75株蛋雞源沙門菌的MLST分型與耐藥性分析

王 喜，李 珂，李廷翠，嚴(yán)紅亞，趙 蓉，常志順，廖 明，孫敏華*，信愛國*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所，昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，昆明 650201；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣州 510642)

沙門菌()為腸桿菌科沙門菌屬的革蘭陰性桿狀菌，廣泛分布于自然界，血清型眾多，迄今已鑒定出2 600多種，宿主譜較廣，包括人類在內(nèi)的所有哺乳動(dòng)物、鳥類和冷血?jiǎng)游?，是重要的人畜共患病原體。各血清型沙門菌均有致病性，一旦養(yǎng)殖場沙門菌病暴發(fā)，將會(huì)給食品安全、公共衛(wèi)生以及養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重后果，嚴(yán)重威脅人類健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，并且隨著抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中的廣泛使用，在抗生素的壓力下，沙門菌已誘發(fā)出多種耐藥機(jī)制。目前，圍繞云南蛋雞源沙門菌的耐藥性、毒力基因等基本流行情況的報(bào)道較少，本研究對2017年7月至2019年5月間來自云南部分養(yǎng)殖場的發(fā)病雞進(jìn)行沙門菌的分離鑒定、多位點(diǎn)序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)、耐藥性以及毒力基因攜帶情況檢測分析，以期掌握云南蛋雞源沙門菌病的基本流行病學(xué)情況，為云南地區(qū)雞源沙門菌的防控以及凈化工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源與質(zhì)控菌株

用于細(xì)菌分離的病料為2017年至2019年間分離自云南昆明、大理、開遠(yuǎn)、玉溪、石林、鹽津6個(gè)地區(qū)8個(gè)養(yǎng)殖場的142只發(fā)病蛋雞肝組織。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922購自中國微生物菌種保藏中心，腸炎沙門菌BNCC 103307購自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技公司。

1.2 主要試劑

SS培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基等購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；沙門菌屬診斷血清60種購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.3 沙門菌分離鑒定

無菌挑取病雞肝組織，劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)后，挑取沙門菌疑似菌落轉(zhuǎn)接于SS瓊脂，并進(jìn)行革蘭染色鏡檢、生化鑒定。參照Tarabees等建立的方法合成沙門菌屬特異性基因A的引物，PCR擴(kuò)增鑒定后使用沙門菌屬診斷血清進(jìn)行血清型鑒定。引物合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，測序均由昆明碩擎生物有限公司完成。

1.4 沙門菌分離株MLST分型

依據(jù)MLST官方網(wǎng)站合成沙門菌MLST 分型的7 個(gè)管家基因C、A、E、N、A、D和D引物，擴(kuò)增測序后用DNAstar修正，上傳到MLST 網(wǎng)站獲取等位基因編號(hào)，進(jìn)而確定每個(gè)菌株的ST 型別。

1.5 沙門菌分離株藥物敏感性檢測

選取15種臨床常用抗菌藥采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，以大腸埃希菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌。參照Chuanchuen等的方法選取β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、磺胺類、四環(huán)素類和喹諾酮類部分耐藥基因?qū)Ψ蛛x株進(jìn)行檢測。

1.6 沙門菌分離株毒力基因檢測

依據(jù)Tarabees等的研究合成9對沙門菌毒力島、毒力質(zhì)粒和毒素相關(guān)毒力基因引物。

2 結(jié) 果

2.1 沙門菌分離鑒定

2.1.1 發(fā)病雞臨床癥狀及剖檢情況 發(fā)病蛋雞精神倦怠，被毛松亂，食欲不振，排白色或綠色稀糞。剖檢可見肝明顯腫大，呈土黃色或黃褐色，少部分呈銅綠色，且大部分有出血點(diǎn)、出血斑，同時(shí)可見灰白色點(diǎn)狀或不規(guī)則條紋狀、斑塊狀壞死灶，個(gè)別雞只脾腫大，臨床初步判斷為沙門菌感染所致。

2.1.2 分離鑒定結(jié)果 細(xì)菌培養(yǎng)形態(tài)、革蘭染色鏡檢、生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果均符合沙門菌特性，從142只病雞肝組織樣品中共分離到疑似沙門菌屬菌株75株。

2.2 分離菌PCR鑒定結(jié)果

75株分離菌株均能擴(kuò)增出A基因，表明這75株菌均為沙門菌，發(fā)病雞只肝組織樣品沙門菌平均分離率為52.8%。

2.3 沙門菌分離株血清型鑒定結(jié)果

血清型鑒定結(jié)果表明，75株沙門菌均屬于D群雞-雛沙門菌。雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌O抗原相同，且均無H抗原，因此采用MLST分型方法對兩種血清型菌株作進(jìn)一步分型鑒定。

2.4 沙門菌分離株MLST分型鑒定結(jié)果

分離菌株均能擴(kuò)增出7個(gè)管家基因(圖1)，產(chǎn)物測序后上傳MLST網(wǎng)站，所有菌株都得到相應(yīng)的MLST型別，產(chǎn)生2種ST序列型，包括ST92序列型雞白痢沙門菌21株，占總分離數(shù)28.0%(21/75)；ST78序列型雞傷寒沙門菌54株，占比72.0%(54/75)，表明目前云南地區(qū)蛋雞源沙門菌優(yōu)勢流行株為雞傷寒沙門菌。

M.DL 2000 DNA Marker；1～7.thrA、purE、aroC、sucA、hisD、dnaN、hemD基因；8.陰性對照

2.5 沙門菌分離株耐藥性檢測結(jié)果

2.5.1 沙門菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，全部菌株對青霉素、四環(huán)素等10種抗生素存在不同的耐藥率，其中對青霉素的耐藥率高達(dá)100%(75/75)(圖2A)，表明每株菌至少對一種抗生素耐藥，而對頭孢他啶、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素和左氟沙星5種抗生素均敏感。雞傷寒沙門菌除了對頭孢他啶、妥布霉素等5種抗生素敏感外，對其余10種抗生素均存在不同程度的耐藥率，而雞白痢沙門菌僅對青霉素、阿莫西林、氨芐西林和鏈霉素4種抗生素存在不同程度的耐藥率，對其余11種抗生素均敏感。

A.耐藥率；B.耐藥基因檢出率

2.5.2 兩種血清型沙門菌耐藥譜型及多重耐藥統(tǒng)計(jì) 對10 種抗生素存在耐藥率的菌株共產(chǎn)生了7種耐藥譜型，耐藥譜型最多由5種抗生素藥物組成，兩種血清型菌株優(yōu)勢耐藥譜均為PEN，但雞傷寒沙門菌僅次于優(yōu)勢耐藥譜的為TET-ENR-DOX-SXT-PEN(12株)，而雞白痢沙門菌則為AMX-PEN-AMP(9株)。耐3 類及以上抗生素藥物為多重耐藥，分離菌株多重耐藥率達(dá)28.00%(21/75)，且集中于雞傷寒沙門菌，占該血清型38.89%(21/54)(表1)。

表1 沙門菌耐10種抗生素的耐藥譜

2.5.3 沙門菌分離株耐藥基因檢測結(jié)果 耐藥基因檢測結(jié)果顯示，A、C和E檢出率均高達(dá) 100%(75/75)；、2、A檢出率則分別達(dá)8.00%(6/75)、10.67%(8/75)、26.67%(20/75)，但3個(gè)基因在兩種血清型沙門菌中的檢出率存在較大差異,如A基因主要集中于雞傷寒沙門菌；、A2、B、3、A1、B和B均未檢出(圖2B)。

2.6 沙門菌分離株毒力基因檢測結(jié)果

毒力基因檢測結(jié)果顯示，毒力島SPI-2(L)基因及細(xì)胞毒素B基因均未檢出，除了毒力質(zhì)粒B基因的檢出率稍低外，為89.33%(67/75)，其余6種毒力基因SPI-1(A)、SPI-3(C)、SPI-4(A)、SPI-5(B)、C和的檢出率均高達(dá)100%(75/75)。

3 討 論

沙門菌給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)，還嚴(yán)重威脅著人類健康。本研究從發(fā)病蛋雞中共分離到雞-雛沙門菌75株，MLST分型鑒定出ST92序列型雞白痢沙門菌21株，ST78序列型雞傷寒沙門菌54 株，雞傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清型，Haque等在孟加拉國5個(gè)行政區(qū)分離到的214株雞源沙門菌中，檢出的優(yōu)勢血清型同樣為雞傷寒沙門菌，表明該血清型為禽類養(yǎng)殖中重要的病原菌之一。

畜禽養(yǎng)殖中廣泛使用的抗菌藥，雖能有效降低死亡率，但不能消除動(dòng)物群中的感染，停止用藥后仍會(huì)受到感染，造成細(xì)菌耐藥性的增加，且抗菌藥可通過食物鏈的傳遞造成人類對多種抗生素的耐藥性增強(qiáng)。本次分離的沙門菌中共存在7種耐藥譜，多重耐藥率較高達(dá)28%，且集中于雞傷寒沙門菌，因此在臨床預(yù)防和治療過程中應(yīng)做到科學(xué)合理、規(guī)范使用抗菌藥物，禁止濫用。耐藥基因作為細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制之一，可經(jīng)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或整合子之類可移動(dòng)性遺傳元件在不同菌株間進(jìn)行水平傳播，還可垂直傳播，促使菌株產(chǎn)生耐藥性。本次分離菌株攜帶編碼β-內(nèi)酰胺類相關(guān)基因僅檢出，與孫朋浩等的研究相似，均以的檢出率較高，該基因?yàn)棣?內(nèi)酰胺類耐藥菌攜帶率最高的耐藥基因。四環(huán)素類僅檢出A基因，且集中于雞傷寒沙門菌，Ahmed和Shimamoto發(fā)現(xiàn)埃及禽源沙門菌A是主要的四環(huán)素類耐藥基因?；前奉悆H檢出2基因，且檢出率遠(yuǎn)低于徐耀輝等在不同地區(qū)分離的沙門菌的檢出率。所有菌株均檢出喹諾酮類A、C和E基因，卻僅檢出13株菌耐喹諾酮類藥物，表明這13株沙門菌可能在檢出的喹諾酮類A、C和E基因中有個(gè)別或全部基因的耐藥決定區(qū)發(fā)生了基因突變，或者它們還存在其他耐藥基因和耐藥途徑等。

對分離菌株的5個(gè)主要毒力島核心蛋白基因檢測結(jié)果顯示，全部菌株SPI-2(L)基因未檢出，其余4個(gè)基因均檢出；毒力質(zhì)粒與腸毒素基因檢出率同樣較高，同樣為沙門菌的重要毒力因子；沙門菌細(xì)胞致死性腫脹毒素(cytolethal distending toxin, CDT)B基因未檢出，王月等研究發(fā)現(xiàn)，毒力基因B主要分布于傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌中，該基因攜帶情況可能與血清型差異、宿主差異等因素有關(guān)。本研究中，毒力基因檢出率均較高，預(yù)示本次分離菌的致病性可能較強(qiáng)，存在很大的潛在危險(xiǎn)性。

4 結(jié) 論

2017—2019年云南地區(qū)雞源沙門菌主要存在雞傷寒沙門菌和雞白痢沙門菌2種血清型，多重耐藥情況較為嚴(yán)重，耐藥基因與毒力基因檢出率較高，雞傷寒沙門菌多重耐藥率、耐藥基因檢出率高于雞白痢沙門菌。