miR-451在雌激素誘導(dǎo)大鼠乳腺增生中的作用機(jī)制研究*

張潔妤，曹 飛，陳春香，王 敏，何云巖，鄧仕標(biāo)，余 婷

(南昌大學(xué)撫州醫(yī)學(xué)院，江西 撫州 344000)

乳腺增生癥又稱為乳腺結(jié)構(gòu)不良癥，是乳腺組織增生及退行性變，與內(nèi)分泌功能紊亂密切相關(guān)，是中年女性最常見(jiàn)的乳腺疾病，常表現(xiàn)為乳房疼痛和(或)乳腺觸及結(jié)節(jié)，嚴(yán)重時(shí)影響女性正常工作和生活。有研究表明，乳腺增生可使患者罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加2～5倍。乳腺增生的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，對(duì)其分子機(jī)制的研究多集中于內(nèi)分泌激素紊亂方面[1-2]，在基因水平，特別是非編碼RNA對(duì)其發(fā)生、發(fā)展影響方面的研究很少見(jiàn)。本研究檢測(cè)了微小RNA(miR)-451基因及雌激素受體(ER)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)在大鼠乳腺增生組織中表達(dá)的差異，探討了miR-451與乳腺增生發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，旨在為臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 2020年6月選取20只大鼠作為研究對(duì)象。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為乳腺增生組和對(duì)照組，每組10只。

1.1.2主要試劑與儀器 黃體酮注射液購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司(規(guī)格：1 mL含黃體酮20 mg)，苯甲酸雌二醇注射液購(gòu)自上海通用藥業(yè)股份有限公司(規(guī)格：1 mL含雌二醇2 mg)，Trizol購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司，定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司，聚偏氟乙烯電轉(zhuǎn)膜購(gòu)自美國(guó)默克密理博公司，丙烯酰胺購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)歐米伽生物科技公司，脫脂奶粉購(gòu)自中國(guó)北大荒完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司，曝光用顯影粉/定影粉購(gòu)自中國(guó)天津市鑫洋醫(yī)療器械有限公司，電泳儀購(gòu)自中國(guó)北京六一儀器廠，移液器購(gòu)自德國(guó)艾本德公司，PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司，生物安全柜購(gòu)自中國(guó)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，7500實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司，Western-blotting儀購(gòu)自中國(guó)上海天能科技有限公司，UVP-GDS8000 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)斯博明科學(xué)器材公司。

1.2方法

1.2.1造模 乳腺增生組大鼠采用雌、孕激素序貫法造模，按體重0.5 mg/(kg·d)于大鼠后肢后外側(cè)肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇，每天1 次，左右交替，連續(xù)注射25 d，繼而改用黃體酮注射5 mg /(kg·d)，每天1 次，連續(xù)注射5 d。對(duì)照組大鼠肌內(nèi)注射生理鹽水每只0.1 mL，每天1 次，連續(xù)注射30 d。

1.2.2標(biāo)本采集 處死2組大鼠后分別切下10 g乳腺組織，經(jīng)生理鹽水處理后放置-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3定量RT-PCR檢測(cè) 使用RNA 提取試劑盒提取總RNA，在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，體系條件設(shè)定：16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，75 ℃、15 min，4 ℃保存。將miR-451反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，再以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板實(shí)施PCR擴(kuò)增：引物10 pmol/L；95 ℃變性10 min，95 ℃、15 s；60 ℃、1 min，40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參為U6，并按以下公式計(jì)算拷貝數(shù)：目標(biāo)基因△循環(huán)數(shù)(Ct)值=目標(biāo)基因Ct值-同一樣本 U6 Ct值。目標(biāo)組的△Ct為平均值減去其對(duì)照的平均△Ct值得到每個(gè)目的基因相對(duì)Ct值(△△Ct值)，即△△Ct為目標(biāo)基因=處理組△Ct值，即目標(biāo)基因-對(duì)照組△Ct值目標(biāo)基因?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算?！鰿t=Ct miR-451-Ct U6，△△Ct= (Ct miR-451-Ct U6)乳腺增生組-(Ct miR-451-Ct U6)對(duì)照組。

1.2.4Western-blotting檢測(cè) 取標(biāo)本碾磨后按常規(guī)方法提取總蛋白，在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺蛋白上樣緩沖液。沸水浴加熱3～5 min，以充分變性蛋白。冷卻到室溫后將蛋白樣品直接上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺膠加樣孔內(nèi)。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳處理后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，放置于預(yù)先準(zhǔn)備好的洗滌液中，漂洗1～2 min，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。用5%脫脂奶粉封閉1 h，結(jié)合一抗過(guò)夜后用緩沖液清洗3次，每次5 min，加入二抗室溫孵育2 h，用緩沖液清洗3次，每次5 min，加入ECL顯色劑，壓片曝光、顯影，經(jīng)Quantity one軟件掃描后進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.12組大鼠乳腺組織miR-451表達(dá)比較 對(duì)照組大鼠乳腺組織miR-451表達(dá)量是乳腺增生組大鼠的1.75倍。見(jiàn)表1。

表1 miR-451基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.22組大鼠乳腺組織ER、Cyclin D1、Bcl-2 蛋白表達(dá)比較 乳腺增生組大鼠乳腺組織ER、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組大鼠乳腺組織Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組大鼠乳腺組織ER、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

2.3miR-451與ER、Bcl-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性 miR-451與ER、Bcl-2蛋白表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.87、-0.79，P<0.05)。

3 討 論

作為育齡女性常見(jiàn)疾病之一，乳腺增生增加了患者罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)，隨年齡增加發(fā)生惡變的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。當(dāng)前，我國(guó)人口結(jié)構(gòu)老年化趨勢(shì)日益嚴(yán)重，乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)居高不下，特別是在一些經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，乳腺癌已位居女性惡性腫瘤發(fā)病首位。因此，從分子水平闡述乳腺增生的發(fā)病機(jī)制、探討新的治療靶點(diǎn)、積極給予早期干預(yù)對(duì)降低乳腺增生的惡化具有積極意義。

miRNA是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。目前為止，已被發(fā)現(xiàn)的miRNA超過(guò)1 000種，其可通過(guò)與靶基因的不完全配對(duì)，抑制靶向基因的表達(dá)，從而間接參與細(xì)胞代謝、增殖、分化、凋亡等過(guò)程[3-4]。

ALTUVIA等[5]在2005年最早提取了miR-451，其位于染色體17q11.2，與原癌基因ERBB2區(qū)域相鄰。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-451可能參與了調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞[6-8]、增生性瘢痕成纖維細(xì)胞[9]、增生型糖尿病視網(wǎng)膜[10]等增殖。如WANG等[11]在對(duì)非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-451能顯著抑制RAB14蛋白的表達(dá)，而RNA介導(dǎo)沉默RAB14的表達(dá)能呈現(xiàn)出miR-451抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，修復(fù)RAB14的表達(dá)后miR-451的抑癌作用將部分消失。巢海潮等[12]研究表明，膀胱癌組織中miR-451表達(dá)量明顯低于正常膀胱組織，同時(shí)，其表達(dá)與膀胱癌患者臨床分期及病理分級(jí)密切相關(guān)。

本研究以miR-451為導(dǎo)向，探討了其對(duì)乳腺增生上皮細(xì)胞ER、Cyclin D1、Bcl-2的影響，旨在為更好地了解乳腺增生發(fā)病機(jī)制提供參考依據(jù)，結(jié)果顯示，乳腺增生組大鼠乳腺組織miR-451表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，ER、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組。黃君華等[13]通過(guò)病例對(duì)照研究也發(fā)現(xiàn)，ER在乳腺增生患者體內(nèi)表達(dá)量升高。ER的高表達(dá)在ER信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制中也具有非常重要的作用，作為雌激素核受體，ER通過(guò)直接或間接方式與特異DNA位點(diǎn)——雌激素反應(yīng)元件(ERE)結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。ERE具有2個(gè)反向的回文基序PUGGTCA 。ER以ER-或ER-同二聚體或ER-/ER-異二聚體形式與ERE結(jié)合。ER結(jié)合的親和力及特異性取決于基序的序列和空間結(jié)構(gòu)。除通過(guò)ERE直接傳遞信號(hào)外，ER更多的是作為輔激活因子與其他結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子(AP1、SP1等)相互作用來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，ER與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)均存在關(guān)聯(lián)性，并在乳腺增生的發(fā)生、發(fā)展中具有關(guān)鍵作用[14-15]。

Bcl-2蛋白家族位于細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中，已發(fā)現(xiàn)25種Bcl-2家族同源蛋白，其成員中有些促進(jìn)凋亡，如Bad 、Bid 、Bax 等，有些成員阻止細(xì)胞凋亡，如Bcl-2、Bcl-x、Bcl-w等。Bcl-2能阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)，從而抑制了細(xì)胞凋亡[16-18]。焦丹等[19]通過(guò)觀察性研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。劉云等[20]采用半定量法檢測(cè)了Bcl-2在直腸癌中的表達(dá)，結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期、術(shù)前血清癌胚抗原水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，乳腺增生組大鼠乳腺組織Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，提示高表達(dá)Bcl-2蛋白可能抑制乳腺上皮細(xì)胞凋亡，從而間接促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增生。因此，miR-451可能通過(guò)調(diào)控ER表達(dá)進(jìn)而影響ER信號(hào)傳導(dǎo)，并調(diào)控Bcl-2蛋白表達(dá)從而抑制乳腺組織細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)乳腺增生的發(fā)生、發(fā)展。本研究下一階段計(jì)劃培養(yǎng)大鼠乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)一步通過(guò)使用miRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)使miR-451過(guò)表達(dá)，應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)抑制miR-451表達(dá)，探討miR-451對(duì)大鼠乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)和凋亡的影響，為闡述乳腺增生的發(fā)生、發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。