• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    細(xì)粒棘球絳蟲BAG3和EB1基因的克隆、表達(dá)及其在原頭蚴細(xì)胞凋亡中的作用

    2022-05-30 07:32:58華瑞其杜小迪楊光友
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報 2022年5期
    關(guān)鍵詞:棘球包囊絳蟲

    何 雪,王 凝,華瑞其,杜小迪,楊光友

    (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,成都611130)

    細(xì)粒棘球絳蟲()屬于帶科()棘球?qū)?),其中絳期幼蟲寄生于人和多種動物的組織器官內(nèi)時會引起囊型包蟲病(cystic echinococcosis, CE)。該病呈世界性分布,南美、東歐、中東、南非、亞洲以及地中海地區(qū)為主要流行區(qū)域,其中,中國也是全球范圍內(nèi)包蟲病流行最為嚴(yán)重的國家之一,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和公共衛(wèi)生安全問題。囊型包蟲病的主要特征是在肝、肺等組織器官內(nèi)形成多個大小不等的包囊,包囊由囊壁和囊液組成。囊壁包括內(nèi)部的生發(fā)層(germinal layer)和外部的角質(zhì)層(laminated layer)。此外,囊壁外還有一層致密的纖維組織層(adventitial layer)。包囊分為育囊和不育囊,育囊內(nèi)含大量的原頭蚴,不育囊內(nèi)無原頭蚴存在,因此不育囊不能感染終末宿主,但仍能對中間宿主組織器官造成嚴(yán)重?fù)p傷。目前,不育囊的形成機(jī)制尚不明確,但有研究顯示細(xì)胞凋亡可能與不育囊形成之間有著密切聯(lián)系,因此,調(diào)控細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因可能在此過程中起至關(guān)重要的作用。

    BAG3屬于Bcl-2結(jié)合抗凋亡基因(Bcl-2 associated athanogene,BAG)家族,該家族的成員均含有一個位于C端的BAG結(jié)構(gòu)域,BAG蛋白通過該結(jié)構(gòu)域可與熱休克蛋白70(heat shock protein, HSP70)的ATP酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合,作為HSP70的共-分子伴侶從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。內(nèi)吞蛋白B1(endophilin B1,EB1),又稱作Bax蛋白互作因子 1(Bax-interacting factor 1, Bif-1),為內(nèi)吞蛋白家族(endophilin)的一員,廣泛參與細(xì)胞凋亡、自噬、線粒體功能調(diào)控等細(xì)胞生理學(xué)過程,EB1蛋白作為Bax蛋白的激活因子,目前其促凋亡作用已被研究證實。細(xì)粒棘球絳蟲基因組中存在BAG3和EB1基因,但目前尚無細(xì)粒棘球絳蟲BAG3和EB1基因功能的研究報道,二者在蟲體細(xì)胞凋亡過程中是否具有調(diào)控作用也不清楚。為此,本研究通過克隆、表達(dá)了Eg-BAG3和Eg-EB1基因,對其蛋白分子特性及其在原頭蚴細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行了探究,以期為細(xì)粒棘球蚴不育囊的形成機(jī)制提供參考資料。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑

    動物組織總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒、大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生物科技有限公司;PrimeScriptDouble Strand cDNA Synthesis Kit、pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶(H Ⅰ、R Ⅰ、Ⅰ)及T4 DNA連接酶購自大連寶生物工程有限公司;TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自瑞士Roche公司;總蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物科技公司;HRP Conjugated Goat Anti-rabbit IgG(H+L)及FITC Conjugated Goat Anti-rabbit IgG(H+L)購自武漢博士德生物工程有限公司;RNA轉(zhuǎn)染試劑EntransterTM-R4000、RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清分別購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司和美國Hyclone公司;pET-28a(+)、pET-32a(+)載體和弗氏(不)完全佐劑分別購自美國Invitrogen和Sigma公司;Ni親和層析柱和HiTrap Protein A預(yù)裝柱購自美國Bio-Rad公司。PCR引物合成及質(zhì)粒測序交由上海生工生物工程有限公司完成,siRNA由上海吉瑪公司合成。免疫印跡對照蛋白:西氏貝蛔蟲()重組硫氧還蛋白過氧化物酶(rBs-Tpx)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物寄生蟲病研究中心提供。

    1.2 動物倫理學(xué)聲明

    本研究得到四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物倫理委員會的審查和批準(zhǔn),所有實驗動物的飼養(yǎng)及試驗操作程序嚴(yán)格按照“四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物倫理委員會實驗動物護(hù)理指南”(SYXK2014-187,中國成都)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

    1.3 蟲體、血清及動物

    細(xì)粒棘球蚴包囊采自四川某屠宰場自然感染囊型包蟲病綿羊的肝或肺。在實驗室無菌條件下利用無菌注射器抽出包囊液并于普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行鏡檢,根據(jù)是否含有原頭蚴將包囊鑒定為育囊和不育囊,隨后將從育囊中獲得的囊液經(jīng)4 000 r·min離心10 min,無菌PBS清洗3次后分離得到原頭蚴。細(xì)粒棘球絳蟲45日齡成蟲由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物寄生蟲病研究中心提供。綿羊陽性血清和陰性血清分別來自于自然感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊和非包蟲病流行區(qū)域的健康綿羊,二者通過尸體剖解確定。4只2.0~2.5 kg健康雄性新西蘭兔購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司。

    1.4 生物信息學(xué)分析

    通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得Eg-BAG3(登錄號:XM_024490124.1)和Eg-EB1(登錄號: CDS21096.1)基因的全長編碼序列并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用Expasy(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白基本理化性質(zhì),包括氨基酸數(shù)目、分子量和等電點;蛋白信號肽、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域及二級結(jié)構(gòu)分別利用SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)、TMHMM-2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)、WOLFPSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)、InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)和SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行預(yù)測。此外,利用DNAMAN軟件和MEGA軟件(version 5.05)分別對Eg-BAG3、Eg-EB1及其同源基因進(jìn)行多序列比對并采用鄰接法(Neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    1.5 Eg-BAG3和Eg-EB1的克隆、表達(dá)與純化

    利用動物組織RNA提取試劑盒提取原頭蚴總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,參考數(shù)據(jù)庫中Eg-BAG3和Eg-EB1基因的全長編碼序列設(shè)計特異性引物,其中Eg-BAG3上游和下游引物分別是5′-CGCATGTCGGTGCCTCACGTT-3′(下劃線為H Ⅰ酶切位點)和5′-CCGCTAAGCATCGCTTTCCTTTG-3′(下劃線為R Ⅰ酶切位點);Eg-EB1上游和下游引物分別是5′-CGCATGAATTACTTGTTCATCGTTTTC-3′(下劃線為H Ⅰ酶切位點)和5′-CCTACTCGCCCAGCATCATAC-3′(下劃線為Ⅰ酶切位點),隨后利用提取的原頭蚴cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件,95 ℃預(yù)變性4 min,95 ℃變性45 s,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸45 s,35個循環(huán),72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后克隆導(dǎo)入pMD19-T載體并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單個菌落,經(jīng)PCR鑒定為陽性后提取質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測序。將構(gòu)建成功的pMD19-T-Eg-BAG3及 pMD19-T-Eg-EB1質(zhì)粒雙酶切回收后分別亞克隆入pET-28a(+)和pET-32a(+)載體中,隨后將構(gòu)建成功的pET-28a(+)-Eg-BAG3和pET-32a(+)-Eg-EB1轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌中,于37 ℃條件下加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h,收集菌體并超聲破碎菌體,離心后收集上清液及沉淀,二者均進(jìn)行SDS-PAGE以驗證重組蛋白的主要表達(dá)形式,隨后利用Ni親和層析柱純化上清或者沉淀中的表達(dá)產(chǎn)物,12% SDS-PAGE驗證蛋白表達(dá)及純化效果。

    1.6 多克隆抗體制備

    兔抗rEg-BAG3 IgG和兔抗rEg-EB1 IgG按照以下步驟制備:首次免疫時,將200 μg純化后的重組蛋白利用等體積的完全弗氏佐劑充分乳化,然后以皮下注射方式對4只新西蘭兔進(jìn)行免疫,每種蛋白免疫2只。隨后利用不完全弗氏佐劑和重組蛋白連續(xù)加強(qiáng)免疫3次,每次間隔一周,最后一次免疫一周后采血分離血清,并利用HiTrap Protein A預(yù)裝柱純化獲得IgG。此外,免疫前對4只新西蘭兔進(jìn)行采血獲得陰性血清。

    1.7 免疫印跡

    利用貝博總蛋白提取試劑盒提取原頭蚴總蛋白,制備12%SDS-PAGE電泳凝膠,對純化的rEg-BAG3、rEg-EB1、西氏貝蛔蟲重組硫氧還蛋白過氧化物酶(rBs-Tpx)及原頭蚴總蛋白進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC膜)上,TBST洗膜3次(每次5 min)后加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,封閉完成后,加入綿羊陰性血清、綿羊陽性血清(1∶100稀釋)、兔陰性血清、兔抗rEg-BAG3 IgG或兔抗rEg-EB1 IgG(1∶400稀釋),4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的兔抗綿羊IgG(1∶1 000稀釋)或山羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h,然后根據(jù)Metal Enhanced DAB Substrate Kit(20×)說明加入顯色液避光顯色至條帶出現(xiàn),加入雙蒸水終止反應(yīng)。

    1.8 免疫熒光定位

    原頭蚴、育囊、不育囊及45日齡成蟲在4%多聚甲醛中固定24 h后,制成石蠟切片(5 μm),切片進(jìn)行脫蠟復(fù)水后在0.01 mol·L枸櫞酸緩沖液中95 ℃加熱20 min進(jìn)行抗原修復(fù),隨后在組織上滴加5%山羊血清并于37 ℃孵育1 h,對組織上的非特性位點進(jìn)行封閉。在組織上滴加兔陰性血清、兔抗rEg-BAG3 IgG或兔抗rEg-EB1 IgG(1∶400稀釋),于4 ℃孵育過夜。第二天經(jīng)PBS清洗3次后加入FITC conjugated goat anti-rabbit IgG(H+L)(1∶2 000稀釋)避光孵育1 h,PBS清洗3次后加入DAPI染液染色3~5 min,再次清洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片,并利用熒光顯微鏡采集圖像并拍照。

    1.9 H2O2誘導(dǎo)原頭蚴細(xì)胞凋亡及Eg-BAG3、Eg-EB1轉(zhuǎn)錄水平的變化

    將新鮮采集的原頭蚴利用無菌PBS清洗3次后,利用0.4%臺盼藍(lán)染液進(jìn)行染色,確保原頭蚴存活率大于95%。隨后,將原頭蚴加入含10%胎牛血清、100 U·mL青霉素、100 μg·mL硫酸鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中重懸計數(shù),調(diào)整數(shù)目為約3 000個·mL,按照每孔3 mL原頭蚴懸液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板并置于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。原頭蚴分為處理組(T group)和空白組(NC group),每組3個重復(fù),24 h后處理組加入10 mmol·LHO處理8 h,對照組加入等體積PBS,以處理前作為0 h, 分別于處理后2、4、6及8 h收集原頭蚴并通過光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡對原頭蚴形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,同時,利用qRT-PCR對Eg-BAG3和Eg-EB1的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析,以(NCBI登錄號:XM_024497550.1)為內(nèi)參基因,設(shè)計引物:Eg-BAG3上下游引物:5′-AGATGGTCAGGACAGCGTTC-3′和5′-GAGGTGTCTTCAACCGCATT-3′;Eg-EB1上下游引物:5′-GTATGGCCACTGCCAGAAAG-3′和5′-CTCCTCCAGCTTGGTCTTTG-3′;上下游引物: 5′-ATGGTTGGTATGGGACAAAAGG-3′和5′-TTCGTCACAATACCGTGCTC-3′。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;兩步法擴(kuò)增95 ℃ 5 s,56 ℃ 30 s,40個循環(huán);熔解95 ℃ 5 s,56 ℃ 60 s,95 ℃ 1 s,反應(yīng)結(jié)束后結(jié)果采用2-ΔΔC法分析。

    1.10 原頭蚴Eg-BAG3和Eg-EB1基因RNA干擾分析

    為了進(jìn)一步探究Eg-BAG3和Eg-EB1在調(diào)控HO誘導(dǎo)的原頭蚴細(xì)胞凋亡中可能起到的作用,本研究首先通過siRNA轉(zhuǎn)染原頭蚴的方式抑制Eg-BAG3和Eg-EB1在原頭蚴中的表達(dá)水平。根據(jù)Eg-BAG3和Eg-EB1基因序列,利用在線軟件siRNA Target Finder針對兩個基因序列的3個不同區(qū)域,分別設(shè)計出3對特異性的siRNA,同時設(shè)計1對與細(xì)粒棘球絳蟲任何基因均無關(guān)的siRNA作為陰性對照。此外,每段引物的3′末端均添加TT以增強(qiáng)siRNA的穩(wěn)定性,陰性對照siRNA的5′末端還添加FAM熒光標(biāo)記,用于檢測siRNA的轉(zhuǎn)染效率,具體序列如表1所示。將原頭蚴分為8個組,分別是6個不同siRNA試驗組、陰性對照組(siRNA-CON)以及空白對照組(不做任何處理),每組3個重復(fù)孔,每孔3 mL培養(yǎng)基,約含原頭蚴4 000個。向500 pmol siRNA中加入25 μL RPMI1640培養(yǎng)基,制成siRNA稀釋液,然后取10 μL轉(zhuǎn)染試劑Entranster-R4000加入15 μL RPMI1640培養(yǎng)基,充分混勻,制成終體積為25 μL的轉(zhuǎn)染試劑稀釋液,將25 μL轉(zhuǎn)染試劑稀釋液和25 μL siRNA稀釋液充分混勻后全部加入到含有2.45 mL完全培養(yǎng)基的原頭蚴中,放于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,隨后更換新的培養(yǎng)液按照上述步驟再次進(jìn)行轉(zhuǎn)染,24 h后在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取不同視野,分別計數(shù)其中帶有和不帶有熒光標(biāo)記的原頭蚴估算轉(zhuǎn)染效率。離心收集蟲體,提取蟲體總RNA并合成cDNA,利用qRT-PCR對Eg-BAG3和Eg-EB1的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析從而篩選出干擾效率最高的siRNA。

    表1 siRNAs序列

    將干擾效率最高的siRNA處理后的原頭蚴(BAG3-IG及EB1-IG)、未干擾組(NIG)原頭蚴(僅轉(zhuǎn)染siRNA-CON)利用10 mmol·LHO于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中作用8 h,空白對照組(NCG)原頭蚴既不經(jīng)siRNA處理,也不經(jīng)HO處理,同樣于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h,隨后收集所有組的原頭蚴并制作石蠟切片(4 μm)。根據(jù)dUTP缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling, TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明對組織進(jìn)行標(biāo)記,并加入DAPI染液作用3~5 min對細(xì)胞核進(jìn)行染色,PBS清洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。隨后在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取400倍鏡下的3個視野對切片進(jìn)行拍照,并應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)分析。其中綠色熒光細(xì)胞被判定為陽性細(xì)胞,藍(lán)色熒光為DAPI染色后的細(xì)胞核,將每張照片的陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)后,按照陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%計算出原頭蚴細(xì)胞凋亡率。

    1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié) 果

    2.1 Eg-BAG3 和Eg-EB1的擴(kuò)增與生物信息學(xué)分析

    Eg-BAG3 和Eg-EB1基因編碼序列全長分別為699和759 bp,無信號肽和跨膜區(qū)且主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示Eg-BAG3有1個位于N端的WW結(jié)構(gòu)域(aa 7―41)和1個位于C端的BAG結(jié)構(gòu)域(aa 125―202),Eg-EB1有1個 BAR(Bin/Amphiphysin/Rvs,BAR)結(jié)構(gòu)域(aa 19―252)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示Eg-BAG3主要是無規(guī)則卷曲,其次是α螺旋和β折疊(圖1a),Eg-EB1二級結(jié)構(gòu)則以α螺旋為主,無規(guī)則卷曲和β折疊則較少(圖1b)。通過與其他物種BAG3和EB1的氨基酸序列進(jìn)行比對分析,結(jié)果顯示,Eg-BAG3 在不同物種之間具有較高的變異性,僅與多房棘球絳蟲()BAG3的相似性最高(95.69%),而與其他絳蟲如微口膜殼絳蟲()BAG3的相似性較低,僅為49.16%,與日本血吸蟲()和曼氏血吸蟲()BAG3的相似性則更低,均小于30%(圖1a)。Eg-EB1在物種之間的保守性較高,尤其是絳蟲,Eg-EB1與多房棘球絳蟲()、亞洲帶絳蟲()、牛帶絳蟲()、豬帶絳蟲()EB1的相似性均高達(dá)70%以上,而與吸蟲EB1的相似性相對較低(圖1b)。進(jìn)化樹結(jié)果顯示,Eg-BAG3和Eg-EB1均與多房棘球絳蟲()、亞洲帶絳蟲()、微口膜殼絳蟲()的BAG3或EB1屬于同一分支,具有較近的親緣關(guān)系,而與其他吸蟲、線蟲或哺乳動物的BAG3或EB1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)。

    GenBank accession numbers:Echinococcus granulosus BAG3(CDS17299.1); Echinococcus multilocularis BAG3(CDS42338.1); Hymenolepis microstoma BAG3(CDS26401.1); Schistosoma mansoni BAG3(XP_018645045.1); Schistosoma japonicum BAG3(AAP06461.1); Echinococcus granulosus EB1(CDS21096.1); Echinococcus multilocularis EB1(CDS38179.1); Taenia asiatica EB1(ANC29539.1); Taenia saginata EB1(ANC29539.1); Taenia solium EB1(AEF14021.1); Hymenolepis microstoma EB1(CDS27698.1); Schistosoma mansoni EB1(XP_018647699.1); Schistosoma japonicum EB1(CAX70483.1); Clonorchis sinensis EB1(GAA56152.1)

    圖2 Eg-BAG3(a)和Eg-EB1(b)系統(tǒng)進(jìn)化樹

    2.2 rEg-BAG3和rEg-EB1的表達(dá)、純化及免疫印跡

    rEg-BAG3和rEg-EB1均成功表達(dá)于BL21(DE3)中,蛋白分子大小分別約為 30 ku(圖3a)和46 ku(圖3b),大小與預(yù)期相符且二者都以上清形式存在。免疫印跡結(jié)果顯示,rEg-BAG3和rEg-EB1都可以被自然感染細(xì)粒棘球蚴綿羊的陽性血清特異性識別,而與健康綿羊陰性血清不反應(yīng),說明Eg-BAG3和Eg-EB1都具有較好的免疫反應(yīng)性;兔抗rEg-BAG3 IgG和兔抗rEg-EB1 IgG分別可以特異性識別rEg-BAG3和 rEg-EB1,但無法識別rBs-Tpx,說明兔抗rEg-BAG3 IgG和rEg-EB1 IgG僅可以和rEg-BAG3及rEg-EB1特異性結(jié)合,而與其他蛋白不反應(yīng)。此外,兔抗rEg-BAG3 IgG和兔抗rEg-EB1 IgG在原頭蚴總蛋白中特異性識別出天然蛋白Eg-BAG3和Eg-EB1,大小分別約為26和29 ku(圖3),表明Eg-BAG3和Eg-EB1表達(dá)于原頭蚴中且可能參與調(diào)控原頭蚴的生長發(fā)育過程。

    表2 Eg-BAG3 和Eg-EB1基本分子特征分析

    M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品;1.IPTG誘導(dǎo)后rEg-BAG3/rEg-EB1的表達(dá);2.純化后的rEg-BAG3/rEg-EB1;3.兔抗rEg-BAG3 IgG/rEg-EB1 IgG識別rEg-BAG3/rEg-EB1;4.兔陰性血清識別rEg-BAG3/rEg-EB1;5.兔抗rEg-BAG3 IgG/兔抗rEg-EB1 IgG識別rBs-Tpx;6.自然感染細(xì)粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別rEg-BAG3/rEg-EB1;7.健康綿羊陰性血清識別rEg-BAG3/rEg-EB1;8.兔抗rEg-BAG3 IgG/rEg-EB1 IgG識別原頭蚴粗蛋白

    2.3 免疫熒光定位

    Eg-BAG3和Eg-EB1在原頭蚴、成蟲、育囊與不育囊的免疫熒光定位分析顯示Eg-BAG3在細(xì)粒棘球絳蟲各個發(fā)育時期均有分布,且主要分布于生發(fā)層以及原頭蚴和成蟲的皮層和實質(zhì)組織(圖4a)。Eg-EB1主要分布于原頭蚴的皮層、頂突和吸盤以及包囊生發(fā)層,但在成蟲未見特異性分布(圖4b)。

    LL.角質(zhì)層;GL.生發(fā)層;Teg.皮層;PR.實質(zhì)組織;S.吸盤;R.頂突。標(biāo)尺:50 μm

    2.4 H2O2誘導(dǎo)原頭蚴細(xì)胞凋亡及Eg-BAG3、Eg-EB1轉(zhuǎn)錄水平的變化

    在利用10 mmol·LHO連續(xù)作用原頭蚴8 h后,原頭蚴形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)明顯的凋亡相關(guān)的變化,光學(xué)顯微鏡下HO處理組原頭蚴頭節(jié)出現(xiàn)腫脹、塌陷甚至破裂的現(xiàn)象,原頭蚴體積縮小、鈣顆粒變小或模糊不清(圖5 d),而空白組原頭蚴結(jié)構(gòu)仍舊清晰、完整,鈣顆粒清亮而明顯(圖5a)。透射電鏡結(jié)果顯示HO處理組原頭蚴細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡相關(guān)變化,如胞體變小、皺縮,染色質(zhì)凝集,甚至出現(xiàn)細(xì)胞核破裂等變化(圖5e、f),而空白組原頭蚴細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常(圖5b、c)。qRT-PCR結(jié)果顯示,處理組原頭蚴Eg-BAG3的相對轉(zhuǎn)錄水平隨著HO處理時間的延長而逐漸上升,在6和8 h的相對轉(zhuǎn)錄水平與0 h相比,差異顯著(<0.05)(圖6a)。Eg-EB1的相對轉(zhuǎn)錄水平也隨著HO處理時間的延長而逐漸上升,在8 h的相對轉(zhuǎn)錄水平與0 h相比統(tǒng)計學(xué)差異顯著(<0.05)(圖6b)。空白組原頭蚴在0~8 h的Eg-BAG3和Eg-EB1相對轉(zhuǎn)錄水平均無顯著差異(>0.05)。綜上,提示Eg-BAG3和Eg-EB1可能均參與調(diào)控HO誘導(dǎo)的原頭蚴細(xì)胞凋亡。

    a.光學(xué)顯微鏡下的空白組原頭蚴(10×);b、c.透射電鏡下的空白組原頭蚴;d.光學(xué)顯微鏡下的H2O2處理組原頭蚴(10×);e、f.透射電鏡下的H2O2處理組原頭蚴。箭頭代表原頭蚴細(xì)胞凋亡的典型變化

    數(shù)據(jù)為三次試驗的每組0 h和其他時間點之間的統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異用One-way ANOVA分析來確定(*.P<0.05)

    2.5 原頭蚴Eg-BAG3和Eg-EB1 RNA干擾分析

    為了進(jìn)一步探究Eg-BAG3和Eg-EB1在HO誘導(dǎo)的原頭蚴細(xì)胞凋亡中起到的具體作用,本研究分別以3對針對Eg-BAG3或Eg-EB1不同位點區(qū)域的siRNA以及無關(guān)siRNA通過浸染法轉(zhuǎn)染原頭蚴,通過siRNA上帶有的FAM熒光標(biāo)記在熒光顯微鏡下估算轉(zhuǎn)染效率約為60%,說明成功將siRNA導(dǎo)入了原頭蚴體內(nèi)。qRT-PCR結(jié)果顯示,針對Eg-BAG3的3對siRNA干擾組原頭蚴(BAG-108、BAG-181和BAG-486)的Eg-BAG3相對轉(zhuǎn)錄水平均降低,分別為siRNA-CON組原頭蚴的52.24%、32.68%和57.57%;針對Eg-EB1的3對siRNA干擾組原頭蚴(EB-91、EB-360和EB-476)的Eg-EB1的相對轉(zhuǎn)錄水平也都降低,分別為siRNA-CON組原頭蚴的39.87%、66.59%和64.62%,表明BAG-181和EB-91的干擾效率最高。通過進(jìn)一步利用HO處理干擾效率最高的siRNA轉(zhuǎn)染后的原頭蚴,并應(yīng)用TUNEL法對原頭蚴細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示Eg-BAG3干擾組原頭蚴細(xì)胞凋亡率(72.68%±10.00%)顯著高于未干擾組(63.87%±6.10%),<0.05,而Eg-EB1干擾組原頭蚴細(xì)胞凋亡率(50.43%±9.14%)低于未干擾組(63.87%±6.10%),<0.05(表3,圖7)。值得注意的是,未干擾組原頭蚴的總細(xì)胞數(shù)相對于空白組及Eg-BAG3和Eg-EB1干擾組較少,可能是由于蟲體在制作石蠟切片時,各組蟲體不同切面的細(xì)胞數(shù)不同引起的。

    表3 TUNEL法測定原頭蚴細(xì)胞凋亡率

    a.空白組原頭蚴;b.未干擾組原頭蚴;c.Eg-BAG3干擾組原頭蚴;d.Eg-EB1干擾組原頭蚴

    3 討 論

    BAG3屬于BAG蛋白家族,該蛋白家族成員的基本特征是在C末端存在保守的 BAG 結(jié)構(gòu)域且該結(jié)構(gòu)域可形成3個平行的短α螺旋結(jié)構(gòu),此外,某些BAG蛋白還有WW結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸的PXXP結(jié)構(gòu)域、核定位信號(nuclear localization signal,NLS)、泛素樣(ubiquitin-like,UBL)結(jié)構(gòu)域,其中WW結(jié)構(gòu)域僅見于BAG3蛋白。Eg-BAG3含有1個BAG結(jié)構(gòu)域和1個WW結(jié)構(gòu)域,且BAG結(jié)構(gòu)域形成3個明顯的短α螺旋結(jié)構(gòu),表明Eg-BAG3具有BAG蛋白家族的基本結(jié)構(gòu)特征。BAG蛋白正是通過這些結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)各種信號分子蛋白相互作用,從而參與調(diào)控各種生理活動,目前,已被研究證實BAG蛋白可以通過BAG結(jié)構(gòu)域和HSP70的ATP酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合從而作為HSP70的共分子伴侶調(diào)節(jié)多種生理活動,如細(xì)胞凋亡、自噬、遷移、黏附等。內(nèi)吞蛋白B1由位于N端的BAR結(jié)構(gòu)域,中間的可變區(qū)以及C端的SH3(SRC homology-3)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中,BAR結(jié)構(gòu)域具有綁定磷脂雙分子層并使膜彎曲的特性,參與囊泡的形成;SH3結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合多種內(nèi)吞蛋白,在細(xì)胞內(nèi)吞方面起到重要的調(diào)控作用。從結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析結(jié)果來看,Eg-EB1含典型的BAR結(jié)構(gòu)域,但缺少SH3結(jié)構(gòu)域,具體原因目前尚不清楚。免疫熒光定位顯示,Eg-BAG3廣泛分布于細(xì)粒棘球絳蟲的各個發(fā)育時期,包括原頭蚴、成蟲以及包囊生發(fā)層,提示Eg-BAG3可能在蟲體的整個生長發(fā)育過程中均扮演重要角色。Eg-EB1在細(xì)粒棘球絳蟲中曾被鑒定為一個大小約為29 ku的抗原分子(P-29),且主要定位于原頭蚴的皮層和頂突以及包囊生發(fā)層,但在包囊液或成蟲提取物中不存在。同樣,Eg-EB1在本研究也被發(fā)現(xiàn)主要定位于原頭蚴皮層、頂突以及包囊生發(fā)層,而在成蟲則未見分布,推測Eg-EB1可能主要參與調(diào)節(jié)細(xì)粒棘球絳蟲幼蟲階段的生長發(fā)育。

    細(xì)粒棘球蚴包囊可以在中間宿主體內(nèi)長期存在并產(chǎn)生大量原頭蚴,在此過程中宿主調(diào)動自身的免疫系統(tǒng),通過各種免疫細(xì)胞的直接或者間接作用攻擊蟲體,其中,宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)是一個重要的可以有效誘導(dǎo)原頭蚴細(xì)胞凋亡的物質(zhì)。ROS包括過氧化氫(HO)、超氧陰離子自由基(O)、羥基自由基(-OH)等代謝產(chǎn)物,高濃度的ROS將嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì),從而引起細(xì)胞凋亡,目前,HO已被用于誘導(dǎo)多房棘球絳蟲和細(xì)粒棘球絳蟲的細(xì)胞凋亡。有研究報道顯示,BAG3具有抑制細(xì)胞凋亡的作用,當(dāng)細(xì)胞受到活性氧等多種外界因素刺激時,BAG3將被激活,表達(dá)量顯著上升,細(xì)胞凋亡被抑制,而當(dāng)BAG3的表達(dá)受到抑制時,細(xì)胞凋亡將增加;在人骨肉瘤細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞中,BAG3可以阻止IKK-γ進(jìn)入蛋白酶體依賴的蛋白降解途徑,維持NF-κB的持續(xù)激活從而促進(jìn)細(xì)胞存活;在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中,BAG3可以將BAX蛋白保留在細(xì)胞質(zhì)中,阻止其在線粒體外膜上形成孔道,起到抑制細(xì)胞凋亡的作用;在人髓系U937細(xì)胞中,BAG3蛋白表達(dá)水平的下調(diào)將顯著促進(jìn)DEM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究中,HO被用于誘導(dǎo)原頭蚴細(xì)胞凋亡,HO處理后原頭蚴體內(nèi)Eg-BAG3的相對轉(zhuǎn)錄水平隨著HO處理時間的延長顯著上調(diào),且在利用siRNA抑制Eg-BAG3表達(dá)水平后,原頭蚴細(xì)胞凋亡率相對于未干擾組原頭蚴而言顯著上調(diào),這表明抑制Eg-BAG3基因的表達(dá)將會促進(jìn)原頭蚴細(xì)胞凋亡,即Eg-BAG3具有抗凋亡作用。EB1蛋白作為Bax蛋白的激活因子,研究發(fā)現(xiàn)其可能具有促凋亡作用,如在HeLa 細(xì)胞中過表達(dá)EB1能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而下調(diào)EB1的表達(dá)則可以抑制細(xì)胞色素C的釋放從而抑制細(xì)胞凋亡;在前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)EB1可以顯著抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。在本研究中Eg-EB1的相對轉(zhuǎn)錄水平隨著HO處理時間的延長而顯著上調(diào),且在利用siRNA抑制Eg-EB1表達(dá)水平后,原頭蚴細(xì)胞凋亡率相對于未干擾組原頭蚴而言顯著降低,意味著抑制Eg-EB1的表達(dá)將會抑制原頭蚴細(xì)胞凋亡,即Eg-EB1具有促凋亡作用。

    不育囊的產(chǎn)生是細(xì)粒棘球蚴存在的一種獨特的生物學(xué)現(xiàn)象,目前研究發(fā)現(xiàn)不育囊的形成是多種因素共同作用下的結(jié)果,包括宿主的種類、年齡、生活環(huán)境、包囊在宿主體內(nèi)的寄生部位、基因型及宿主免疫反應(yīng)等,此外也有研究報道細(xì)胞凋亡可能與不育囊形成之間有著密切聯(lián)系。研究人員通過TUNEL分析和瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)不育囊生發(fā)層中的DNA片段化水平顯著高于可育囊,且不育囊生發(fā)層中caspase 3的酶活性也高于可育囊,提示細(xì)胞凋亡可能是誘導(dǎo)不育囊形成的原因之一;此外,相比于可育囊生發(fā)層而言,不育囊生發(fā)層表現(xiàn)出更嚴(yán)重的DNA氧化損傷,而且不育囊生發(fā)層中凋亡相關(guān)配體如TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)及Fas-L的表達(dá)水平顯著高于可育囊。鑒于細(xì)胞凋亡與細(xì)粒棘球蚴不育囊形成之間的密切聯(lián)系,且原頭蚴細(xì)胞來源于生發(fā)層細(xì)胞,Eg-BAG3和Eg-EB1分別對原頭蚴細(xì)胞凋亡起著抑制和促進(jìn)作用,因此Eg-BAG3和Eg-EB1也可能參與調(diào)控生發(fā)層細(xì)胞的凋亡,從而進(jìn)一步調(diào)控不育囊的形成。

    4 結(jié) 論

    Eg-BAG3和Eg-EB1分別屬于典型的BAG蛋白和內(nèi)吞蛋白。Eg-BAG3廣泛分布于蟲體的各個發(fā)育階段,而Eg-EB1僅分布于原頭蚴和包囊生發(fā)層,成蟲無分布,提示二者可能在細(xì)粒棘球絳蟲生長發(fā)育過程中起不同的作用。Eg-BAG3和Eg-EB1在HO誘導(dǎo)原頭蚴細(xì)胞凋亡的過程中轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào),當(dāng)二者表達(dá)被抑制后,Eg-BAG3干擾組原頭蚴細(xì)胞凋亡率明顯上升,而Eg-EB1干擾組原頭蚴細(xì)胞凋亡率下降,表明Eg-BAG3和Eg-EB1在HO誘導(dǎo)的原頭蚴細(xì)胞凋亡過程中分別起著抗凋亡和促凋亡作用,且二者可能進(jìn)一步參與調(diào)控不育囊的形成。

    猜你喜歡
    棘球包囊絳蟲
    鯽成魚絳蟲病治療一例
    羊絳蟲病的流行病學(xué)、臨床癥狀、診斷方法及其防治
    間充質(zhì)干細(xì)胞與細(xì)粒棘球絳蟲原頭節(jié)共培養(yǎng)對細(xì)粒棘球絳蟲原頭節(jié)活性的影響
    海洋甲藻包囊及沿革
    棘球?qū)俳{蟲線粒體基因組全序列生物信息學(xué)分析
    牛絳蟲病的診斷與防治
    腹腔鏡肝包囊摘除術(shù)的護(hù)理
    西藏科技(2015年6期)2015-09-26 12:12:12
    基于cox1基因?qū)χ袊嗖馗咴貐^(qū)細(xì)粒棘球絳蟲遺傳多態(tài)性的研究
    Ni 脅迫對斜紋夜蛾幼蟲包囊反應(yīng)的影響
    棘球?qū)俳{蟲分子種系發(fā)生研究進(jìn)展
    美女大奶头视频| 久久久久九九精品影院| 中文天堂在线官网| 最近最新中文字幕免费大全7| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲精品久久午夜乱码| 成年人午夜在线观看视频 | 国产单亲对白刺激| 国产成人精品一,二区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲电影在线观看av| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 一个人观看的视频www高清免费观看| 久99久视频精品免费| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 成人美女网站在线观看视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久这里只有精品中国| 丰满乱子伦码专区| 日韩欧美精品免费久久| 日本黄色片子视频| 免费人成在线观看视频色| 亚洲av二区三区四区| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲精品乱久久久久久| 免费观看无遮挡的男女| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲最大成人中文| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日韩大片免费观看网站| av在线播放精品| 亚洲成人久久爱视频| 国产色爽女视频免费观看| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲精品亚洲一区二区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产精品美女特级片免费视频播放器| 精品久久久久久久久久久久久| 久久精品国产亚洲av涩爱| 91久久精品电影网| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日本免费a在线| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久久a久久爽久久v久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 午夜福利在线在线| 国产男人的电影天堂91| 性插视频无遮挡在线免费观看| 天堂俺去俺来也www色官网 | 久久久久久久久大av| 69人妻影院| 国产乱来视频区| 国产淫语在线视频| 男人舔奶头视频| 国产成年人精品一区二区| 久久韩国三级中文字幕| 成人二区视频| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品一区二区性色av| 亚洲av.av天堂| 成人午夜高清在线视频| 青春草国产在线视频| 免费人成在线观看视频色| 日本免费在线观看一区| 99久久精品国产国产毛片| 欧美高清性xxxxhd video| 高清视频免费观看一区二区 | 特大巨黑吊av在线直播| 欧美高清成人免费视频www| 91久久精品电影网| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品久久视频播放| 极品教师在线视频| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩一本色道免费dvd| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 中文字幕亚洲精品专区| 国产精品99久久久久久久久| 国产极品天堂在线| 精品久久久久久久久av| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 一个人看的www免费观看视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 一级毛片久久久久久久久女| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美潮喷喷水| 精品一区二区三区人妻视频| 99久久中文字幕三级久久日本| av卡一久久| 亚洲精品中文字幕在线视频 | av一本久久久久| 久久久久精品性色| 中文字幕久久专区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩制服骚丝袜av| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲国产成人一精品久久久| 不卡视频在线观看欧美| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 免费黄色在线免费观看| 秋霞伦理黄片| 永久免费av网站大全| 国产精品人妻久久久影院| 国产在视频线精品| 国产在线一区二区三区精| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产精品福利在线免费观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 大片免费播放器 马上看| 青春草国产在线视频| 中文字幕久久专区| 免费av不卡在线播放| 国产免费一级a男人的天堂| 日韩欧美国产在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品人妻久久久久久| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 中文天堂在线官网| 亚洲熟女精品中文字幕| 丰满人妻一区二区三区视频av| 乱人视频在线观看| 在线观看免费高清a一片| 国产黄色视频一区二区在线观看| 内地一区二区视频在线| 成人欧美大片| 国产精品.久久久| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲av成人精品一二三区| 激情五月婷婷亚洲| 男女视频在线观看网站免费| 水蜜桃什么品种好| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 两个人的视频大全免费| 黄片wwwwww| 91久久精品国产一区二区成人| 国产v大片淫在线免费观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产一区二区在线观看日韩| 天天躁日日操中文字幕| 丝瓜视频免费看黄片| .国产精品久久| 亚洲av.av天堂| 大香蕉97超碰在线| 看黄色毛片网站| 日日啪夜夜撸| 免费看美女性在线毛片视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 搞女人的毛片| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲国产精品成人综合色| 内地一区二区视频在线| 大陆偷拍与自拍| 免费电影在线观看免费观看| 国产亚洲精品久久久com| 精品国内亚洲2022精品成人| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久精品综合一区二区三区| 久久人人爽人人片av| 亚洲无线观看免费| 久久国产乱子免费精品| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 色尼玛亚洲综合影院| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产淫语在线视频| 男人舔奶头视频| 国产综合精华液| 99久国产av精品| 国产成人freesex在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 一区二区三区乱码不卡18| 免费少妇av软件| 午夜福利网站1000一区二区三区| 男女国产视频网站| 欧美3d第一页| 黄色一级大片看看| 美女国产视频在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 国产探花在线观看一区二区| 91久久精品电影网| 亚洲av福利一区| 亚洲高清免费不卡视频| av女优亚洲男人天堂| 99热这里只有精品一区| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久久成人免费电影| 亚洲最大成人av| 成年人午夜在线观看视频 | 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 一级爰片在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 两个人视频免费观看高清| 老司机影院成人| 精品人妻熟女av久视频| 国产成人aa在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 日韩欧美一区视频在线观看 | 亚洲精品自拍成人| 久久人人爽人人爽人人片va| 乱系列少妇在线播放| 国产欧美日韩精品一区二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日日干狠狠操夜夜爽| 韩国av在线不卡| 三级国产精品片| 日本一本二区三区精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 中文天堂在线官网| 日韩大片免费观看网站| 搡老妇女老女人老熟妇| 乱系列少妇在线播放| 日本三级黄在线观看| 内射极品少妇av片p| 久久久亚洲精品成人影院| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久精品国产亚洲av天美| av在线亚洲专区| 两个人的视频大全免费| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 国产在线男女| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 哪个播放器可以免费观看大片| 我要看日韩黄色一级片| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲精品一区蜜桃| 少妇高潮的动态图| 国产成人aa在线观看| 老女人水多毛片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产午夜福利久久久久久| 日本黄大片高清| 国产精品久久久久久精品电影| 激情五月婷婷亚洲| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲av成人精品一区久久| 99re6热这里在线精品视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 午夜激情久久久久久久| 免费黄色在线免费观看| 看十八女毛片水多多多| 久久久国产一区二区| 免费看日本二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产高清国产精品国产三级 | 日韩av在线大香蕉| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 别揉我奶头 嗯啊视频| 边亲边吃奶的免费视频| 一区二区三区四区激情视频| 国产综合懂色| 精品人妻视频免费看| 午夜福利视频1000在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久这里只有精品中国| 精品人妻熟女av久视频| 看十八女毛片水多多多| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 国产精品.久久久| 精品久久久久久久久av| 午夜精品国产一区二区电影 | 哪个播放器可以免费观看大片| 日本欧美国产在线视频| 99re6热这里在线精品视频| 五月玫瑰六月丁香| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 永久网站在线| 久久99热这里只频精品6学生| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 伦精品一区二区三区| 日韩欧美三级三区| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲欧美清纯卡通| 色网站视频免费| 亚洲国产欧美人成| 日本三级黄在线观看| 日日啪夜夜撸| 最近手机中文字幕大全| 国产伦一二天堂av在线观看| 精品午夜福利在线看| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品综合久久久久久久免费| 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久99热这里只有精品18| 国产乱来视频区| 免费观看在线日韩| 搡老妇女老女人老熟妇| 成年女人在线观看亚洲视频 | 一级毛片我不卡| 麻豆成人av视频| 亚洲av福利一区| 亚洲人成网站在线播| 男女边摸边吃奶| 亚洲综合精品二区| 内射极品少妇av片p| 高清av免费在线| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲真实伦在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 色综合站精品国产| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产精品无大码| 成人av在线播放网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | a级一级毛片免费在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲一区高清亚洲精品| 边亲边吃奶的免费视频| av国产久精品久网站免费入址| 在线播放无遮挡| 国产一区亚洲一区在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲精品自拍成人| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲色图av天堂| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲三级黄色毛片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 干丝袜人妻中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲av福利一区| 国产久久久一区二区三区| 国产精品福利在线免费观看| 久久久久精品性色| 最近中文字幕2019免费版| av在线播放精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美日韩在线观看h| 亚洲人与动物交配视频| 免费观看av网站的网址| 久久韩国三级中文字幕| 国产成人一区二区在线| 一级a做视频免费观看| 老女人水多毛片| 最新中文字幕久久久久| 99热这里只有是精品在线观看| 欧美精品一区二区大全| 午夜免费激情av| 亚洲色图av天堂| 午夜亚洲福利在线播放| 国产午夜精品一二区理论片| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产免费视频播放在线视频 | 午夜免费激情av| 国产精品一区二区在线观看99 | 亚洲人成网站在线观看播放| 我的女老师完整版在线观看| 中文字幕制服av| freevideosex欧美| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲三级黄色毛片| 久久久成人免费电影| 亚洲国产色片| 亚洲欧美日韩东京热| 国产亚洲最大av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 哪个播放器可以免费观看大片| 99热这里只有是精品在线观看| 国产永久视频网站| 日本一二三区视频观看| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲精品久久午夜乱码| 午夜免费观看性视频| 婷婷色综合大香蕉| 久久国内精品自在自线图片| 国产午夜精品论理片| 伊人久久国产一区二区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲精品久久午夜乱码| 一级爰片在线观看| 国产黄频视频在线观看| 最近手机中文字幕大全| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲综合色惰| 99热6这里只有精品| 看免费成人av毛片| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产精品蜜桃在线观看| 国产乱人视频| 久久久久九九精品影院| 国产一区二区三区综合在线观看 | 如何舔出高潮| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久精品久久久久久久性| 永久免费av网站大全| 一本一本综合久久| 欧美三级亚洲精品| 久久久久九九精品影院| 欧美最新免费一区二区三区| 男女视频在线观看网站免费| 精品酒店卫生间| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 99re6热这里在线精品视频| 欧美一区二区亚洲| 国产午夜精品一二区理论片| 国产精品三级大全| 黄色欧美视频在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲图色成人| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精品蜜桃在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 国产一级毛片在线| 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精品,欧美精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 老司机影院成人| 国产免费一级a男人的天堂| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 插逼视频在线观看| 成人无遮挡网站| 成人亚洲欧美一区二区av| av卡一久久| .国产精品久久| 97热精品久久久久久| 国产高清不卡午夜福利| 一级毛片我不卡| 九九在线视频观看精品| 成人无遮挡网站| 精品国产露脸久久av麻豆 | 久久久久国产网址| 欧美zozozo另类| 看十八女毛片水多多多| 亚洲高清免费不卡视频| 色网站视频免费| 久久久久九九精品影院| 亚洲第一区二区三区不卡| 五月天丁香电影| 中文天堂在线官网| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日日啪夜夜撸| 国产69精品久久久久777片| 深夜a级毛片| 免费看日本二区| 日韩中字成人| 亚洲久久久久久中文字幕| 日韩制服骚丝袜av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲av成人精品一二三区| 精品久久久久久久久久久久久| 免费电影在线观看免费观看| 国产日韩欧美在线精品| 日韩av免费高清视频| 久久这里有精品视频免费| a级毛片免费高清观看在线播放| 97超碰精品成人国产| 青青草视频在线视频观看| 看免费成人av毛片| 性插视频无遮挡在线免费观看| av福利片在线观看| 春色校园在线视频观看| 成人毛片60女人毛片免费| 欧美xxxx性猛交bbbb| 2022亚洲国产成人精品| 国产单亲对白刺激| 最新中文字幕久久久久| 又爽又黄a免费视频| 五月玫瑰六月丁香| 国产伦精品一区二区三区四那| 淫秽高清视频在线观看| 欧美+日韩+精品| 一二三四中文在线观看免费高清| 我的老师免费观看完整版| 又爽又黄无遮挡网站| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 又爽又黄a免费视频| 国产男人的电影天堂91| 赤兔流量卡办理| 欧美性感艳星| 国产毛片a区久久久久| 性插视频无遮挡在线免费观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| av女优亚洲男人天堂| 国产极品天堂在线| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲美女视频黄频| 国产高清三级在线| 一边亲一边摸免费视频| 午夜视频国产福利| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 九草在线视频观看| 成人无遮挡网站| 1000部很黄的大片| 久久人人爽人人片av| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲av免费在线观看| 久久这里有精品视频免费| 18禁在线播放成人免费| 黄色配什么色好看| 能在线免费看毛片的网站| 1000部很黄的大片| 99热这里只有是精品在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 少妇的逼好多水| 色5月婷婷丁香| 午夜福利视频精品| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 深夜a级毛片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 在线播放无遮挡| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 全区人妻精品视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 2018国产大陆天天弄谢| 国产成人一区二区在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品一二三区在线看| 热99在线观看视频| 亚洲在线观看片| 国产精品三级大全| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产午夜福利久久久久久| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲成人中文字幕在线播放| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲欧洲日产国产| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲欧美清纯卡通| 久久久午夜欧美精品| 亚洲精品国产av蜜桃| 97超视频在线观看视频| 18+在线观看网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 有码 亚洲区| 亚洲性久久影院| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 午夜福利高清视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 黑人高潮一二区| 亚洲成色77777| 三级国产精品片| 亚洲自偷自拍三级| 伦理电影大哥的女人| 亚洲国产色片| av国产免费在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 最近视频中文字幕2019在线8| 99久久九九国产精品国产免费| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲人成网站高清观看| 18禁在线播放成人免费| 亚洲成人av在线免费| 免费黄色在线免费观看| 亚洲av成人精品一二三区| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产av国产精品国产| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 久久久久久久久久久丰满| 夫妻午夜视频| 大香蕉久久网| 在线免费十八禁| 精华霜和精华液先用哪个| 国产日韩欧美在线精品| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产av码专区亚洲av| 韩国av在线不卡| 色综合亚洲欧美另类图片| 赤兔流量卡办理| 欧美成人a在线观看| 久久热精品热| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 久久人人爽人人爽人人片va| 不卡视频在线观看欧美| 日本欧美国产在线视频| 日韩欧美精品v在线| 久久久久久久亚洲中文字幕| 69人妻影院| 久久精品人妻少妇| 亚洲天堂国产精品一区在线|