結論：蓮心堿可減少NF-κB、TNF-α的產生，發(fā)揮抗炎作用，從而對NAFLD引起的血脂增高和肝功能損傷起到一定保護和治療作用。

【關鍵詞】蓮心堿;非酒精性脂肪肝;保護作用

【中圖分類號】R285.5【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2022）04-0029-04

Protective Effect and Mechanism of Liensinine on Nonalcocholic Fatty Liver in Rats

LI Junya1LIANG Xiao2

1.XiangTan Medicine and Health Vocational College， institute of medical technology， Xiangtan 411102， China;

2.Guilin Medical University， Guilin 541199， China

Abstract：Objective To observe the effects of Liensinine on the expression of NF-κB and TNF-α proteins related to inflammation and apoptosis in hepatocytes of rats with non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）， and to explore the protective effect and mechanism of liensinine in the pathogenesis of NAFLD. Methods NAFLD model was established in rats fed with high-fat diet for 8 weeks. After the model was established， rats were randomly divided into control group， high-fat model group， low-dose group and high-dose group with 8 rats in each group. The rats were sacrificed at the end of 12 weeks after feeding. The pathological changes of liver were observed by HE staining. The expression levels of alanine aminotransferase （ALT）， total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， and the expressions of NF-κB and TNF-α in serum of liver tissues were detected.Results Compared with the control group， levels of NF-κB， TNF-α， ALT， TC and TG in high fat model group were significantly increased （P<0.05）.Compared with the high-fat model group， the levels of lieninine in high-dose and low-dose groups were decreased （P<0.05）. The higher the dose， the more significant the decrease was. Conclusions Lieninine can reduce the production of NF-κB and TNF-α， and play an anti-inflammatory effect， thus playing a protective and therapeutic role in the increase in blood lipid and liver function injury caused by NAFLD.

Keywords：Liensinine; Noalcoholic Fatty liver; Protection

非酒精性脂肪性肝?。∟onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是排除酒精、感染之外出現肝臟脂肪過度堆積的一種肝臟疾病。NAFLD可逐漸發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌，同時還可增加糖尿病和心血管疾病的罹患風險[1-2]。隨著人們飲食結構和生活習慣的改變，肥胖及代謝綜合征的流行，NAFLD已經成為一種全球性的疾病，發(fā)病率在世界范圍內逐年上升，發(fā)病年齡年輕化，逐漸成為影響人類健康的最常見肝病之一[3]。目前，NAFLD的發(fā)病機制復雜，國內外學者大多認為NAFLD 發(fā)病主要與氧化應激、細胞過度凋亡和過度炎癥反應密切相關。NAFLD可劃歸于中醫(yī)的“脅痛”“積聚”“癥瘕痞塊”等疾病范疇。近年來中醫(yī)藥治療NAFLD的療效日益受到重視。本研究通過觀察蓮心堿對NAFLD大鼠肝組織NF-κB、TNF-α表達的影響，探討蓮心堿防治NAFLD的可能作用途徑，為治療NAFLD篩選有效藥物提供實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗動物健康雄性SD大鼠48只，體重（180±20）g，購于中南大學湘雅醫(yī)學院實驗動物中心。動物合格證號：SCXK（湘）2019-0041。

1.2試劑與儀器全自動生化分析儀（美國亞培公司），Alpha Imager 2200型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Alpha公司）;超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）;電子分析天平（德國Sartarius公司）;HH-2型恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）;高速離心機（德國Eppndorf 公司）;光學顯微鏡（日本Olympus公司）;ELISA試劑盒、蛋白免疫印跡系統(tǒng)（美國BIO-Rad公司）;WD-9405B型水平搖床（北京市六一儀器廠）。

1.3模型建立、分組及給藥造模：大鼠適應性喂養(yǎng)3天后，隨機分出8只作為8周空白組（第8周處死）和8只12周空白組（第12周處死），普通飼料喂養(yǎng)。其余大鼠均采用高脂飼料（基礎飼料88%、膽固醇2%和豬油10%）喂養(yǎng)8周，隨機選取8只，進行肝臟病理組織學檢查以確定是否造模成功。

分組：造模成功后，將剩余24只模型大鼠隨機分為NAFLD模型組、蓮心堿低劑量組和高劑量組，每組8只，繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料至實驗結束。

給藥：空白組和模型組給予同等劑量的生理鹽水，藥物預處理12周后，禁食12 h，10%水合氯醛（3.0 mL/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血約5 mL，取肝組織，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4血清生化指標檢測測定空腹血清谷草轉氨酶（AST），谷丙轉氨酶（ALT），總膽固醇（TC），甘油三酯（TG）水平。血漿靜置2 h后，3000 rpm/min，4 ℃離心10 min，取上清液進行檢測。

1.5病理學觀察取肝臟右葉中部距邊緣，剪取0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm肝組織若干塊，置于10%多聚甲醛液中固定24 h，梯度乙醇洗脫后，石蠟包埋，切片（約4 cm厚度），使用蘇木精-伊紅染色（HE染色），光鏡下觀察肝組織的細胞脂肪變、炎癥細胞浸潤和壞死程度等病理學形態(tài)。

1.6Western Blot測定肝組織NF-κB、TNF-α蛋白表達取各組肝組織20 μg，放入加有裂解液PIRA和蛋白抑制劑PMPF混合液的EP管中，充分裂解肝組織。每個樣本取出20 μL蛋白液進行蛋白定量，按目標蛋白NF-κB及TNF-α濃度配制分離膠，電泳后轉至PVDF膜，取出PVDF 膜，TBST沖洗3次，封閉結束后，將PVDF膜置于1∶[KG-3/5]1000稀釋的一抗溶液中，4 ℃冰箱孵育過夜，TBST沖洗3次，加入1∶[KG-3/5]2000稀釋的二抗溶液，室溫搖床孵育1 h。等比例混合BeyoEclplus A、B液，均勻滴加在PVDF膜表面，包覆封裝后放置于暗盒中，在暗室中顯影曝光。顯影30～70 s后用清水沖洗，定影2～3 min，漂洗干凈，自然晾干。

1.7統(tǒng)計學方法采用 SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數據以均數加減標準差（x±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析。

2結果

2.1大鼠血清生物化學指標的檢測結果實驗結果顯示，模型組的血脂（TC、TG）和肝功能（ALT、AST）較同期空白組明顯上升（P<0.01），并且8周模型組和12周模型組差異顯著，存在統(tǒng)計學意義（P<0.05），證實高脂誘導的NAFLD模型成功致使大鼠肝細胞損傷，喂養(yǎng)時間越長，肝細胞損傷越嚴重。對比同期模型組，治療組血清中的TC、TG和ALT、AST含量下降明顯（P<0.01），但仍高于正?？瞻捉M。蓮心堿治療能降低大鼠血脂、膽固醇和肝功能方面，高劑量組最為顯著。具體見表1。

2.2大鼠肝臟病理結果正常空白組肝小葉結構清晰，未見肝細胞脂肪變性及炎癥細胞浸潤，無明顯的病理變化。模型組的肝細胞腫脹，表現出彌漫性脂肪變，內部可見數量不一、大小不等的脂滴分布，胞質出現空泡狀改變，其中以中央靜脈周圍改變最明顯。肝小葉內和匯管區(qū)被炎癥細胞浸潤，并且肝小葉內可觀察到局灶性點或片狀的壞死灶。蓮心堿治療組肝細胞小葉結構基本完整，但存在輕度水腫。與模型組相比，蓮心堿治療組肝細胞內的脂滴數量下降，炎癥浸潤、脂肪變性壞死程度均表現出明顯改善，以高劑量組尤為明顯。具體如圖1所示。

2.3肝組織NF-κB及NF-α蛋白表達Western Blot檢測NAFLD大鼠肝組織中NF-κB、TNF-α基因表達。相比空白組，模型組肝臟組織中NF-κB蛋白表達顯著上升（P<0.01），藥物治療后，NF-κB蛋白表達有所下降，高劑量組優(yōu)于低劑量組（P<0.01）;藥物干預后各組TNF-α表達均不同程度降低，蓮心堿高劑量組與低劑量差異明顯（P<0.01），高劑量組顯著優(yōu)于低劑量組。具體見表2。

3討論

ALT、AST是存在于肝細胞漿內的細胞因子，是肝臟代謝和轉運功能的常見指標，當肝細胞受損時，能夠進入血清中，導致血清ALT、AST水平升高， 因此，血清ALT、AST水平的高低是肝損傷的測定指標[4-6]。本研究構建的模型大鼠血清ALT、AST 水平升高，肝臟指數升高，肝組織中 TG、TC 水平升高，說明成功構建了NAFLD大鼠模型。TNF- α是一種肝損傷早期出現的一種促炎因子，可以誘導Kupffer細胞合成大量的白介素，導致中性粒細胞聚集，引起肝臟炎癥和損傷[7-8]。而 NF-κB是機體內調控促炎細胞因子（TNF-α等）的轉錄與合成的關鍵調控因子。所以，通過NF-κB信號通路調節(jié)機體免疫炎性反應，可以積極改善肥胖所致NAFLD。

蓮心堿主要是從中藥蓮子心中提取分離得到的生物堿。蓮在我國各地均有栽培，主產于湖北、浙江、江西、福建、湖南等地[9]。現代藥理學研究[10]表明蓮具有調脂減肥、降血糖、抗氧化、抗病毒、抑菌抗炎、抗焦慮和抗抑郁等作用。楊丹虹等[11]發(fā)現蓮的提取物通過改善肝細胞脂變，可以拮抗高脂高糖所導致的NAFLD。史霄燕等[12]發(fā)現蓮心堿能夠明顯抑制多種誘聚劑誘導的高脂血癥患者，治療高脂血癥。范婷婷等[13-14]認為蓮總生物堿能抑制前脂肪細胞3T3-L1的增殖，調節(jié)脂代謝紊亂，從而控制體重、預防肥胖的功效。

本實驗采用高脂飲食構建NAFLD大鼠模型，12周高脂喂養(yǎng)后，發(fā)現大鼠肝組織TC、TG、ALT和AST水平和NF-κB、TNF-α表達及血清明顯上升，肝臟病理學出現脂肪變化，炎癥加重。本研究用不同劑量蓮心堿對NAFLD大鼠模型進行干預，結果顯示： 蓮心堿尤其是高劑量組可能通過降低NF-κB、TNF-α的表達，減少炎癥因子的釋放，進而減少肝細胞損傷，顯著降低血清ALT、AST 水平，對血清TC、TG水平也有一定程度的降低，肝臟病理學改變也顯示肝小葉內脂肪變細胞減少、縮小及炎癥、壞死細胞減少、消失。實驗結果也表現出量效依賴性，但量效關系中最佳治療劑量的確定以及藥物的安全性尚需進一步研究。

綜上所述，蓮心堿能夠減輕NAFLD大鼠肝組織損傷，其作用機制可能與抑制炎癥反應有關，蓮心堿可能是治療NAFLD的有效藥物。

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（收稿日期：2021-07-06編輯：劉斌）

基金項目：湖南省教育廳科學研究項目（項目編號：19C1798）。

作者簡介：李俊雅（1983- ），女，漢族，碩士，副教授，研究方向為中藥化學成分和藥理作用。E-maiL：lijun19831016@163.com

通信作者：梁曉（1981-），男，漢族，博士，副教授，研究方向為中藥有效成分及其作用機制研究。E-maiL：liangxiao5680@163.com