槲皮素、白藜蘆醇、維生素E抗衰功效研究

薛文斌 盧正君 董長青

目的：研究三種原料槲皮素、白藜蘆醇、維生素E化妝品抗衰功效上的應(yīng)用。方法：DPPH自由基清除實驗檢測槲皮素、白藜蘆醇、維生素E的抗氧化能力。MTT法檢測槲皮素、白藜蘆醇、維生素E對人真皮成纖維細(xì)胞（HDF）的毒性；選擇無毒性濃度進行抗衰測試，通過高糖培養(yǎng)HDF構(gòu)建細(xì)胞衰老模型，β-半乳糖苷酶染色檢測細(xì)胞衰老情況。結(jié)果：槲皮素、白藜蘆醇、維生素E都具有清除DPPH的能力，且呈劑量依賴性。MTT結(jié)果顯示槲皮素、白藜蘆醇均在0.556mg/mL濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞無毒性，維生素E在1.667mg/mL濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞無毒性；β-半乳糖苷酶染色顯示，槲皮素、白藜蘆醇、維生素E均能減少誘導(dǎo)衰老細(xì)胞的染色面積。結(jié)論槲皮素、白藜蘆醇、維生素E能夠清除自由基抗氧化，抑制細(xì)胞衰老，可在化妝品抗衰功效上有一定的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：槲皮素；白藜蘆醇；維生素E；抗衰；HDF細(xì)胞；β-半乳糖苷酶

延緩皮膚衰老一直是化妝品研究領(lǐng)域的熱點，從生物學(xué)上講，細(xì)胞具有有限的分裂傾向，細(xì)胞每次分裂，染色體端粒都會縮短，縮短到一定程度則觸發(fā)DNA損傷，細(xì)胞就會進入生長停滯期，無法繼續(xù)增殖[1]。這一過程不可逆，稱為自然衰老。然而，除了自然衰老外，還有各種外在因素會加速皮膚衰老，比如光老化，化學(xué)物刺激，環(huán)境影響等，這些外在因素也是化妝品抗衰開發(fā)的重點方向。英國的Harman于1956年提出自由基學(xué)說，指出自由基大量、過多的積累，會產(chǎn)生氧化應(yīng)激，損傷細(xì)胞核及線粒體DNA，導(dǎo)致生物膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)交聯(lián)變性等，最終引起細(xì)胞損傷[2]，加速細(xì)胞衰老。

近年來，天然植物提取物的抗衰功效越來越受到人們的關(guān)注。槲皮素（Quercetin），存在于許多植物的花、葉、果實中，常取自豆科植物槐的干燥花蕾，多以苷的形式存在，如蘆?。ㄊ|香苷）、槲皮苷、金絲桃苷等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有很強的抗氧化能力，能夠抵抗多種自由基[4]，此外槲皮素還能促進人成纖維細(xì)胞增殖，提高人成纖維細(xì)胞透明質(zhì)酸和膠原蛋白含量[5]。白藜蘆醇（Resveratrol），一種植物多酚，廣泛存在于自然界中，虎杖、藜蘆、葡萄、花生、鳳梨等植物或水果中都含有白藜蘆醇。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷具有保護作用，可提升H2O2處理后HaCaT細(xì)胞SOD和GSH-Px活性[6]。白藜蘆醇還能降低人皮膚成纖維細(xì)胞UVB照射后基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1活性，并減少細(xì)胞凋亡率[7]。另外，白藜蘆醇還具有很強的抗炎作用，可顯著降低大鼠炎癥模型各種炎癥指標(biāo)[8]。維生素E（VE），又名生育酚或產(chǎn)妊酚，是最早發(fā)現(xiàn)的維生素之一，在食油、水果、蔬菜及糧食中均存在。天然VE是一種強有效的抗氧化劑[9]，研究發(fā)現(xiàn)，VE能夠?qū)2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷起到保護作用[10]。還能對UVA誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞光損傷起到防護作用，提高UVA照射后I型和Ⅲ型膠原蛋白的表達[11]。關(guān)于化妝品抗衰的研究目前主要集中在抗氧化以及提高膠原蛋白含量上，對于化妝品是否可以從整體上抑制細(xì)胞衰老的研究較少，本研究通過DPPH自由基清除實驗結(jié)合β-半乳糖苷酶細(xì)胞染色實驗來探討槲皮素、白藜蘆醇、VE三種原料在化妝品抗衰功效上的應(yīng)用。

01實驗材料

1.1受試樣品

槲皮素購自Indena、白藜蘆醇購自Symrise、VE購自DSMNutritionalProductsChina，人真皮成纖維細(xì)胞購自廣東博溪生物科技有限公司；DMEM低糖培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗、胰蛋白酶購自Gibco；臺盼藍購自Thermo；MTT購自Biosharp；二甲基亞砜（DMSO）購自Admas-Beta；β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

1.2儀器設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱（上海博迅，BC-J160）、生物安全柜（上海尚道，BHC-1300ⅡA2）、酶標(biāo)儀（TECAN，InfiniteF50），離心機（湖南湘儀，H1850R）、細(xì)胞計數(shù)儀（Thermo，CountessⅢ）、倒置顯微鏡（奧林巴斯，CKX53）、水浴鍋（江陰市保利科研器械有限公司，BHS-4）、—80℃超低溫冰箱（澳柯瑪，DW-86L290）。

02實驗方法

2.1DPPH自由基清除實驗

DPPH在517nm附近有強吸收，當(dāng)有自由基清除劑存在時，DPPH自由基被部分清除，最大吸收波長處的吸光度會減小，由此可評價實驗樣品清除自由基的能力，即抗氧化活性大小。本實驗三個原料分別進行5個濃度DPPH清除實驗，將槲皮素、白藜蘆醇、VE按濃度0.08mg/mL、0.04mg/mL、0.02mg/mL、0.01mg/mL、0.005mg/mL進行溶液配制。再配制0.12mg/mL的DPPH乙醇溶液。配制完成后，按反應(yīng)表格加樣，輕輕搖勻，室溫下避光靜置反應(yīng)5分鐘，在酶標(biāo)儀517nm附近測定吸光值；后室溫避光靜置反應(yīng)24h，再次在517nm附近測定吸光值。加樣要求具體見表1。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

人真皮成纖維細(xì)胞以每瓶2.0×106個細(xì)胞接種于T75培養(yǎng)瓶中，低糖DMEM（含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d。待細(xì)胞融合率為80%～90%時進行傳代，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心吹打混勻，傳代培養(yǎng)，以每瓶2.0×106個細(xì)胞接種于T75培養(yǎng)瓶中，3d傳一次代。

2.3實驗分組

細(xì)胞毒性檢測設(shè)置空白對照、陰性對照、樣品及陽性對照；β-半乳糖苷酶染色實驗設(shè)置陰性對照和樣品。

2.4細(xì)胞實驗樣品處理

槲皮素稱取0.5g，用乙醇定容至總體積為5mL，制成濃度為100mg/mL的溶液。給藥時將上述溶液200μl加入到3.8mL低糖DMEM（含10%胎牛血清）中，20μm過濾膜過濾除菌，制成含槲皮素為5mg/mL的培養(yǎng)基溶液，再以3倍稀釋，制成含槲皮素濃度為1.667mg/mL、0.556mg/mL、0.185mg/mL、0.062mg/mL、0.021mg/mL、0.007mg/mL、0.002mg/mL的培養(yǎng)基溶液。白藜蘆醇、維生素E處理同上，以上樣品現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.5細(xì)胞毒性檢測

人真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)后，用胰酶消化，離心吹打混勻，計數(shù)，按每100μl/孔含4.0×104個細(xì)胞鋪于96孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。24h后小心吸棄每孔培養(yǎng)基，加入含不同濃度待測物的培養(yǎng)基，共8個濃度，每個濃度3個復(fù)孔，繼續(xù)放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h。20h后每孔加入5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h。4h后小心吸棄每孔上清，加入150μL/孔的DMSO吹打至充分混勻，室溫避光放置30min。用移液器將細(xì)胞懸液再次吸打混勻，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD492nm處測量各孔的吸光值（OD值）。

2.6細(xì)胞毒性計算

細(xì)胞相對活率%=（樣本OD-空白OD）/（陰性對照OD-空白OD）*100%

2.7β-半乳糖苷酶細(xì)胞染色

人真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)后，胰酶消化，離心棄上清，重懸吹打混勻，計數(shù)，使用高糖DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。細(xì)胞按2×104個細(xì)胞/孔接種到96孔板，每孔100μL，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6d。培養(yǎng)6d后，吸棄96孔板中的培養(yǎng)基，按照MTT毒性結(jié)果，選擇無毒性樣品濃度進行給藥，受試物孔中加入含有受試物的培養(yǎng)基，陰性對照孔中加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔100μL。給藥完畢后將96孔板放置在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4d。培養(yǎng)4d后，按照β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明進行細(xì)胞染色，表達SA-β-gal的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，呈現(xiàn)藍綠色。

2.8統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用Excel及GraphPadPrism8進行數(shù)據(jù)分析及作圖處理。

03實驗結(jié)果

3.1DPPH自由基清除

DPPH自由基清除實驗結(jié)果顯示槲皮素和VE的清除能力都很強，在0.08mg/mL的濃度下，避光反應(yīng)5min后，DPPH清除率都能達到75%以上，而白藜蘆醇0.08mg/mL初始的清除率并不高，避光反應(yīng)5min后，DPPH清除率在55%左右。

當(dāng)把反應(yīng)體系放置室溫避光反應(yīng)24h后再進行測定，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇所有濃度的DPPH清除率都有明顯提高，而槲皮素和VE的清除率變化沒有白藜蘆明顯，說明白藜蘆醇清除自由基的能力是緩慢的、持續(xù)的。

從趨勢圖可以看出三者DPPH自由基清除能力都具有劑量依賴性。DPPH清除率趨勢見圖1。

3.2細(xì)胞毒性結(jié)果

本實驗視MTT結(jié)果中細(xì)胞相對活率90%以上為無毒性標(biāo)準(zhǔn)，槲皮素、白藜蘆醇均在0.556mg/ml濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞無毒性，VE在1.667mg/mL濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞無毒性。具體見表2。

3.3β-半乳糖苷酶細(xì)胞染色結(jié)果

染色結(jié)果顯示，經(jīng)過高糖DMEM配合延長培養(yǎng)時間的誘導(dǎo)，陰性對照細(xì)胞大量衰老，顯示出β-半乳糖苷酶活性，被大面積染成藍綠色；槲皮素濃度在0.556mg/mL對細(xì)胞衰老沒有明顯抑制作用，而在0.185mg/mL時體現(xiàn)出抑制作用，在0.062mg/ml時，抑制作用又有所降低；白藜蘆醇濃度在0.556mg/mL、0.185mg/mL、0.062mg/mL，VE濃度在1.667mg/mL、0.556mg/mL、0.185mg/mL對細(xì)胞衰老均有抑制作用，且高濃度抑制效果更明顯。細(xì)胞染色結(jié)果見圖2。

04結(jié)論

抗衰一直是化妝品行業(yè)研究的重點對象，尋找具有抗衰功效的原料成為研究的熱點，純天然植物提取物因其毒性小、安全性高而更受消費者青睞。本研究選取了三種植物提取物抗衰原料，通過DPPH自由基清除實驗和β-半乳糖苷酶細(xì)胞染色實驗來探討它們在化妝品抗衰功效上的應(yīng)用。本次實驗發(fā)現(xiàn)，槲皮素和VE的抗氧化能力都很強，在0.08mg/mL的濃度下，反應(yīng)5min，DPPH清除率都能達到75%以上，但是在細(xì)胞實驗中，槲皮素的高濃度卻沒有體現(xiàn)出明顯的抗衰功效。實際上，細(xì)胞衰老是一個十分復(fù)雜的過程，不同原料對皮膚抗衰的機制也是不同的，抗氧化只是抗衰老的一種途徑，但不是惟一的途徑，而且抗氧化劑之間的平衡也是一個不可忽視的問題[12]。另外，作用于細(xì)胞的藥物濃度，并不是越高越好，一個最佳的使用濃度，還需要經(jīng)過反復(fù)的實驗來驗證。本研究初步探討了槲皮素、白藜蘆醇、維生素E三種原料抗氧化和抑制細(xì)胞衰老的作用，發(fā)現(xiàn)它們都能夠抗氧化和抑制細(xì)胞衰老，可作為抗衰化妝品配方及產(chǎn)品開發(fā)可考慮的原料，并對其功效添加濃度有一定的參考意義。