松天牛小首螨對(duì)極端溫度耐受性的馴化效應(yīng)及低溫存儲(chǔ)研究

朱禹臻， 黃晨燕， 李俊楠， 付 煜， 吳松青， 張飛萍*

1福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院,福建 福州 350002; 2福建農(nóng)林大學(xué),生態(tài)公益林重大有害生物防控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350002

松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus(Steiner Buhrer) Nickle病是松樹的毀滅性病害，已在我國造成巨大危害。松墨天牛MonochamusalternatusHope是松材線蟲病的主要傳播媒介，防治松墨天牛是遏制松材線蟲病擴(kuò)散蔓延的關(guān)鍵措施之一(宋紅敏和徐汝梅，2006； 朱誠棋等，2017)。松天牛小首螨ParacarophenaxalternatusXu and Zhang是近年在福建閩侯首次發(fā)現(xiàn)的小首螨新種，也是首個(gè)能寄生并致死松墨天牛卵的天敵螨類，極具生物防治應(yīng)用潛力(Xuetal.，2018)。然而，目前對(duì)該螨的研究甚少。

研究證明，通過特定時(shí)間、特定非致死溫度條件下的飼養(yǎng)馴化，昆蟲或螨類往往可以顯著提高其對(duì)極端溫度的耐受性，表現(xiàn)出顯著的馴化效應(yīng)(景曉紅和康樂，2002； 李永濤等，2016； 岳雷等，2013)。明確天敵昆蟲或螨類對(duì)極端溫度耐受性的馴化效應(yīng)，有助于深入了解其地理分布、使用區(qū)域、季節(jié)適應(yīng)性，建立科學(xué)的應(yīng)用方法。鑒于此，本研究測定了不同溫度條件馴化下松天牛小首螨對(duì)極端溫度的耐受性及其變化，以及不同低溫條件下的生存時(shí)間，以期為利用該螨防治松墨天牛提供基礎(chǔ)性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

松天牛小首螨來源于實(shí)驗(yàn)室建立的實(shí)驗(yàn)種群，以松墨天牛卵為寄主進(jìn)行繁育和保種，飼養(yǎng)條件為26 ℃、RH60%、12D∶12L。松墨天牛卵采于松樹木段。

1.2 高溫馴化試驗(yàn)

松天牛小首螨屬于膨腹體胎生類，若螨在膨腹體中發(fā)育至成熟，僅見成螨階段活動(dòng)。該螨種群中雄螨的數(shù)量極少。本研究選擇雌成螨為研究對(duì)象，將雌成螨進(jìn)行高溫馴化鍛煉，再進(jìn)行極端高溫暴露處理。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，馴化高溫設(shè)置30、33、37 ℃ 3個(gè)溫度梯度，以25 ℃未經(jīng)馴化處理為對(duì)照；馴化時(shí)間設(shè)置12、24、36、48、60 h 5個(gè)時(shí)間梯度；極端高溫暴露條件為42 ℃3 h。溫度由人工氣候箱控制。

高溫馴化處理后，將各組試螨隨機(jī)進(jìn)行高溫暴露脅迫，然后直接放入25 ℃、RH60%的人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)24 h，然后在體式顯微鏡下統(tǒng)計(jì)各處理的存活率。以螨體色澤鮮艷、體型飽滿，用毛筆輕觸第一對(duì)足有行為反應(yīng)視為存活，以蟲體無光澤、干癟，毛筆觸動(dòng)無反應(yīng)視為死亡。每處理均設(shè)5組重復(fù)，每組試螨30頭，放置于2 mL透明離心管內(nèi)并蓋緊。

1.3 低溫馴化試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，馴化低溫設(shè)置10、15、20 ℃3個(gè)溫度梯度，以25 ℃未經(jīng)馴化處理為對(duì)照；馴化時(shí)間設(shè)置24、48、72、96、120 h 5個(gè)時(shí)間梯度；極端低溫暴露條件為-10 ℃3 h。馴化溫度由人工氣候箱控制，脅迫低溫條件由低溫恒溫槽控制。其余試驗(yàn)方法與1.2相同。

1.4 低溫存儲(chǔ)試驗(yàn)

1.4.1 低溫存儲(chǔ)對(duì)松天牛小首螨膨腹體涌出成螨數(shù)量的影響 以松天牛小首螨膨腹體作為存儲(chǔ)對(duì)象。存儲(chǔ)溫度設(shè)置0、5、10 ℃3個(gè)處理，存儲(chǔ)時(shí)間設(shè)置5、10、15、20、25、30 d 6個(gè)處理，溫度由海爾牌調(diào)溫冰箱控制。以寄生在松墨天牛卵上的松天牛小首螨膨腹體發(fā)育至第3天的天牛卵為測試對(duì)象，將5粒上述松墨天牛卵設(shè)為一組，放置于直徑5 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，皿壁涂凡士林以防涌出的成螨逃逸。將上述培養(yǎng)皿分別放置到不同溫度的冰箱中存儲(chǔ)，按照設(shè)定的存儲(chǔ)時(shí)間處理完成后，取出培養(yǎng)皿并放入25 ℃、RH60%的人工氣候箱中恢復(fù)和培養(yǎng)，連續(xù)觀察6 d并記錄膨腹體發(fā)育情況，統(tǒng)計(jì)涌出的成螨數(shù)量(該條件下松天牛小首螨膨腹體發(fā)育歷期不長于4 d)。

1.4.2 低溫存儲(chǔ)對(duì)松天牛小首螨雌成螨存活的影響 以松天牛小首螨雌成螨為存儲(chǔ)對(duì)象。存儲(chǔ)溫度設(shè)置4、10 ℃ 2個(gè)處理，用調(diào)溫冰箱控制溫度。存儲(chǔ)時(shí)間設(shè)置5、10、15、20、25、30 d 6個(gè)處理。將30～40頭從膨腹體涌出24 h內(nèi)的松天牛小首螨雌成螨設(shè)為一個(gè)處理組，放入一個(gè)2 mL透明離心管中，管口塞入濕棉花保濕并蓋緊，然后分別放入不同溫度冰箱中存儲(chǔ)。后按照設(shè)定的存儲(chǔ)時(shí)間處理完成后，取出離心管放入25 ℃、RH60%的人工氣候箱中恢復(fù)24 h，在體式顯微鏡下觀察并記錄雌成螨存活情況。對(duì)照組設(shè)置為25 ℃，由人工氣候箱控制溫度。每處理設(shè)3重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用方差分析(ANOVE)比較馴化后極端溫度暴露存活率，用LSD法比較平均數(shù)，用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用GraphPad Prism8軟件制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫馴化對(duì)松天牛小首螨極端高溫耐受性的影響

方差分析結(jié)果表明，馴化溫度和馴化時(shí)間均對(duì)松天牛小首螨雌成螨高溫暴露存活率存在顯著影響(馴化溫度：F=15.627；df=2，30；P<0.05；馴化時(shí)間：F=19.116；df=4，30；P<0.05)，但馴化溫度、馴化時(shí)間二者的交互作用未見顯著影響(F=0.921；df=8，30；P>0.05)。由圖1可知，與對(duì)照相比，經(jīng)過馴化的雌成螨在高溫暴露脅迫后的存活率均顯著提高，其中30 ℃馴化36 h的存活率(50.57%)最高，是對(duì)照的2.26倍。

圖1 不同馴化處理松天牛小首螨雌成螨極端高溫暴露(42 ℃、3 h)下的存活率Fig.1 Survival rate of P. alternatus adult females exposed to 42 ℃ for 3 h after different acclimatisation treatments

2.2 低溫馴化對(duì)松天牛小首螨極端低溫耐受性的影響

方差分析結(jié)果表明，馴化溫度、馴化時(shí)間以及兩者的交互作用均對(duì)松天牛小首螨雌成螨極端低溫暴露的存活率有顯著影響(馴化溫度：F=112.172；df=2，30；P<0.05；馴化時(shí)間：F=12.201；df=4，30；P<0.05；交互作用F=8.682；df=8，104；P<0.05)。由圖2可知，與對(duì)照相比，各種馴化處理均顯著提高了松天牛小首螨雌成螨在極端低溫暴露下的存活率，其中10 ℃96 h、10 ℃120 h馴化處理的存活率(68.79%、69.98%)最高，是對(duì)照的3.08和3.13倍。

圖2 不同馴化處理松天牛小首螨雌成螨極端低溫暴露(-10 ℃、3 h)下的存活率Fig.2 Survival rate of adult P. alternatus females exposed to -10 ℃ for 3 h after different acclimating treatments

2.3 不同低溫存儲(chǔ)松天牛小首螨膨腹體涌出成螨的數(shù)量

不同低溫條件存儲(chǔ)下松天牛小首螨膨腹體涌出成螨的數(shù)量見表1。從表中可以看出，在特定存儲(chǔ)時(shí)間下，3種存儲(chǔ)溫度之間的松天牛小首螨膨腹體涌出成螨數(shù)量總體上差異較小，尤其在15 d內(nèi)，各存儲(chǔ)溫度處理下膨腹體涌出成螨的數(shù)量都比較多。然而，在特定存儲(chǔ)溫度下，隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長，膨腹體涌出成螨的數(shù)量逐漸顯著減少。尤其是10 ℃存儲(chǔ)20 d后、5 ℃存儲(chǔ)25 d后、0 ℃存儲(chǔ)30 d后膨腹體涌出成螨的數(shù)量大幅減少。

表1 不同低溫存儲(chǔ)松天牛小首螨膨腹體涌出成螨數(shù)量Table 1 The number of P. alternatus adults emerged from inflated abdomen stored at different temperatures

2.4 不同低溫存儲(chǔ)松天牛小首螨雌成螨的存活率

不同低溫存儲(chǔ)下松天牛小首螨雌成螨的生存曲線見圖3。從圖中可以看出，總體上隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長，該螨存活率逐漸下降，但不同存儲(chǔ)溫度之間存在明顯差異。在對(duì)照25 ℃條件下，該螨在15 d內(nèi)的存活率僅有50%左右，在30 d內(nèi)死亡率超過80%；然而，在10 ℃條件下存儲(chǔ)30 d該螨有65.10%的存活率，在4 ℃條件下存儲(chǔ)15 d有92.11%的個(gè)體存活，存儲(chǔ)30 d仍有84.21%個(gè)體存活。

3 討論與結(jié)論

已有研究表明，我國松材線蟲病有向北擴(kuò)散的趨勢(趙捷等，2017)。松天牛小首螨作為新發(fā)現(xiàn)控制該病主要媒介昆蟲松墨天牛的潛在生防因子，研究該螨對(duì)極端溫度的適應(yīng)性具有重要意義。昆蟲或螨類等變溫動(dòng)物經(jīng)過特定溫度馴化一定時(shí)間，能夠顯著提高自身對(duì)極端溫度的耐受性，如：5 ℃短期低溫馴化能夠顯著提高飛蝗LocustamigratoriaL.卵的耐寒性(王竑晟，2006)；低溫馴化也能顯著提高擬步甲科昆蟲的耐寒性(庫爾班·吐松等，2016)。秋季到冬季的溫度季節(jié)性變化對(duì)大多數(shù)昆蟲和螨類順利越冬具有重要作用，能夠減輕由于氣溫降低而引起的種群衰減(唐斌等，2004)。本研究表明，30、33、37 ℃馴化12～60 h，可顯著提高松天牛小首螨雌成螨高溫暴露脅迫后的存活率，尤其是30 ℃馴化36 h的存活率比對(duì)照提高了1.26倍。10、15、20 ℃馴化24～120 h可顯著提高該螨極端低溫暴露下的存活率，特別是10 ℃96 h、10 ℃120 h馴化處理的存活率均比對(duì)照提高了約2.1倍。上述結(jié)果說明，松天牛小首螨具有很強(qiáng)的溫度適應(yīng)性，短期的溫度馴化即可大幅提升其對(duì)極端溫度的耐受性；也說明盡管該螨目前僅在局部地區(qū)分布，但其潛在的分布或應(yīng)用區(qū)域可能比目前發(fā)現(xiàn)的要廣。

觀察發(fā)現(xiàn)，松天牛小首螨世代周期短，4 d即能完成1代，繁殖力強(qiáng)，一個(gè)膨腹體可胎生上百只成螨。如何長期存儲(chǔ)足夠的螨蟲，是實(shí)現(xiàn)該螨商品化運(yùn)輸和野外應(yīng)用的重要問題。低溫存儲(chǔ)是天敵昆蟲或螨類長期保存的一種常用方法，如：智利小植綏螨PhytoseiuluspersimilisAthias-Henriot在4 ℃下能夠長期存儲(chǔ)(劉佰明等，2012)；一些昆蟲或螨類為適應(yīng)不良環(huán)境常常產(chǎn)生休眠或滯育(華愛等，2002； 張曼麗和范青海，2007)。類似的環(huán)境條件也可以作為長期存儲(chǔ)天敵昆蟲或螨類的條件。本研究發(fā)現(xiàn)，在0、5、10 ℃低溫下存儲(chǔ)松天牛小首螨膨腹體，在15 d內(nèi)各存儲(chǔ)溫度處理的膨腹體涌出成螨數(shù)量均較多；隨著存儲(chǔ)時(shí)間延長，膨腹體涌出成螨的數(shù)量逐漸顯著減少，尤其是10 ℃存儲(chǔ)20 d后、5 ℃存儲(chǔ)25 d后、0 ℃存儲(chǔ)30 d后，膨腹體涌出成螨的數(shù)量大幅減少；上述結(jié)果說明，0～10 ℃是存儲(chǔ)松天牛小首螨的適宜溫度，但膨腹體可能僅適合作為短期存儲(chǔ)對(duì)象。以雌成螨作為存儲(chǔ)對(duì)象時(shí)，在10 ℃下存儲(chǔ)30 d仍有60%以上的存活率，在4 ℃下存儲(chǔ)30 d有80%以上個(gè)體存活，說明雌成螨是適合中長期低溫存儲(chǔ)的對(duì)象，4 ℃是其中較優(yōu)的一個(gè)存儲(chǔ)溫度選項(xiàng)。然而，有關(guān)雌成螨的適宜存儲(chǔ)溫度，仍需進(jìn)一步研究弄清存貯溫度對(duì)其活性、寄生率、壽命等的影響才能確定。