生物合成D-丙氨酸研究進(jìn)展

陳 哲， 何廣正， 徐書景， 鞠建松

(河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024)

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，科研人員發(fā)現(xiàn)D-氨基酸在植物、動(dòng)物、微生物中發(fā)揮著特定的生物學(xué)功能[1-2]，如在哺乳動(dòng)物中，D-絲氨酸(D-serine)作為N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的共同激動(dòng)劑，與大腦的學(xué)習(xí)以及記憶相關(guān)[3-4].D-天冬氨酸(D-aspartic acid)在內(nèi)分泌中發(fā)揮著重要作用，它可以調(diào)節(jié)合成激素以及促進(jìn)分泌精子[5].作為非天然氨基酸，D-丙氨酸(D-alanine)是參與構(gòu)成細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖層的重要成分之一，主要以D-丙氨酰-D-丙氨酸的形式參與構(gòu)建細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層[6-8].敲除嗜水氣單胞菌中的丙氨酸消旋酶基因后，當(dāng)培養(yǎng)基中含有D-丙氨酸時(shí)，基因缺失菌生長(zhǎng)良好；當(dāng)限制供給D-丙氨酸后，缺失菌則呈現(xiàn)細(xì)胞壁穿孔、內(nèi)容物滲漏現(xiàn)象，這說明D-丙氨酸與維持細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性存在密切聯(lián)系[9].D-丙氨酸在芽孢桿菌孢子萌發(fā)方面發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)功能，Chesnokova等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在孢子形成后期，D-丙氨酸發(fā)揮著抑制孢子過早萌發(fā)的作用.

此外，D-丙氨酸作為一種重要的手性中間體，在食品、化妝品、生理醫(yī)學(xué)和制藥等方面應(yīng)用廣泛，是亟需開發(fā)的新品種之一[2,11].在食品方面，D-丙氨酸主要作為食品的增味劑和調(diào)味劑，可以改善人工甜味劑的味感及有機(jī)酸的酸味等[12-13]；在化妝品方面，D-丙氨酸不僅具有抑菌作用，是自然保濕因子(natural moisturizing factor,NMF)的主要成分，還是角質(zhì)層保持水分的重要角色[14]；在生理醫(yī)學(xué)方面，D-丙氨酸可以使體內(nèi)氨基酸氧化酶在腫瘤細(xì)胞質(zhì)中異位表達(dá)，阻止體內(nèi)脂質(zhì)氧化損傷，消除細(xì)胞毒素，可以作為一種治療癌癥的藥物[1,15-16]；在制藥方面，D-丙氨酸既是合成維生素B6和抗生素virginiamycin系列藥物的原料，本身也具有鎮(zhèn)痛作用[17-19].

目前，已有許多關(guān)于D-丙氨酸制備的文獻(xiàn)報(bào)道.然而，隨著人們對(duì)綠色可持續(xù)發(fā)展理念的認(rèn)識(shí)不斷深入，開發(fā)低成本無污染的生產(chǎn)工藝逐漸成為亟待解決的問題.為此，介紹了D-丙氨酸的生產(chǎn)方法，分析了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為合理優(yōu)化D-丙氨酸的合成工藝提出新的思路.

1 D-丙氨酸的理化性質(zhì)

D-丙氨酸(D-alanine)的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式為CH3CH(NH2)COOH，分子式為C3H7NO2，結(jié)構(gòu)式如圖1所示.D-丙氨酸的結(jié)晶態(tài)呈無色、可溶于水、微溶于乙醇、不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，熔點(diǎn)為297 ℃.

圖1 D-丙氨酸結(jié)構(gòu)式Fig.1 The Sketch of D-alanine

2 D-丙氨酸的制備方法

制備D-丙氨酸的方法主要有化學(xué)合成法[17]、微生物發(fā)酵法[20-21]和生物酶法[22-23].

2.1 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法包括手性拆分法和不對(duì)稱合成法[17].手性拆分法是先通過化學(xué)合成法合成DL-丙氨酸的混合物，再利用光學(xué)方法拆分DL-丙氨酸，最后得到D-丙氨酸，其可分為物理拆分法、化學(xué)拆分法和酶拆分法3種[13,24].不對(duì)稱合成法是指直接采用化學(xué)合成法合成D-丙氨酸[25-26].

2.1.1 手性拆分法

1) 物理拆分法.包括對(duì)映選擇性結(jié)晶法、色譜拆分法、膜拆分法[27-28].對(duì)映選擇性結(jié)晶法又稱誘導(dǎo)結(jié)晶法，是指向含有DL-氨基酸飽和溶液中加入有光學(xué)活性的化學(xué)試劑，具有與該化學(xué)試劑光學(xué)活性相同的晶體將會(huì)優(yōu)先析出.

龐秀言等[28]采用了混合晶體接種法，根據(jù)α-丙氨酸的立體特異性，向DL-丙氨酸混合溶液中加入了L-丙氨酸，進(jìn)行冷卻、恒溫結(jié)晶，飽和溶液中的L-丙氨酸析出.

一些高分子金屬絡(luò)合物具有手性配體，可以作為手性固定相，進(jìn)行手性配體交換色譜，這種方法叫做色譜拆分法，也稱手性固定相拆分法.在DL-丙氨酸中加入光學(xué)活性劑N-三氟乙?；⊥?，利用硅膠毛細(xì)管分離出D-丙氨酸[17，29].

膜拆分法的原理類似于色譜拆分法，它依賴于氨基酸消旋體與溶液中的陽離子，以及與手性固定相形成復(fù)合物的穩(wěn)定性差異[27].

2) 化學(xué)拆分法.是指外消旋氨基酸和手性拆分試劑(如酒石酸、樟腦、磺酸等)作用，形成各自的氨基酸鹽，然后利用其物理性質(zhì)或化學(xué)性質(zhì)的差異將它們分離，最后將拆分劑去除，從而得到不同的異構(gòu)體[17,27].反應(yīng)原理為

DL-丙氨酸 + 手性拆分劑 →L-丙氨酸鹽 /D-丙氨酸鹽.

蔣立建等[30]將DL-丙氨酸與拆分劑L-酒石酸溶于甲酸、乙酸或丙酸等有機(jī)酸中，加熱攪拌，再冷卻至室溫，得到結(jié)晶固體，隨后將結(jié)晶溶于甲醇、乙醇或丙醇等醇溶液中，以三乙胺、氨水或碳酸銨等堿中和，終產(chǎn)物D-丙氨酸的收率為70 %，光學(xué)純度為98.5 %.

3) 酶拆分法.由于酶具有特異性及專一性的特點(diǎn)，可以只催化其中一種消旋體進(jìn)行反應(yīng)，而對(duì)另一種消旋體幾乎不起作用，該反應(yīng)大都在溫和的條件下進(jìn)行.王曉平等[31]利用固定化米曲氨基?；覆鸱忠阴；疍L-丙氨酸，在pH 7.0,50 ℃條件下，D-丙氨酸和L-丙氨酸的回收率分別為83.5 %和90 %，純度均為光譜純.劉鵬剛等[32]利用固定化含氨基?；傅拇竽c桿菌拆分乙酰化DL-丙氨酸，在50 ℃，pH 7.5條件下反應(yīng)6 h，D-丙氨酸的產(chǎn)率為87.2 %，光學(xué)純度為98 %.

氨基酸氧化酶也可用于拆分DL-丙氨酸.氨基酸氧化酶按照底物特異性可分為L(zhǎng)-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase,LAAO,EC 1.4.3.2)和D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO,EC 1.4.3.3)，屬于黃素蛋白酶類，可氧化L-氨基酸或D-氨基酸生成相應(yīng)的酮酸、過氧化氫和氨.因此，利用LAAO可催化DL-氨基酸混合物中的L-對(duì)映體氧化脫氨，保留D-對(duì)映體，從而實(shí)現(xiàn)DL-氨基酸的拆分(圖2)[33].Singh等[34]利用Aspergillusfumigatus來源的LAAO對(duì)DL-丙氨酸實(shí)現(xiàn)了完全拆分(D-丙氨酸為100 %)，受底物特異性的影響，該酶對(duì)于DL-酪氨酸和DL-苯丙氨酸的拆分能力下降，拆分率分別為84.1 %和80.2 %，對(duì)DL-天冬氨酸則無法拆分.

圖2 LAAO氧化反應(yīng)方程Fig.2 The Sketch of Oxidization by L-amino Acid Oxidase

2.1.2 不對(duì)稱合成法

1) Kagan-Corey合成法.由Kagan等提出，隨后經(jīng)Corey等改進(jìn)，用于化學(xué)合成D-丙氨酸的方法[27].該方法將前體α-酮酸與手性試劑二氫吲哚衍生物結(jié)合生成環(huán)狀中間體亞聯(lián)氨基內(nèi)酯，通過選擇性還原亞氨基，產(chǎn)生α-氨基酸手性碳，隨后經(jīng)氫解反應(yīng)生成D-丙氨酸，終產(chǎn)物光學(xué)純度可達(dá)96 %.

2) 銠(Ⅱ)絡(luò)合催化法.此方法采用Wilkinson催化劑，即銠(Ⅰ)絡(luò)合物Rh(Ph3P)3Cl，以含有雙鍵的氨基酸衍生物作為反應(yīng)底物，通過主體選擇性還原反應(yīng)合成D-丙氨酸，反應(yīng)產(chǎn)物光學(xué)轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)91 %[17,35].

3) Evans合成法.Evans等將非手性的羧酸與光學(xué)手性試劑縮合，所生成的中間產(chǎn)物在堿性條件下經(jīng)烯醇化反應(yīng)與手性試劑絡(luò)合生成D-丙氨酸[17,27].此反應(yīng)存在立體效應(yīng)制約，而且反應(yīng)產(chǎn)物立體構(gòu)型單一.

4) Oguri合成法.Oguri等將甘氨酸與手性試劑2-羥蒎烯-3-酮反應(yīng)形成希夫堿，甘氨酸中活化的α-氫與碘甲烷(MeI)通過烷基化反應(yīng)產(chǎn)生D-丙氨酸，反應(yīng)收率為52 %，光學(xué)純度達(dá)83 %[27].

由于不對(duì)稱合成反應(yīng)所需的手性試劑或金屬絡(luò)合物的價(jià)格昂貴，且存在著反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜、生產(chǎn)時(shí)間較長(zhǎng)和立體效應(yīng)制約等諸多不足，限制了這些方法的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用.

2.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法即通過篩選生產(chǎn)菌株或構(gòu)建突變株，采用發(fā)酵法生產(chǎn)獲得D-丙氨酸.方序等[36]通過誘變育種篩選獲得一株DL-丙氨酸的高產(chǎn)菌株-鈍齒棒狀桿菌P1412，經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化，產(chǎn)物DL-丙氨酸最終濃度可達(dá)51 mg/mL，產(chǎn)率為35.5 %.Smith等[37]構(gòu)建了敲除影響丙氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶(丙酮酸甲酸裂解酶、磷酸烯醇丙酮酸合成酶、丙酮酸氧化酶、乳酸脫氫酶等)基因的大腸桿菌，以之為宿主導(dǎo)入含有球形芽孢桿菌丙氨酸脫氫酶的表達(dá)載體pTrc99A-alaD，通過流加法厭氧發(fā)酵23 h，產(chǎn)物DL-丙氨酸達(dá)88 g/L，其合成途徑如圖3所示.張學(xué)禮等[38]以大腸桿菌XZ-A26為出發(fā)菌株，敲除其自身的乳酸脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶、乙醇脫氫酶、富馬酸還原酶、丙氨酸消旋酶、甲基乙二醛合成酶等基因，并將枯草芽孢桿菌168來源的L-丙氨酸脫氫酶基因和丙氨酸消旋酶基因整合至宿主染色體上，構(gòu)建獲得工程菌株大腸桿菌XZ-A30，在添加有葡萄糖等糖類原料的發(fā)酵培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵40～60 h，產(chǎn)物DL-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)114.6 g/L(D-丙氨酸與L-丙氨酸比例約為1∶1).

虛線表示由異源丙氨酸脫氫酶轉(zhuǎn)換介導(dǎo).符號(hào)“×”表示通路的關(guān)鍵酶被敲除.圖3 大腸桿菌中丙氨酸的生物合成途徑Fig.3 The Biosynthetic Pathway of Alanine by Escherichia coli

可以看出，微生物發(fā)酵法的生產(chǎn)工藝比較簡(jiǎn)單，有較大的發(fā)展?jié)摿ΓN篩選和改造比較困難，培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，反應(yīng)能耗高，且反應(yīng)產(chǎn)物拆分技術(shù)亟待突破.

2.3 生物酶法

2.3.1 海因酶法

海因酶(hydantoinase,EC 3.5.2.2)也稱為乙內(nèi)酰脲酶，屬于酰胺水解酶，特異催化裂解海因、5′-單取代海因及其衍生物中的環(huán)酰胺鍵[39-40].根據(jù)其功能劃分，該酶可分為D-海因酶、L-海因酶、羧甲基海因酶、尿囊素酶等，其中，D-海因酶以5′-單取代海因或二氫尿嘧啶為底物，將之轉(zhuǎn)化為氨甲酰類氨基酸，最終生成D-氨基酸，是生產(chǎn)D-氨基酸的關(guān)鍵性酶[41].Tosa等通過加熱使DL-丙氨酸、氰酸鉀和水反應(yīng)生成N-氨甲?；?DL-丙氨酸，在氫氧化鉀的作用下環(huán)化形成DL-5-取代海因，經(jīng)海因酶催化產(chǎn)生氨甲酰基-D-丙氨酸，以重氮法去除氨甲?；@得D-丙氨酸[17].此法所得產(chǎn)物D-丙氨酸的光學(xué)活性較高，但反應(yīng)中所需的大量亞硝酸鹽對(duì)環(huán)境、設(shè)備及人員等危害較大.

2.3.2D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶法

D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(D-amino acid transaminase,DAAT,EC 2.6.1.21)也稱為D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，能可逆催化D-氨基酸(D-脯氨酸、D-纈氨酸、D-色氨酸、D-半胱氨酸和D-絲氨酸除外)與丙酮酸之間發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移從而產(chǎn)生D-丙氨酸[42-43].D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶普遍存在于微生物和植物中，在D-氨基酸的合成代謝和氨基轉(zhuǎn)移方面有重要作用.張衛(wèi)衛(wèi)等[19]利用天冬氨酸消旋酶催化L-天冬氨酸(50 g/L)形成DL-天冬氨酸，D-天冬氨酸經(jīng)D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶催化轉(zhuǎn)氨基生成D-丙氨酸(15.73 g/L)，產(chǎn)率約為31.5 %，對(duì)映體過量值(ee)為98 %.

2.3.3D-氨基酸脫氫酶法

D-氨基酸脫氫酶可以通過還原氨化反應(yīng)將酮酸和銨鹽轉(zhuǎn)化為D-氨基酸，然而，該酶在自然界中極為少見.Gao等[44]從嗜熱共生桿菌(Symbiobacteriumthermophilum)中得到了一個(gè)新型的meso-二氨基庚二酸脫氫酶(meso-diaminopimelate dehydrogenase,EC 1.4.1.16)，該酶是首個(gè)具有D-氨基酸脫氫酶催化功能的天然酶，能將底物丙酮酸胺化還原為D-丙氨酸，其比活力為2.87 U/mg，轉(zhuǎn)化率為68 %，ee值為99 %[45].隨后，Li等[46]將meso-二氨基庚二酸脫氫酶和甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase,FDH,EC 1.17.1.9)以共固定化的方式優(yōu)化其生物轉(zhuǎn)化條件，提高了雙酶的重復(fù)利用次數(shù)(反應(yīng)20批次后，D-丙氨酸的轉(zhuǎn)化效率為75.7 %).盡管此法所得D-丙氨酸轉(zhuǎn)化率稍低，但為酶法合成D-丙氨酸提供了新思路.

2.3.4 丙氨酸消旋酶法

丙氨酸消旋酶(alanine racemase,ALR,EC 5.1.1.1)是磷酸吡哆醛依賴性酶，可以催化L-丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)镈-丙氨酸，催化形成D-丙氨酸，該方法反應(yīng)條件溫和，且收率可高達(dá)95 %[47].

1997年，Galkin等[48-49]就介紹了采用4種酶聯(lián)合催化生成D-氨基酸的方法(圖4)：利用丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase,ALDH,EC 1.4.1.1)、ALR和DAAT偶聯(lián)將底物丙酮酸和氨逐步轉(zhuǎn)化為D-氨基酸，輔以甲酸脫氫酶(FDH)催化甲酸脫氫生成NADH，為丙氨酸脫氫酶提供輔因子NADH.這種多酶偶聯(lián)的方法既可滿足綠色生產(chǎn)的需求，又可較大限度降低生產(chǎn)成本，但由于微生物酶普遍催化活性低、穩(wěn)定性差，此方法沒有得到廣泛應(yīng)用.

圖4 酶偶聯(lián)法合成 D-氨基酸Fig.4 Synthesis of D-amino Acids by Coupling of Four Enzymes

本實(shí)驗(yàn)室前期從假堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(BacillusPseudofirmus)中獲得了一種具有較高催化活性的丙氨酸消旋酶，參照Galkin等[48-49]的研究思路，以葡萄糖脫氫酶替代甲酸脫氫酶參與輔因子NADH再生，構(gòu)建了葡萄糖脫氫酶、丙氨酸脫氫酶和丙氨酸消旋酶三基因共表達(dá)載體，經(jīng)優(yōu)化后，D/L-丙氨酸的產(chǎn)量分別為 51.9 g/L·d和56.4 g/L·d，可以看出，利用這種方法催化合成D-丙氨酸具有較高的合成效率[50].不過，由于反應(yīng)產(chǎn)物中L-丙氨酸和D-丙氨酸的性質(zhì)極為相似，將二者拆分從而獲得純凈單體的工藝路線較為復(fù)雜.

3 D-丙氨酸合成技術(shù)的展望

D-丙氨酸不僅在細(xì)菌細(xì)胞壁合成、孢子萌發(fā)方面有重要作用，在食品添加劑、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)也有著較大的應(yīng)用潛力.因此，開發(fā)一種高效、低成本的D-丙氨酸合成方法受到廣大科研工作者的關(guān)注.從表1可以看出，3種合成方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，不過，從可持續(xù)發(fā)展的理念來看，具有反應(yīng)條件溫和、低污染等優(yōu)點(diǎn)的生物酶法顯然具有更大的發(fā)展空間.特別是隨著近年來酶蛋白定向進(jìn)化技術(shù)的飛速發(fā)展，合理改造酶蛋白以滿足生產(chǎn)實(shí)際的需求正逐漸夢(mèng)想成真.

表1 D-丙氨酸合成技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)Tab.1 Advantages and Disadvantages of D-alanine Synthesis Technology

以丙氨酸消旋酶法為例，由于丙氨酸消旋酶的反應(yīng)平衡常數(shù)Keq(L/D)大都為1.0[51]，意味著該酶所參與的催化反應(yīng)為可逆平衡反應(yīng)，那么，如果能夠提高Keq(L/D)，必將打破反應(yīng)平衡從而使反應(yīng)向生成D-丙氨酸方向進(jìn)行.近期，本實(shí)驗(yàn)室通過定點(diǎn)突變技術(shù)分別獲得了Keq(L/D)為2.6和3.95的丙氨酸消旋酶突變體[52-53]，這說明通過定向進(jìn)化技術(shù)有望獲得反應(yīng)平衡常數(shù)大幅提升的突變體酶蛋白.目前，本實(shí)驗(yàn)室正以假堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌中具有較高催化活性的丙氨酸消旋酶為研究對(duì)象，以其活性中心周邊氨基酸位點(diǎn)為靶點(diǎn)，采用迭代飽和突變技術(shù)構(gòu)建突變體文庫，從中篩選Keq(L/D)顯著提升的突變體，為生物合成D-丙氨酸提供理想的酶蛋白.