樺樹汁發(fā)酵前后成分分析及護(hù)膚功效評價(jià)

譚淇丹 燕欣 胡鐘月 曹晨燦 劉蕾 何聰芬

關(guān)鍵詞：樺樹汁，發(fā)酵液，生物活性成分，抗氧化，抗糖化

樺樹（BetulaPlatyhylla）是一種主要分布于溫帶、寒溫帶地區(qū)的樺木科樺木屬森林植物，國內(nèi)主要分布在東北、西北以及西南山地區(qū)域，據(jù)統(tǒng)計(jì)，林地總占地面積接近500萬hm2[1]，資源相當(dāng)豐富。白樺樹是一種多年生植物，其光合作用會產(chǎn)生的大量營養(yǎng)物質(zhì)用于生長發(fā)育，剩余的部分以淀粉的形式留存在樹根，第二年春季轉(zhuǎn)暖，淀粉被轉(zhuǎn)化為糖，使得樹木根部負(fù)滲透壓力逐漸增高，進(jìn)而從泥土中吸收水分，并帶著糖以及其它植物營養(yǎng)物質(zhì)從樹的下方沿木質(zhì)部向樹的上方運(yùn)輸，此時(shí)樹皮被劃開或在樹身進(jìn)行鉆孔，會自然地流出呈無色或淡黃色的透明液體，具有獨(dú)特的木質(zhì)清香味[2]。如科學(xué)、有計(jì)劃地對樺樹汁進(jìn)行采集，不會對樺樹的正常生長有嚴(yán)重的損害影響[3]。我國國內(nèi)樺樹汁年產(chǎn)汁量約20t～60t/hm2[4]，應(yīng)用前景可觀。

樺樹汁中含有的豐富的天然蛋白質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，受生長習(xí)性和所處的生長條件差異性的影響，不同年齡和類型的白樺樹，其樹汁中所含的具體營養(yǎng)成分、理化性質(zhì)會有所不同，也與樹種、產(chǎn)地、收獲時(shí)間有關(guān)系[5]。相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)表明，樺樹汁除了含有糖類[6]、氨基酸[7]、脂肪酸、礦物質(zhì)以及一定量的維生素[8]等常見營養(yǎng)成分外，還含有淀粉酶系[9]過氧化物酶、酸性磷酸酯酶以及過氧化氫酶等活性成分，以及菸酸、香精油、樺芽酸、皂角甙化合物[10]赤霉素和細(xì)胞分裂素[11]等活性物質(zhì)，近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)樺樹汁的香味物質(zhì)包含70多種化合物[12]，也有學(xué)者對白樺汁發(fā)酵制酒過程的揮發(fā)性氣味成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)含有43種化合物[13]。

20世紀(jì)70年代初，美國、蘇聯(lián)等國家已經(jīng)利用樺樹汁為原料生產(chǎn)加工出一系列產(chǎn)品用于食品、保健品以及化妝品。我國則在20世紀(jì)80年代中期開始研究樺樹汁，主要用于生產(chǎn)樺樹汁飲料[14]、果醋[15]、酒[16，17]等產(chǎn)品，在日化用品方面的開發(fā)利用相對較少。

本實(shí)驗(yàn)以產(chǎn)自黑龍江伊春市的樺樹汁為原料，系統(tǒng)比較了其發(fā)酵先后總糖、總多酚、總蛋白、礦物質(zhì)元素、脂肪酸及氨基酸的含量，以雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)評價(jià)樺樹汁及其發(fā)酵液的眼刺激性，測定了樺樹汁及其發(fā)酵液對DPPH、ABTS、羥自由基的清除能力和非酶糖基化抑制能力，以評價(jià)其抗氧化、抗糖化的功效，為樺樹汁及發(fā)酵液作為化妝品原料發(fā)揮護(hù)膚功效提供了理論支持。

01實(shí)驗(yàn)部分

1.1原料、試劑與儀器

原料：樺樹汁及其發(fā)酵液由神樺國際生物醫(yī)藥科技（北京）有限公司提供，發(fā)酵液是樺樹汁經(jīng)由單歧桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、嗜熱鏈球菌革蘭氏陽性球菌4種菌混合發(fā)酵制成。

試劑：BCA蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林-酚試劑、苯酚、水楊酸、抗壞血酸，北京博奧拓科技有限公司；無水乙醇、硝酸、鹽酸、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、乙醚、石油醚、硝酸、高氯酸、KOH、NaNO2、Al（NO3）3、濃硫酸、ABTS，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨基酸混標(biāo)，和光純藥工業(yè)株式會社；正己烷，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氟化硼甲醇，CNW；37種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白，sigma；24種礦物質(zhì)元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，國家有色金屬及電子材料分析測試中心；精氨酸，上海味之素；H2O2、FeSO4·7H2O，北京化工廠；DPPH，京東化成工業(yè)株式會社；鹽酸氨基胍，上海源葉生物科技有限公司；過硫酸鉀，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1成分檢測

1.2.1.1總物質(zhì)含量測定

采用苯酚-硫酸法測定總糖含量；福林-酚法測定總多酚含量；依據(jù)碧云天生物公司BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行測定；使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）檢測礦物質(zhì)種類及含量；使用超高速全自動氨基酸分析儀測定氨基酸含量。

1.2.1.2脂肪酸組成分析

稱取樣品混勻加入燒瓶，加入100mg焦性沒食子酸、少量沸石、2mL95%乙醇、10mL鹽酸溶液，每步均須充分混勻，70～80℃水浴40min，注意每隔10min振蕩燒瓶。水解完成后，將燒瓶取出室溫冷卻后加入95%乙醇10mL，充分震蕩5min、靜置10min。將醚層提取液轉(zhuǎn)移至250mL燒瓶，重復(fù)水解、提取，將提取液收集至恒重的燒瓶中，水浴蒸干獲得脂肪提取物。在脂肪提取物中，繼續(xù)加入2%氫氧化鈉甲醇溶液2mL，85℃水浴30min，加入14%三氟化硼甲醇溶液3mL，85℃的溫水水浴鍋中繼續(xù)放置30min。水浴完成后，室溫冷卻，在離心管中加入1mL正己烷，萃取2min靜置分層1h。用正己烷將100μL上層清液定容到1mL，0.45μm濾膜過濾。以氣相色譜法法測定脂肪酸組成。

1.2.2安全性刺激性評價(jià)

1.2.2.1雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)（HET-CAM）

實(shí)驗(yàn)方法參照歐洲替代方法研究中心提出的化學(xué)品刺激性檢測雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)（DB-ALMProtocoln。96：HensEggTestontheChorioallantoicMembrane，HET-CAM）。取9日齡萊杭雞受精雞胚，用牙科鋸齒彎鑷剝?nèi)馐椅恢玫皻?，暴露白色蛋膜。每組至少6只雞胚，取受試物0.3mL直接滴加于絨毛尿囊膜表面，觀察3min內(nèi)血管變化情況，記錄下血管損傷程度。以0.9%的NaCl溶液為陰性對照，0.1mol/LNaOH為陽性對照。每個(gè)樣品做六組平行試驗(yàn)，根據(jù)雞胚觀察到的出血、凝血和血管融解程度進(jìn)行評分，并將各血管反應(yīng)分值相加，以總分值最高的血管反應(yīng)得分作為最終分值以該組中評分最高的值作為反應(yīng)ES值。ES＜6為無刺激性，6≤ES＜12為輕度刺激性，12≤ES＜15為中度刺激性，ES≥15為重度刺激性。

1.2.2.2皮膚封閉型斑貼實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法參照《GB/T17149.1-1997化妝品皮膚病診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則總則》與《GB/T17149.2-1997化妝品接觸性皮炎診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》，隨機(jī)選取30名18～60歲前臂無皮損健康志愿者進(jìn)行為期24h的斑貼實(shí)驗(yàn)。將受試物放入斑試器小室內(nèi)，用量約為0.020mL-0.025mL。將斑試器貼敷于受試者的前臂曲側(cè)，用手掌輕壓使之均勻地貼敷于皮膚上，持續(xù)24h。分別于去除受試物斑試器后30min（待壓痕消失后）、24h和48h觀察皮膚反應(yīng)，并記錄結(jié)果。

1.2.3抗氧化功效評價(jià)

1.2.3.1對DPPH自由基清除作用的測定

取750μL待測樣品與750μL無水乙醇混勻，記為1管；取750μL待測樣品與750μL2×104mol/LDPPH-乙醇溶液混勻，記為2管；取750μL2×104mol/LDPPH-乙醇溶液與750μL無水乙醇混勻，記為3管。避光反應(yīng)30min后，在517nm條件下分別測定1、2、3管的吸光度值，分別為A1、A2、A3。按公式計(jì)算：DPPH·清除率（%）=（1-（A2-A3）/A1）×100%

1.2.3.2ABTS自由基清除能力的測定

以等體積7.4mmol/L的ABTS溶液和2.6mmol/L的K2S2O8溶液等體積混合，于室溫避光條件下反應(yīng)12h，用pH=7.4PBS稀釋大約30倍使其OD734=0.7±0.02，獲得ABTS工作液。樣品組（A1）為0.2mL受試樣品和0.8mLABTS工作液，陽性組（A2）為0.2mL0.1%VC水溶液和0.8mLABTS工作液，空白組（A0）為0.2mL蒸餾水和0.8mLABTS工作液。以上各組混合靜置反應(yīng)6min后，檢測734nm的吸光度，按公式計(jì)算：ABTS·清除率（%）=（A1，2-A0）/A1，2×100%

1.2.3.3·OH自由基清除活性試驗(yàn)

按下表配置反應(yīng)液，其中陽性對照為0.01%VC水溶液，按公式計(jì)算：羥自由基清除率=[（A-C）-（B-D）]/（A-C）×100%

1.2.4體外抑制非酶糖基化功效評價(jià)

1.2.4.1試劑的準(zhǔn)備

取50mLPBS（pH=7.4），依次加入0.5gBSA，2.7g葡萄糖，溶解制成反應(yīng)液；以PBS為溶劑配置2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%共5個(gè)濃度的鹽酸氨基胍溶液，作為陽性對照。按表2配制各管試劑，置于37℃避光恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)孵育7天，然后在激發(fā)波長370nm、發(fā)射波長440nm熒光條件下進(jìn)行檢測。每個(gè)試驗(yàn)樣本及其對照做6組平行，以每組平均值作為試驗(yàn)最終結(jié)果。按公式計(jì)算：抑制率I=［1－（A1－A2）/A0］×100%

02結(jié)果與討論

2.1樺樹汁及發(fā)酵液營養(yǎng)成分

2.1.1樺樹汁及發(fā)酵液的總糖、總多酚、總蛋白含量對比

由表2.1可知，樺樹汁經(jīng)發(fā)酵后，總糖約上升4倍，總多酚約下降7倍，總蛋白約下降5倍。由此可以看出，丹麥的單歧桿菌、保加利亞雙歧桿菌、荷蘭的乳酸桿菌、法國的嗜熱鏈球菌四種菌混合發(fā)酵可以顯著提高樺樹汁中總糖含量，降低總蛋白與多酚含量。

2.1.2礦物質(zhì)種類及含量分析結(jié)果

由表2.2可知，樺樹汁中檢測到16種元素，發(fā)酵液中檢測到15種元素，如Ca、K、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、Na等元素。

2.1.3氨基酸種類及含量分析

使用氨基酸自動分析儀檢測到白樺樹汁及其發(fā)酵液中各種游離氨基酸的含量結(jié)果如表2.3所示。樺樹汁中存在11種游離氨基酸，其中5種為人體必需氨基酸。發(fā)酵后含有的游離氨基酸種類減少為6種，必需氨基酸僅存賴氨酸1種。值得注意的一點(diǎn)是樺樹汁中谷氨酸含量高達(dá)220mg/L，占游離氨基酸總量的88.31%。

2.1.4脂肪酸成分分析

樺樹汁中共檢測到12種脂肪酸，其中飽和脂肪酸含量為45.38%，不飽和脂肪酸含量為54.62%，單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量分別為16.67%和37.95%，樺樹汁中的不飽和脂肪酸包括5種分別是：花生四烯酸（n-6）、油酸、亞油酸（n-6）、棕櫚油酸、順-11-二十碳烯酸。

樺樹汁發(fā)酵液中共檢測到14種脂肪酸，其中飽和脂肪酸含量為56.91%，不飽和脂肪酸含量為43.09%，單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量分別為16.16%和26.93%，樺樹汁發(fā)酵液中的不飽和脂肪酸也包括5種，與樺樹汁中的種類一致。

樺樹汁發(fā)酵前后所含脂肪酸種類無顯著差異。

2.2安全及刺激性評價(jià)

2.2.1安全性評價(jià)

使用調(diào)節(jié)pH至接近中性的樺樹汁（BL）及其發(fā)酵液（BF）對30名志愿者進(jìn)行斑貼實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2.4所示，樺樹汁及其發(fā)酵液均對3名受試者有可疑反應(yīng)，但24h后均恢復(fù)正常。

2.2.2刺激性評價(jià)

對陰性對照（0.9%氯化鈉）、陽性對照（0.1mol/L氫氧化鈉）、樺樹汁及樺樹汁發(fā)酵液加樣前后的雞胚絨毛尿囊膜進(jìn)行形態(tài)學(xué)（圖2.1）觀察和打分。得分如表2.4所示，可知兩種樣品均無眼刺激性。

2.3自由基清除活性

DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基是相對來說比較穩(wěn)定的自由基，通過對化妝品原料清除以上各類自由基的情況進(jìn)行綜合分析，可用來評價(jià)所用化妝品原料的抗氧化能力。

樺樹汁及其發(fā)酵液的DPPH、ABTS、·OH自由基清除能力分析結(jié)果如圖2.2、2.3、2.4所示，圖中的紅色標(biāo)注為各樣品對相應(yīng)自由基清除能力的IC50值。

由圖中可以看出：①DPPH清除活性：不同濃度下，0.01%VC＞BL＞BF，BL可達(dá)69.82%，BF僅達(dá)37.77%，；②ABTS清除活性：濃度低于50%時(shí)，BL＞0.01%VC＞BF，高于50%時(shí)，清除活性差別不大，其中BL濃度6.25%時(shí)，清除率達(dá)到90%以上；③·OH清除活性：不同濃度下BF＞BL＞0.1%VC。BL與BF對3種自由基的清除活性在濃度0～100%時(shí)，均呈現(xiàn)劑量依賴性。綜合結(jié)果表明，樺樹汁及其發(fā)酵液均對ABTS、羥自由基的清除活性較強(qiáng)，具有一定的抗氧化能力。

試驗(yàn)建立了牛血清白蛋白-葡萄糖（BSA-Glucose）體系模擬美拉德反應(yīng)來評價(jià)待測樣品的抗糖化功效，樺樹汁、發(fā)酵液及陽性對照（氨基胍）的抗糖化能力測定結(jié)果如圖4.4所示。

由圖2.5可以看出，添加不同濃度的氨基胍、BL及BF均對BSA-Glucose體系A(chǔ)GEs生成有較高的抑制能力，在70%～95%之間，添加濃度在50%以上時(shí)，陽性對照與兩種樣品的AGEs抑制能力沒有較大差別，在添加濃度為6.25%～50%時(shí)，AGEs抑制能力：BL>鹽酸氨基胍>BF，但無顯著差異。結(jié)果表明，BL、BF均具有較強(qiáng)的抗糖化效果。

03結(jié)論

本文結(jié)果表明，樺樹汁及發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)種類豐富，富含氨基酸、脂肪酸、總多酚、總糖等物質(zhì)以及有機(jī)酸及其衍生物，還含有一些苯丙素聚酮類物質(zhì)以及木質(zhì)素等生理活性物；樺樹汁及發(fā)酵液對人體皮膚安全且無刺激性，且體外生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明具有一定的自由基清除能力和較好的抗糖化功效，是一種具有開發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值的化妝品原料。