豬流行性腹瀉病毒全病毒滅活疫苗量效關(guān)系研究

郝建偉，薛春宜，曹永長*

(1.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，晉中 030600；2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣州 510006)

冠狀病毒是影響人畜健康的一大類病毒，其宿主范圍廣泛，靶組織多樣，同一種病毒不同分支具有迥異的致病特點，疫苗免疫作為預(yù)防病毒性疫病的有效措施也常用于冠狀病毒防控。豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，病毒感染豬只后僅在小腸內(nèi)復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞變性、腸絨毛脫落，致使體內(nèi)水分外排，豬只電解質(zhì)紊亂。PEDV依據(jù)不同基因或基因組可分為多個進化分支，但從血清學(xué)分型角度判斷則當(dāng)前僅有一個血清型。該病尚無有效的治療藥物，合適的疫苗及合理的免疫程序是預(yù)防PED的重要措施。PEDV常用疫苗有弱毒疫苗和滅活疫苗兩類，弱毒疫苗產(chǎn)生的免疫效力更全面，但其常存在兩個方面的不足：首先，弱毒疫苗的致弱及安全評價過程較為漫長，如DR13強毒株連續(xù)傳100代毒力才減弱，可能降低弱毒疫苗的保護效力；其次，致弱過程中S蛋白受到很強的選擇壓力，有研究證實DR13及日本83P-5 100代弱毒疫苗與母本毒株屬于不同遺傳進化分支，其中S基因的變異與其有很高相關(guān)性，這使得弱毒疫苗與流行毒株基因差異進一步加大。

滅活疫苗具良好的安全性、可匹配實際流行毒株的優(yōu)點，但同樣存在使用效果不穩(wěn)定等缺點。其他冠狀病毒防控面臨同樣的問題，以雞傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)為例，現(xiàn)有滅活疫苗免疫效果不理想，對同血清型的毒株攻毒保護率不佳。針對以上問題，有相關(guān)研究利用濃縮疫苗研究免疫效果，顯示免疫劑量確與保護率相關(guān)，但未闡明具體劑量組成與評價標(biāo)準(zhǔn)。

因此，本研究制備不同總病毒粒子、感染性病毒粒子含量的PEDV疫苗，研究其激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫效果，探討不同抗原含量疫苗及免疫方式與保護效果之間的關(guān)系，為PEDV的有效防控提供參考，同時也對其他冠狀病毒或黏膜類疫病的有效免疫防控提供線索。

1 材料與方法

1.1 毒株和試驗動物

豬流行性腹瀉病毒變異毒株GDS01由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院有害生物控制與資源利用實驗室分離保存；小鼠免疫及測定試驗使用6周齡SPF BALB/c小鼠24 只，在中山大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)；18 頭PEDV抗原抗體陰性4～5周齡仔豬，品種為杜洛克×長白×大白三元雜交。

1.2 主要試劑及耗材

細(xì)胞：Vero細(xì)胞，由本實驗室傳代保存?？寺≥d體：pMD18-T vector，購自寶生物工程有限公司(以下稱寶生工)。DMEM低糖培養(yǎng)基購自GIBCO公司，胎牛血清購自GIBCO公司，無EDTA胰酶(Invitrogen)、TPB(SIGMA)、一次性濾器(Millipore)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)，TRIzol(Invitrogen)，低熔點瓊脂糖(TaKaRa)，瓊脂糖(BIOWEST)，DL2000(TaKaRa)。細(xì)胞生長培養(yǎng)基：含10%胎牛血清的低糖DMEM，使用NaHCO及HEPES調(diào)整培養(yǎng)液pH。病毒生長培養(yǎng)基：含0.3%TPB的低糖DMEM。1×PBS(pH 7.4)：8 g NaCl，3.58 g NaHPO,0.27 g KHPO，0.2 g KCl，加入800 mL水充分?jǐn)嚢枞芙?，調(diào)整pH后，定容至1 L，高壓滅菌后室溫保存。MSE緩沖液：10 mmol·LMOPS，pH 6.8；150 mmol·LNaCl；1 mmol·LEDTA。30%()蔗糖溶液：30 g蔗糖溶于70 mL MSE緩沖液中，過0.22 μm濾膜除菌。

1.3 病毒培養(yǎng)及濃縮

取致密單層Vero傳代細(xì)胞，接毒前用已滅菌PBS清洗3次，用生長培養(yǎng)基900 μL(含無EDTA的胰酶，濃度為7.5 μg·mL)與100 μL病毒液混合后加至單層細(xì)胞上，置37 ℃感作60 min后，棄掉混合上清，用已滅菌PBS清洗3次，加入4 mL含一定濃度胰蛋白酶的病毒生長培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)病變后，進行凍存以備后續(xù)研究。

將病毒原液按10倍倍比稀釋，各梯度病毒液按病毒接種傳代方法接種至長滿單層細(xì)胞6孔板中，準(zhǔn)備含1%低熔點瓊脂糖，含胰酶的病毒生長培養(yǎng)基，將其覆于細(xì)胞上，待培養(yǎng)基凝固后倒置培養(yǎng)，36 h后用萬分之三中性紅染色進行噬斑計數(shù)，完成病毒滴度測定。

采用超速離心濃縮病毒，首先準(zhǔn)備用于超速離心的病毒液，以MOI=0.05為接種濃度接種單層Vero細(xì)胞，當(dāng)單層細(xì)胞布滿細(xì)胞病變時收獲細(xì)胞及上清，凍融3次后4 ℃，4 000×離心30 min去除細(xì)胞碎片，澄清的上清凍存于-80 ℃冰箱。應(yīng)用超速離心進行病毒濃縮，以5 mL 30%蔗糖作為緩沖墊子防止PEDV纖突蛋白脫落，4 ℃，10 500×離心2 h，離心沉淀用1%原始體積MSE懸浮混勻制備100×濃縮病毒液，1×濃縮組～50×濃縮組使用100×病毒液進行倍比稀釋，200×濃縮病毒液制備方法為用0.5%MSE懸浮混勻離心沉淀。使用噬斑計數(shù)測定病毒感染性粒子數(shù)，應(yīng)用病毒計數(shù)儀測定全病毒粒子數(shù)。

1.4 疫苗的制備及免疫

采用二乙烯亞胺(Binary ethylenimine，BEI)滅活，具體方法為：將0.1 mol·LBEI加至疫苗中使其終濃度至5%，37 ℃孵育24 h滅活后用硫代硫酸鈉中和殘余BEI，病毒滅活是否徹底則是將滅活液體在細(xì)胞上進行連續(xù)傳代3次觀察細(xì)胞病變產(chǎn)生情況來驗證。免疫小鼠疫苗制備：按1∶1比例將抗原與弗氏佐劑混合乳化，以液滴完全不散開判為乳化完全；免疫豬疫苗制備：所有抗原均使用SEPPIC 201佐劑進行抗原液乳化，根據(jù)產(chǎn)品說明書1∶1混合抗原液及佐劑，250 r·min混勻制備成疫苗。上述樣品存放于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

小鼠的免疫程序為6周齡進行一免，一免后14 d進行二免；仔豬免疫程序為4～5周齡仔豬進行一免，一免后21 d進行二免，每次免后1 h觀察有無應(yīng)激及過敏癥狀。

1.5 小鼠抗體檢測及細(xì)胞因子測定

小鼠血液采集時間點為：一免前；一免后14 d；一免后28 d。

抗體檢測：本研究采用 ELISA和中和試驗兩種方法檢測試驗動物抗體水平。

小鼠細(xì)胞因子測定：通過ELISPOT試驗檢測IL-4及IFN-γ細(xì)胞因子水平，其方法如下：第一天完成分離脾淋巴細(xì)胞及加入刺激物培養(yǎng)試驗，按3×10cell·well的細(xì)胞濃度將淋巴細(xì)胞加至活化的ELISPOT板中，每孔100 μL，試驗組加入刺激物GDS01病毒液5×10pfu·well，設(shè)置正對照孔(加入PMA 2.5 μg·mL)、負(fù)對照(只加細(xì)胞及培養(yǎng)基)及背景對照孔(不含細(xì)胞只加培養(yǎng)基和檢測試劑)。所有樣品加完后，將ELISPOT板放入37 ℃，5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。

細(xì)胞裂解及斑點檢測在第2天進行，具體步驟為：傾倒板內(nèi)細(xì)胞及培養(yǎng)基，4 ℃放置10 min裂解板內(nèi)細(xì)胞，洗滌5～7次后拍干。將稀釋好的生物素標(biāo)記抗體加入各孔，每孔加入100 μL后置于37 ℃孵育1 h，洗滌5次。將稀釋好的酶標(biāo)親和素工作液100 μL·well加入后37 ℃孵育1 h，以上述洗滌方法洗滌5次后各孔加入AEC顯色工作液，100 μL·well，37 ℃避光靜置15 min后傾倒孔內(nèi)液體，打開ELISPOT板底座，用去離子水反復(fù)沖洗正反面終止顯色，將其放置在室溫陰涼處晾干后用ELISPOT讀板儀進行斑點計數(shù)。

1.6 仔豬中和抗體測定及攻毒試驗

疫苗免疫及對照仔豬在一免前、一免后21 d，二免后14、18、21 d采集血液并測定血清中和抗體效價，待不同免疫組抗體水平趨于穩(wěn)定后開始攻毒，攻毒毒株為GDS01，圈舍溫度為20 ℃，劑量為3×10pfu·頭。攻毒前3 d注射林可霉素、大觀霉素混懸劑以防細(xì)菌性疫病干擾。

仔豬發(fā)病通過逐日觀察排便進行判定，利用熒光定量RT-PCR方法研究仔豬排毒情況，熒光定量RT-PCR所用引物及探針序列如下：

上游引物：5′-GGGTATTGGAGAAAATCCTGATAG-3′；

下游引物：5′-AACTGGCGATCTGAGCATAG-3′。

探針：5′-AAGCAACAACAGAAGCCTAAGCAG-3′。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用Graphpad 5.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，小鼠試驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著；仔豬中和抗體與病毒含量相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，仔豬攻毒評分與中和抗體相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同抗原含量疫苗的制備

病毒液濃縮后，使用噬斑計數(shù)測定病毒感染性粒子數(shù)，應(yīng)用病毒計數(shù)儀測定全病毒粒子數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 應(yīng)用噬斑計數(shù)及病毒計數(shù)儀測定PEDV感染性粒子及全病毒粒子

2.2 小鼠體液免疫及細(xì)胞免疫結(jié)果

應(yīng)用ELISA測定小鼠二免14 d抗體，如圖1所示，25×～200×濃縮疫苗抗體水平與PBS相比有顯著性差異。另取血清滅活后進行血清中和試驗，結(jié)果顯示，12.5×～50×濃縮免疫組抗體水平與PBS免疫組相似，但當(dāng)抗原含量達(dá)到8×10pfu·mL(即100×濃縮組)時，結(jié)果相比PBS組具有顯著性差異，而2.2×10pfu·mL(即200×濃縮組)則極顯著高于PBS(圖2)。細(xì)胞免疫試驗結(jié)果顯示，50×～200×濃縮疫苗免疫小鼠刺激產(chǎn)生的IFN-γ滴度顯著高于PBS組(圖3)，同時IL-4檢測結(jié)果則表明12.5×～200×濃縮疫苗均有助于刺激IL-4的產(chǎn)生(圖4)。由小鼠試驗可知25×～200×濃縮疫苗在ELISA抗體水平及刺激IL-4的產(chǎn)生方面顯著優(yōu)于PBS組，50×濃縮疫苗在體液免疫與細(xì)胞免疫測定試驗中有3個指標(biāo)顯著優(yōu)于PBS對照組，而100×和200×濃縮疫苗則在上述試驗中均顯著或極顯著優(yōu)于PBS組，但100×濃縮疫苗免疫結(jié)果與200×濃縮疫苗結(jié)果之間沒有顯著差異。因此，綜合考慮小鼠試驗結(jié)果，選擇25×～100×濃縮疫苗結(jié)合未濃縮疫苗及PBS作為仔豬免疫分組(表2)。

*代表結(jié)果顯著高于PBS組，下同

**代表結(jié)果極顯著高于PBS組，下同

圖3 不同免疫組小鼠IFN-γ ELISPOT測定結(jié)果

圖4 不同免疫組小鼠IL-4 ELISPOT測定結(jié)果

表2 仔豬免疫分組

2.3 仔豬免疫及攻毒保護結(jié)果

不同組仔豬免疫后于5個時間點測定中和抗體并利用ELISA測定血清抗體水平，圖5顯示不同免疫組仔豬二免后14～21 d可形成穩(wěn)定差異，于二免后21 d作為攻毒時間。同時以二免后21 d測定的中和抗體效價與不同濃度疫苗PFU結(jié)果及總病毒粒子數(shù)進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示中和效價與PFU顯著相關(guān)(=0.998 1)且高于總病毒粒子數(shù)相關(guān)性(=0.607 6，圖6)。ELISA結(jié)果與中和試驗結(jié)果相似(圖7)。表3以評分方式將攻毒試驗結(jié)果定性資料進行賦值，顯示不同疫苗組仔豬攻毒后發(fā)病及排毒情況，所有免疫組攻毒前檢測均為PEDV陰性，攻毒試驗中，PBS免疫組3頭仔豬均有連續(xù)排毒的情況，其中1頭于攻毒后2～6 d表現(xiàn)出水樣稀便；未濃縮病毒疫苗免疫組中，1頭仔豬可檢出連續(xù)排毒同時伴有稀便，另外兩頭仔豬經(jīng)檢測表明其也可連續(xù)排毒，但未見明顯水樣稀便；25×濃縮組(3.8×10pfu·mL)與未濃縮免疫組情況相似，但未見水樣稀便癥狀；50×濃縮組(1.2×10pfu·mL)1頭仔豬可見連續(xù)排毒，但未見癥狀。而100×濃縮組(8×10pfu·mL)中，肌肉注射方式與后海穴免疫方式結(jié)果相近均未見連續(xù)排毒情況。統(tǒng)計各組評分，利用Spearman非參數(shù)等級檢驗，分析免疫組評分和中和效價的相關(guān)性。結(jié)果顯示，疾病評分與中和抗體具顯著相關(guān)性，Spearman相關(guān)系數(shù)||值為0.974 7(圖8)。攻毒評分為0時，代表疫苗可100%阻止排毒和發(fā)病，但其僅為理論值。本試驗以點排毒為閾值，即3分為閾值判斷不同免疫組對攻毒的保護效力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8×10pfu·mL免疫組低于閾值，可為豬只提供很好的保護力。

圖5 不同免疫組仔豬中和抗體測定結(jié)果

圖6 感染性病毒粒子含量(A)及總病毒粒子含量(B)與中和抗體相關(guān)性分析結(jié)果

圖7 不同免疫組仔豬血清抗體ELISA檢測結(jié)果

表3 不同免疫組攻毒評分結(jié)果

圖8 中和效價與攻毒評分相關(guān)性分析

3 討 論

病毒性疫病最主要的防控措施為疫苗免疫，例如豬瘟疫苗對中國乃至全球豬瘟的預(yù)防起到極其重要的作用，而偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒病等多種流行疫病也主要依靠疫苗和免疫程序的更新而得以控制。PEDV變異毒株自2010年暴發(fā)流行以來，已持續(xù)對全球養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成重大影響，其有效防控也有賴于疫苗的深入研究。目前，針對PEDV疫苗的研制方向存在以下幾方面共識：1)免疫評價指標(biāo)應(yīng)與疫苗保護效果有很好的相關(guān)性；2)PEDV疫苗遺傳進化特點須與流行毒株一致；3)PEDV疫苗需具備降低豬只排毒的能力。

由于PEDV弱毒疫苗在效力及安全性等方面存在隱患。因此，滅活疫苗是當(dāng)前防控PEDV的首選，但自2010年起不論是經(jīng)典疫苗或是變異毒株滅活疫苗免疫后均不能提供顯著且穩(wěn)定的保護，影響滅活疫苗免疫穩(wěn)定性的因素主要有以下幾方面：1)常規(guī)滅活劑破壞主要抗原蛋白活性；2)疫苗毒株與流行毒株分屬不同遺傳分支；3)疫苗劑量不穩(wěn)定影響免疫效果。針對上述問題，本研究深入探討疫苗劑量差異對免疫效果影響。首先，以BEI為滅活劑滅活病毒核酸，盡量減少對病毒抗原的影響。其次，以變異毒株制備疫苗同時以該毒株作為攻毒毒株，即可為PEDV的防控提供新的參考，又可避免毒株差異帶來的影響。不同免疫組疫苗抗原含量用兩種方法測定，便于篩選確定影響免疫效果的關(guān)鍵因素。本試驗以育肥初期豬只作為攻毒對象兼顧免疫系統(tǒng)的完善和較易發(fā)病排毒兩方面因素，這使得本研究的結(jié)論具有代表性；其次，攻毒之前測定抗體情況主要的目的是研究體液免疫的差異性是否能在一定范圍內(nèi)與疫病發(fā)生相關(guān)，可為PEDV監(jiān)測提供相應(yīng)依據(jù)。

利用小鼠研究不同抗原含量體液免疫和細(xì)胞免疫差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25×～100×濃縮疫苗免疫組可不同程度地刺激體液免疫和細(xì)胞免疫，值得注意的是，小鼠產(chǎn)生抗體與免疫劑量并不是直線相關(guān)，只有當(dāng)病毒含量達(dá)8×10pfu·mL時小鼠中和抗體與PBS組有顯著差異，推測動物免疫存在最低劑量閾值，而8×10pfu·mL對于小鼠來說即為其最低閾值。近一步利用仔豬進行免疫驗證，結(jié)果表明豬只產(chǎn)生中和抗體的滴度與疫苗有效抗原含量有關(guān)。不同毒株均具有這一特點，Collin等于2015年利用美國分離毒株進行兩個滴度量效關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)免疫劑量大的一組刺激產(chǎn)生中和抗體滴度高于低劑量組，其結(jié)論表明感染粒子數(shù)與中和抗體的產(chǎn)生具一定相關(guān)性，擴展了本文結(jié)果的適用性。不同免疫方式在本試驗中結(jié)果相似，因此為當(dāng)前研究PEDV免疫方式提供新的參考。

試驗豬只均為未免疫PEDV疫苗母豬所產(chǎn)仔豬，為了進一步驗證不同疫苗免疫效果，本研究也選擇生產(chǎn)中免疫PEDV疫苗的母豬所產(chǎn)仔豬，重復(fù)驗證未濃縮疫苗及8×10pfu·mL的免疫效果。結(jié)果顯示，未濃縮疫苗免疫組抗體水平參差不齊，免疫效果易受母源抗體干擾，其中1頭試驗豬一免后中和抗體為陰性，易為野毒感染提供空窗期，而8×10pfu·mL免疫組則整齊度較高(圖9)。

圖9 不同疫苗免疫有母源抗體仔豬中和抗體檢測結(jié)果

研究中疫苗劑量是以感染性粒子和總病毒粒子兩種方法作為定量依據(jù)，其中，25×濃縮疫苗與未濃縮疫苗感染性粒子數(shù)目相似，總病毒粒子數(shù)量相差10倍，但仔豬試驗中，中和抗體水平及保護效果差異并不明顯。由于兩組豬只均未見明顯腹瀉，因此進一步分析兩組仔豬增重變化情況，結(jié)果表明兩組平均增重相近(BC：2 066 g；12.5×：1 917 g)。因此，總病毒粒子提升免疫保護的效果要弱于感染性粒子數(shù)，推測其主要原因是濃縮疫苗制備時病毒纖突由于機械性損傷非特異脫落，總病毒粒子僅有部分為完整病毒粒子。另一方面，體液免疫中和抗體水平與病毒保護效果呈顯著相關(guān)，可避免豬只連續(xù)排毒及發(fā)病。

4 結(jié) 論

感染性病毒粒子數(shù)與免疫動物中和抗體水平呈顯著相關(guān)，以2 mL 8×10pfu·mLPEDV制備滅活疫苗免疫仔豬后可抵抗PEDV攻毒引起的腹瀉及連續(xù)排毒。本研究為PEDV疫苗研究提供量效相關(guān)數(shù)據(jù)，試驗表明PEDV滅活疫苗中完整病毒粒子數(shù)目是影響PEDV有效免疫的重要因素。