羥丙基四氫吡喃三醇的體外緊致、抗皺功效評價

朱志賢 張家蓉 陳國寶 陳保華

關(guān)鍵詞：羥丙基四氫吡喃三醇；膠原纖維；肌彈力蛋白；透明質(zhì)酸

羥丙基四氫吡喃三醇是LOREAL具有抗皺緊致功效的專利化妝品原料Pro-XylaneTM（玻色因）中的核心成分。它是由木糖與乙酰丙酮在堿性條件下衍生合成得到1-C-（β-D-吡喃木糖基）-丙酮，后經(jīng)硼氫化鈉或其他方式進行氫化還原得到1-C-（β-D-吡喃木糖基）-2-羥基－丙烷，即羥丙基四氫吡喃三醇[1]。羥丙基四氫吡喃三醇可以促進皮膚中糖胺聚糖（GAGs）和蛋白多糖（PGs）的生成[1，2]。

GAGs和PGs是皮膚和表皮細胞外基質(zhì)的主要成分，可幫助肌膚緊鎖水分，減少水分流失，且賦予皮膚主要的功能特性，如彈性和張力[3]。隨著氧化、光照損傷以及年齡增長，皮膚的力學(xué)性能不斷惡化，導(dǎo)致皮膚自然老化，這與皮膚中的GAGs生物合成減少有關(guān)。由日光照射引起的皮膚老化稱為光老化，典型的臨床表現(xiàn)為皺紋、皮膚松弛、毛細血管擴張、皮膚色素不均勻等。而羥丙基四氫吡喃三醇這一活性成分，有助于皮膚中GAGs的更新，從而利于維持皮膚基質(zhì)結(jié)構(gòu)和平衡皮膚的水分含量，此外，還可以起到恢復(fù)真皮層中損失的PGs的作用，對有缺陷的皮膚、表皮連接處產(chǎn)生有益的影響[2]。

本研究使用UVR輻照皮膚損傷模型，即采用UVR輻照Exvivo離體皮膚組織，致使組織結(jié)構(gòu)受損[4]，膠原蛋白、彈力蛋白、透明質(zhì)酸含量下降后，使用羥丙基四氫吡喃三醇進行給藥處理，通過檢測離體皮膚的組織形態(tài)、膠原纖維的含量變化，以及皮膚組織的彈力蛋白和透明質(zhì)酸（HA）含量的變化[5]，評價羥丙基四氫吡喃三醇對皮膚的抗皺和緊致功效。

01測試材料

1.1實驗?zāi)Ｐ?/p>

本測試實驗所用離體皮膚組織來自廣東博溪生物科技有限公司，皮膚來源為23歲女性腹部皮膚。

1.2主要試劑

離體皮膚組織培養(yǎng)液（FSK4，博溪生物）；維生素C（VC，Sigma，分析純批號A7506）；維生素E（VE，Sigma，分析純批號238813）；多聚甲醛（國藥，分析純批號P0018）；磷酸鹽緩沖液（PBS博士德、PYG14190）；MTT試劑（SigmaM5655）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma，分析純批號D4540-1L）；二甲苯（國藥，分析純批號10023418）、蘇木精（碧云天，HPLC>99%批號C0107）、伊紅染色液（碧云天，批號C01055）。

1.3主要設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱（Thermo，150i）；超凈工作臺（蘇州安泰，SW-CJ-1F）；正置顯微鏡（Olympus，BX53）。

1.4供試樣品

羥丙基四氫吡喃三醇，98%，來自甘肅泛植制藥有限公司。

02實驗方法

2.1測試方案

按照測試方案（表1）配置樣品工作液。

2.2組織預(yù)處理

將新鮮獲得的23歲女性的腹部皮膚浸入75%酒精中，清洗30s，再使用無菌的PBS緩沖液清洗三次，結(jié)束后，用一次性無菌皮膚取樣器將皮膚組織切成直徑為0.6cm的小圓片，表皮面向上，真皮面向下，放入培養(yǎng)模具中，然后將培養(yǎng)模具轉(zhuǎn)入6孔板中，每孔加入3.7mL培養(yǎng)液，在37℃，5%（V/V）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液[6]。

2.3UVR輻照及給藥

將準(zhǔn)備好的離體皮膚組織培養(yǎng)48h后，參照表1中的試驗分組及相應(yīng)條件處理，開始進行UVR輻照和給藥。即依次按序?qū)㈥幮詫φ眨∟C）、陽性對照（PC）、供試樣品組在UVR照射劑量為UVA（30J/cm2）和UVB（50mJ/cm2）進行輻照處理，輻照時間每次約30min，且每次輻照完后更換新鮮培養(yǎng)液，并進行一次給藥處理。并于37℃、5%CO2（V/V）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，并設(shè)計空白對照（BC）實驗。其中，陽性對照（VC+VE）和供試樣品組分別采用液下給藥和表面給藥的方式進行。上述操作重復(fù)4次后，將離體皮膚組織繼續(xù)培養(yǎng)3天，期間每24h更換一次新鮮培養(yǎng)液，同時進行一次給藥。

2.4組織形態(tài)和膠原纖維的觀測

給藥結(jié)束后的皮膚組織采用40mg/mL多聚甲醛固定模型，組織包埋，切片后分別進行H&E染色、Masson染色，回收切片結(jié)果，使用顯微鏡拍照，使用Image-Pro?Plus圖像處理軟件進行分析[7]。

2.5彈力蛋白檢測

彈性蛋白是一種主要細胞外基質(zhì)蛋白，具有延展性和彈性回縮特性，與皮膚緊致感以及皺紋產(chǎn)生有關(guān)[8]。根據(jù)免疫組織化學(xué)具體操作步驟進行檢測[9]。

2.6HA檢測

取用于免疫熒光檢測的模型，用40mg/mL的多聚甲醛進行固定處理，固定24h后，進行HA免疫熒光檢測，顯微鏡下拍照觀察，采集圖片并分析[10]。

2.7結(jié)果統(tǒng)計分析

應(yīng)用GraphPadPrism作圖，結(jié)果表示為Mean±SD。各組間比較采用t-test統(tǒng)計分析，統(tǒng)計分析均為雙尾（P<0.05認為具有顯著差異，P<0.01認為具有極顯著差異）。

03實驗結(jié)果與討論

3.1組織活力實驗結(jié)果

經(jīng)UVR輻照離體皮膚組織損傷實驗，其組織活力測試結(jié)果如表2所示。

實驗數(shù)據(jù)表明，與BC組相比，NC組表皮活細胞層明顯變薄，真皮層細胞密度降低，說明本次測試刺激條件有效；與NC組相比，PC組表皮活細胞層明顯增厚，真皮層細胞密度增加，說明本次陽性對照檢測有效；與NC組相比，供試樣品組的表皮活細胞層明顯增厚，組織形態(tài)明顯改善，且其改善效果要優(yōu)于PC組（100μg/mLVC和7μg/mLVE混合樣品處理）。故實驗結(jié)果表明，30mg/mL的羥丙基四氫吡喃三醇能改善受損皮膚的組織形態(tài)，且效果良好。

3.2膠原纖維實驗結(jié)果

經(jīng)UVR輻照離體皮膚組織損傷實驗，其膠原纖維測試結(jié)果、膠原纖維相對面積匯總和膠原纖維相對面積均值結(jié)果分別如表3、表4和圖1所示。

實驗數(shù)據(jù)表明，與BC組相比，NC組的膠原纖維含量顯著降低，說明本次測試刺激條件有效；與NC組相比，PC組的膠原纖維含量顯著升高，提升率172.22%，說明本次測試陽性對照有效；與NC組相比，供試樣品組的膠原纖維含量顯著升高，提升率為394.44%，且優(yōu)于PC組（PC組是100μg/mLVC和7μg/mLVE混合樣品處理）。故實驗結(jié)果表明30mg/mL的羥丙基四氫吡喃三醇能有效提升受損皮膚的膠原纖維含量，且效果優(yōu)良。

3.3彈力蛋白實驗結(jié)果

經(jīng)UVR輻照離體皮膚組織損傷實驗，其彈力蛋白測試結(jié)果、彈力蛋白相對面積平均值匯總、彈力蛋白積分光密度（IOD）值分別如表5、表6、圖2所示。

實驗數(shù)據(jù)表明，與BC組相比，NC組的彈力蛋白含量顯著降低，說明本次測試刺激條件有效；與NC組相比，PC組的彈力蛋白含量升高280%，說明本次測試陽性對照有效；與NC組相比，供試樣品組的彈力蛋白含量顯著上升，提升率為386.67%，且優(yōu)于PC組（PC組是100μg/mLVC和7μg/mLVE混合樣品處理）。故實驗結(jié)果表明30mg/mL的羥丙基四氫吡喃三醇能有效提高受損皮膚的彈力蛋白含量，且效果明顯。

3.4透明質(zhì)酸實驗結(jié)果

經(jīng)UVR輻照Exvivo離體皮膚組織損傷實驗，其透明質(zhì)酸（HA）測試結(jié)果、HA積分光密度（IOD）值、HA積分光密度（IOD）值分別如表7、表8、圖3所示。

實驗數(shù)據(jù)表明，與BC組相比，NC組的HA含量顯著下降，說明本次測試刺激條件有效；與NC組相比，PC組的HA含量顯著上升，提升率147.5%，說明本次陽性對照檢測有效；與NC組相比，供試樣品組的HA含量顯著上升，提升率為62.50%。故實驗結(jié)果表明30mg/mL的羥丙基四氫吡喃三醇能有效提高受損皮膚中的透明質(zhì)酸的含量。

04結(jié)論

本實驗基于UVR輻照Exvivo離體皮膚組織，通過供試樣品羥丙基四氫吡喃三醇30mg/mL表面給藥的作用下，受損表皮活細胞層有所增厚，組織形態(tài)改善明顯，且膠原纖維含量顯著升高（提升率為394.44%），彈力蛋白含量顯著上升（提升率為386.67%），透明質(zhì)酸（HA）含量顯著上升（提升率為62.5%）。實驗表明羥丙基四氫吡喃三醇可通過改善組織形態(tài)和提升膠原纖維含量，以及通過提升彈力蛋白和透明質(zhì)酸（HA）含量，實現(xiàn)對皮膚的抗皺、緊致功效，在化妝品中有良好的應(yīng)用前景。