人氨基肽酶N在豬丁型冠狀病毒感染HEK293細(xì)胞中的作用

趙玉佳，陳 汭，宋代麗，張路文，肖 黛，李施倩，文翼平，伍 銳，趙 勤，杜森焱，顏其貴，文心田，曹三杰,2,3，黃小波,2,3*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心，成都 611130；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與獸醫(yī)診斷技術(shù)四川科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家級(jí)動(dòng)物類實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，成都 611130)

丁型冠狀病毒(deltacoronavirus)是新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒科()，丁型冠狀病毒屬()成員，可以感染哺乳動(dòng)物和禽類。2009年，Woo等發(fā)現(xiàn)3種禽丁型冠狀病毒：夜鶯冠狀病毒HKU11、畫(huà)眉冠狀病毒HKU12和文鳥(niǎo)冠狀病毒HKU13。2012年，Woo等在豬和鳥(niǎo)群中鑒定出7種新型丁型冠狀病毒，對(duì)豬冠狀病毒HKU15-44和HKU15-155毒株13、和基因序列分析顯示其與亞洲豹貓冠狀病毒相似性高達(dá)99.8%，說(shuō)明PDCoV在野生小型哺乳動(dòng)物和豬之間可能存在跨種傳播。2014年，美國(guó)暴發(fā)豬丁型冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)感染。隨后，韓國(guó)、加拿大、泰國(guó)、越南、日本和中國(guó)等國(guó)家也報(bào)道PDCoV引起的仔豬腹瀉性疾病。當(dāng)前，已報(bào)道的PDCoV毒株全基因組序列相對(duì)保守，序列分析表明，PDCoV可能起源于麻雀丁型冠狀病毒(sparrow deltacoronavirus，SpCoV)。此外，美國(guó)報(bào)道的4種新型SpCoV與PDCoV親緣關(guān)系更為密切，表明PDCoV在豬和禽類之間也可能發(fā)生跨種傳播。

PDCoV是引起豬腸道疾病的主要病原，可感染各年齡階段的豬，感染仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、脫水和死亡等臨床癥狀，影響全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。人工接種PDCoV還可感染牛、雞和火雞等多種動(dòng)物。體外試驗(yàn)證實(shí)，病毒也可感染豬源細(xì)胞(LLC-PK、PK15、ST、IPEC和IPI-2I)、人源細(xì)胞(Huh7和Hela)、禽源細(xì)胞(LMH和DF-1)、牛源細(xì)胞(PBK和PBH)、猴源細(xì)胞(Vero-CCL81)和犬源細(xì)胞(MDCK)等多種細(xì)胞，顯示PDCoV具有廣泛的跨宿主傳播風(fēng)險(xiǎn)。

氨基肽酶N(aminopeptidase N，APN)，又稱CD13，是一種膜結(jié)合的金屬蛋白酶，可與冠狀病毒S蛋白結(jié)合，介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞。甲型冠狀病毒中，傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、貓冠狀病毒(feline coronavirus，F(xiàn)CoV)、犬冠狀病毒(canine coronavirus，CCoV)和人冠狀病毒229E(human coronavirus 229E，HCoV-229E)被鑒定出以APN作為功能受體。此外，APN作為冠狀病毒受體具有種屬特異性。有研究表明，HCoV-229E以hAPN作為受體，而不能以豬APN(porcine APN，pAPN)作為受體。貓APN(feline APN，fAPN)可與TGEV、CCoV、HCoV-229E和FCoV結(jié)合。但是，APN在PDCoV入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中是否發(fā)揮受體功能存在爭(zhēng)議。Li等構(gòu)建APN基因敲除細(xì)胞證明APN是PDCoV感染多種動(dòng)物細(xì)胞的功能受體，病毒可通過(guò)S蛋白的S1結(jié)構(gòu)域與APN的催化區(qū)域發(fā)生互作。Wang等也證明，pAPN在PDCoV入侵細(xì)胞中發(fā)揮受體功能。與之相反，部分研究結(jié)果卻證明，APN不是PDCoV的受體。也有研究顯示，APN雖不是PDCoV的關(guān)鍵受體，但其能影響PDCoV的早期感染和增殖過(guò)程。另外，Stoian等卻認(rèn)為APN是PDCoV感染細(xì)胞的一個(gè)非必需細(xì)胞受體。

為驗(yàn)證hAPN在PDCoV復(fù)制中的作用，本研究首先證實(shí)PDCoV可感染HEK293細(xì)胞，再進(jìn)一步構(gòu)建hAPN基因敲除細(xì)胞系和hAPN過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，驗(yàn)證hAPN在PDCoV復(fù)制中的作用。通過(guò)同源建模和分子對(duì)接模擬PDCoV S 蛋白與hAPN蛋白的相互作用，為闡述PDCoV的細(xì)胞入侵機(jī)制和跨種傳播提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒和主要試劑

HEK293、HEK293T和ST細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室凍存；PDCoV四川分離株CHN-SC2015(GenBank收錄號(hào)：MK355396.1)由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。pCMV-SPORT6-ANPEP質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；兔抗ACTB多克隆抗體(AC026)，HRP-羊抗兔IgG(AS014)，HRP-羊抗鼠IgG(AS003)：武漢Abclonal公司；鼠抗ANPEP單克隆抗體(sc-166105)：Santa Cruz公司；兔抗PDCoV N多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.2 PDCoV感染HEK293細(xì)胞

將PDCoV以MOI=0.1接種60 mm培養(yǎng)皿中的HEK293細(xì)胞，37 ℃吸附1 h，PBS洗2遍，加維持液繼續(xù)培養(yǎng)。于0、12、24、36和48 h取樣，通過(guò)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)PDCoV感染HEK293細(xì)胞后的病毒含量；將PDCoV感染HEK293細(xì)胞24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次后，連續(xù)傳至4代，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)PDCoV在HEK293細(xì)胞上的增殖情況，TCID檢測(cè)不同代次的病毒滴度。

1.3 hAPN基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定

參考hAPN基因(NC_000015)序列，利用網(wǎng)絡(luò)在線工具(http://chopchop.cbu.uib.no/)設(shè)計(jì)一對(duì)sgRNA(表1)。合成的sgRNA經(jīng)退火處理，連接到B Ⅰ酶切的線性化載體lenti CRISPR v2，構(gòu)建同時(shí)表達(dá)Cas9和sgRNA的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。用Lipofectamine 3000將質(zhì)粒按重組質(zhì)粒∶psPAX2∶pMD2.G=5∶3∶2的比例共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，48 h后收上清。待T25細(xì)胞瓶中HEK293細(xì)胞長(zhǎng)至50%時(shí)，感染慢病毒，36 h后，用含1 μg·mL嘌呤霉素(puromycin)的完全培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選；有限稀釋法挑選hAPN基因敲除細(xì)胞系，將其命名為hAPN。通過(guò)測(cè)序、RT-qPCR和Western blot鑒定hAPN在HEK293細(xì)胞上的敲除情況。

表1 相關(guān)引物序列

1.4 細(xì)胞活性鑒定

按照10·孔的細(xì)胞數(shù)將野生型細(xì)胞(hAPN)和敲除細(xì)胞(hAPN)接種96孔細(xì)胞板，24 h后，避光條件下，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h，測(cè)定450 nm的吸光度。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，As：試驗(yàn)孔(hAPN細(xì)胞孔)；Ac：對(duì)照孔(hAPN細(xì)胞孔)；Ab：空白孔(培養(yǎng)基)。

1.5 敲除hAPN對(duì)PDCoV復(fù)制的影響

待60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中hAPN和hAPN長(zhǎng)滿單層后，PBS洗2遍，將PDCoV以MOI=0.1的劑量感染細(xì)胞，37 ℃孵育1 h，棄病毒液，每孔加入4 mL維持液，于24 h收集細(xì)胞懸液和蛋白，細(xì)胞懸液用RT-qPCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平；蛋白樣品用Western blot檢測(cè)N蛋白表達(dá)水平。

1.6 過(guò)表達(dá)hAPN對(duì)PDCoV復(fù)制的影響

針對(duì)hAPN基因的CDs區(qū)設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后連接到載體pIRES2-EGFP，構(gòu)建hAPN過(guò)表達(dá)真核載體(命名為pIRES2-EGFP-hAPN)。待HEK293細(xì)胞長(zhǎng)至50%時(shí)，用Lipofectamine 3000分別轉(zhuǎn)染4 μg質(zhì)粒pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-hAPN至HEK293細(xì)胞；轉(zhuǎn)染24 h后，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況；收集細(xì)胞和細(xì)胞蛋白，分別用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)hAPN表達(dá)。以MOI為0.1的PDCoV感染轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hAPN的HEK293細(xì)胞，同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP空載的HEK293細(xì)胞為對(duì)照，24 h后，收集細(xì)胞懸液和蛋白，細(xì)胞懸液通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平；蛋白樣品通過(guò)Western blot檢測(cè)N蛋白表達(dá)水平。

1.7 同源建模與分子對(duì)接

hAPN蛋白(PDB ID：4FYQ)、PDCoV S蛋白(PDB ID：6B7 N)和HCoV-229E S(PDB ID：6U7H)的整體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取(https://www.rcsb.org)。用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)手動(dòng)構(gòu)建PDCoV S蛋白和HCoV-229E S蛋白的單體結(jié)構(gòu)和受體結(jié)構(gòu)域(receptor binding domain，RBD)，用PyMOL對(duì)hAPN、PDCoV S和HCoV-229E S蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析；用MEGA6、ESPrit 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php)和PyMOL的align功能對(duì)PDCoV和HCoV-229E S蛋白的RBD進(jìn)行序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)。用分子對(duì)接方法模擬PDCoV S1蛋白與hAPN蛋白的相互作用。

1.8 TCID50測(cè)定

取100 μL病毒液，按照10倍梯度進(jìn)行倍比稀釋，共稀釋7個(gè)梯度，每個(gè)稀釋度設(shè)置8個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。待96孔細(xì)胞板中的ST細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，PBS洗2遍，加入100 μL稀釋好的病毒液，37 ℃孵育1.5 h，棄病毒液，加入150 μL含5 μg·mL胰酶的維持液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察4 d，按照Reed&Muench方法計(jì)算TCID。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 PDCoV在HEK293細(xì)胞中的增殖情況

將PDCoV以MOI=0.1感染HEK293細(xì)胞，收取0、12、24、36和48 h的樣品，RT-qPCR檢測(cè)病毒含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒感染細(xì)胞12～36 h時(shí)，病毒快速增殖，36 h達(dá)到頂峰；36～48 h，出現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖1A)；此外，在0～24 h，病毒N蛋白表達(dá)水平也迅速增加(圖1C)。將PDCoV在HEK293細(xì)胞上連續(xù)傳至4代，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)當(dāng)傳至第3代時(shí)，只能檢測(cè)到很弱的條帶，而傳至第4代時(shí)，檢測(cè)不到條帶(圖1B)；Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PDCoV傳至2代時(shí)，仍可檢測(cè)到很弱的病毒N蛋白表達(dá)水平(圖1D)；TCID結(jié)果表明，PDCoV在HEK293細(xì)胞上第1代滴度約為4.36 lg TCID·mL，傳至2代時(shí)，病毒滴度稍微下降，約為3 lg TCID·mL(圖1E)，表明PDCoV可感染HEK293細(xì)胞，但是不能在HEK293細(xì)胞上穩(wěn)定傳代。

A.RT-qPCR檢測(cè)PDCoV在HEK293細(xì)胞上的增殖情況；B.RT-PCR檢測(cè)PDCoV在HEK293細(xì)胞上的傳代；C.Western blot檢測(cè)PDCoV感染細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的N蛋白表達(dá)水平；D.Western blot檢測(cè)PDCoV感染HEK293細(xì)胞不同代次的N蛋白表達(dá)水平；E.TCID50檢測(cè)PDCoV感染HEK293細(xì)胞不同代次的病毒滴度

2.2 hAPN基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建和鑒定

用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建hAPN基因敲除細(xì)胞系，通過(guò)測(cè)序、RT-qPCR和Western blot檢測(cè)hAPN在HEK293細(xì)胞上的敲除情況。測(cè)序結(jié)果顯示，hAPN細(xì)胞系在PAM序列前出現(xiàn)明顯的重疊峰，且存在23個(gè)堿基的連續(xù)缺失(圖2A)；RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，在hAPN細(xì)胞上幾乎檢測(cè)不到hAPN基因表達(dá)(圖2B、C)，表明hAPN在HEK293細(xì)胞上缺失成功。細(xì)胞活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，hAPN和hAPN的活性無(wú)差異(圖2D)，表明敲除hAPN對(duì)HEK293細(xì)胞活性無(wú)影響。

A.hAPNWT和hAPNKO細(xì)胞中hAPN基因的序列測(cè)定；B.RT-qPCR檢測(cè)hAPNKO細(xì)胞的hAPN基因mRNA水平(***.P<0.001)；C.Western blot檢測(cè)hAPNKO細(xì)胞的hAPN蛋白表達(dá)水平；D.CCK-8檢測(cè)hAPNWT和hAPNKO細(xì)胞的細(xì)胞活性(ns.P>0.05)

2.3 敲除hAPN可降低PDCoV復(fù)制

為驗(yàn)證hAPN敲除對(duì)PDCoV復(fù)制的影響，將PDCoV以MOI=0.1感染hAPN和hAPN細(xì)胞，24 h后，測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄水平和N蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，hAPN基因敲除后，導(dǎo)致基因mRNA水平下調(diào)約75%(圖3 A)，N蛋白表達(dá)水平下降約66%(圖3 B)，證實(shí)hAPN敲除能夠顯著抑制PDCoV復(fù)制。

A.RT-qPCR檢測(cè)敲除hAPN后PDCoV M基因mRNA水平(***.P<0.001)；B.Western blot檢測(cè)敲除hAPN后PDCoV N蛋白表達(dá)水平

2.4 過(guò)表達(dá)hAPN可促進(jìn)PDCoV復(fù)制

為進(jìn)一步驗(yàn)證hPAN過(guò)表達(dá)對(duì)PDCoV復(fù)制的影響，構(gòu)建hAPN真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hAPN，轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，24 h后，可以觀察到明顯的綠色熒光(圖4 A)。RT-qPCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，hAPN在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)(圖4 B、C)。將pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-hAPN分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24 h后，接種PDCoV，病毒感染24 h后，RT-qPCR和Western blot檢測(cè)表明，過(guò)表達(dá)hAPN導(dǎo)致M基因mRNA水平上調(diào)2.7倍，N蛋白表達(dá)水平上調(diào)1.7倍(圖4 D、E)，表明過(guò)表達(dá)hAPN促進(jìn)PDCoV復(fù)制。

A.熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)(標(biāo)尺=100 μm)；B.RT-qPCR檢測(cè)HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hAPN后hAPN基因mRNA水平(***.P<0.001)；C.Western blot檢測(cè)HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hAPN后hAPN蛋白表達(dá)水平；D.RT-qPCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)hAPN后M基因mRNA水平(***.P<0.001)；E.Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)hAPN后N蛋白表達(dá)水平。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖

2.5 hAPN與PDCoV S蛋白的互作分析

為分析hAPN和PDCoV S蛋白的互作關(guān)系，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲取hAPN和PDCoV S的三聚體結(jié)構(gòu)(圖5 A、G)；PDCoV S蛋白的單體結(jié)構(gòu)及其主要結(jié)構(gòu)域包括C-末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain，CTD)、N-末端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain，NTD)、融合肽(fusion peptide，F(xiàn)P)、七肽重復(fù)序列(heptad repeat，HR)(圖5 B)。HCoV-229E和PDCoV S1 RBD，包含6個(gè)β-折疊和3個(gè)短而不連續(xù)的環(huán)組成的受體結(jié)合基序(receptor binding motifs，RBM)(圖5 C、D)。序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)PDCoV和HCoV-229E S1 RBD具有相似的空間結(jié)構(gòu)，表明PDCoV RBD與hAPN的結(jié)合可能類似HCoV-229E RBD和hAPN的結(jié)合(圖5 E、F)。分子對(duì)接結(jié)果表明，PDCoV S1 RBD能夠結(jié)合hAPN結(jié)構(gòu)域Ⅱ，主要是S1蛋白的RBM1氨基酸殘基TYR、THR、THR、PHE和MET通過(guò)氫鍵與hAPN的氨基酸殘基PHE、GLN、ARG和SER結(jié)合(圖5 G、H)。

A.PDCoV S 蛋白整體結(jié)構(gòu)；B.PDCoV S 蛋白單體結(jié)構(gòu)；C.HCoV-229E S1 RBD；D.PDCoV S1 RBD；E.HCoV-229E和PDCoV S1 RBD結(jié)構(gòu)比對(duì)；F.HCoV-229E和PDCoV S1 RBD序列比對(duì)；G～H.分子對(duì)接模擬PDCoV S1 RBD和hAPN蛋白的互作。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖

3 討 論

PDCoV是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種豬冠狀病毒，人工接種PDCoV能夠感染豬、牛、雞和火雞等多種動(dòng)物。PDCoV感染仔豬后引起明顯的腹瀉癥狀，而感染小雞后腹瀉癥狀較輕，接種PDCoV的小牛甚至未出現(xiàn)腹瀉和其他臨床癥狀。Lednicky等在兒童血清樣品中檢測(cè)到變異的PDCoV，首次報(bào)道了PDCoV可感染人。鑒于PDCoV在豬群的廣泛流行和跨宿主傳播風(fēng)險(xiǎn)，研究宿主細(xì)胞蛋白在PDCoV復(fù)制中的作用具有重要意義。過(guò)表達(dá)hAPN、fAPN、pAPN、cAPN顯著增加細(xì)胞對(duì)PDCoV的易感性。APN在不同腸段中的差異表達(dá)與PDCoV腸道組織嗜性也密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)敲除hAPN降低PDCoV復(fù)制，而過(guò)表達(dá)hAPN促進(jìn)PDCoV復(fù)制，表明hAPN是影響PDCoV復(fù)制的重要宿主細(xì)胞因子，豐富了PDCoV跨種傳播和致病機(jī)制理論。

S蛋白是冠狀病毒入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白，在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，S蛋白構(gòu)象的變化能促進(jìn)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合。此外，宿主細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境和蛋白水解酶對(duì)S蛋白的活化也是病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合所必需的。胰蛋白酶可通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞之間的融合而促進(jìn)PDCoV增殖，但在病毒入侵細(xì)胞的過(guò)程中不發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，PDCoV通過(guò)胰蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞膜表面入侵ST和IPI-2I細(xì)胞的效率明顯高于內(nèi)吞體途徑。HEK293細(xì)胞是由剪切過(guò)的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)染的人胚腎細(xì)胞形成的細(xì)胞系，HEK293 T細(xì)胞是能夠穩(wěn)定表達(dá)SV40 T抗原的HEK293衍生細(xì)胞系。PEDV可以感染HEK293細(xì)胞，且與Vero細(xì)胞上的增殖特點(diǎn)相似。此外，黃病毒科成員，日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)和黃熱病毒(yellow fever virus，YFV)也可感染HEK293T細(xì)胞。由于HEK293細(xì)胞貼壁能力弱，對(duì)胰蛋白酶的耐受程度較弱，本研究在不添加胰蛋白酶的情況下，發(fā)現(xiàn)PDCoV可在HEK293細(xì)胞至少傳至2代，表明PDCoV可不依賴于胰蛋白酶入侵HEK293細(xì)胞。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是新發(fā)現(xiàn)的一種基因編輯工具，廣泛應(yīng)用于研究宿主因子在病毒復(fù)制中的作用。近年來(lái)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也被應(yīng)用于篩選調(diào)節(jié)病毒復(fù)制的相關(guān)宿主因子。關(guān)于APN是否為PDCoV入侵宿主細(xì)胞的受體存在爭(zhēng)議。本研究為驗(yàn)證hAPN在PDCoV毒株CHN-SC2015復(fù)制中的作用，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建hAPN敲除細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)hAPN敲除導(dǎo)致PDCoV基因mRNA水平下調(diào)約75%，N蛋白表達(dá)水平下降約66%。本研究還通過(guò)hAPN過(guò)表達(dá)驗(yàn)證其對(duì)病毒復(fù)制的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)hAPN可導(dǎo)致PDCoV基因mRNA水平上調(diào)2.7倍，N蛋白表達(dá)水平上調(diào)1.7倍，證實(shí)hAPN可明顯促進(jìn)PDCoV復(fù)制。

冠狀病毒S蛋白主要由S1和S2結(jié)構(gòu)域組成，其中S1主要負(fù)責(zé)識(shí)別受體，而S2介導(dǎo)宿主細(xì)胞膜與病毒囊膜的融合。有研究表明，冠狀病毒S1 RBD可以與APN結(jié)合，介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞。HCoV-229E與hAPN的胞外域Ⅱ結(jié)合，而TGEV主要與pAPN的胞外域Ⅳ結(jié)合。pAPN結(jié)構(gòu)域Ⅶ(581—967 aa)在PEDV復(fù)制中發(fā)揮重要作用。在PDCoV研究中，Zhu等發(fā)現(xiàn)PDCoV S1-CTD蛋白可結(jié)合pAPN。本研究通過(guò)序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)PDCoV與HCoV-229E S1 RBD具有相似的空間結(jié)構(gòu)，表明PDCoV可能與hAPN結(jié)合。因此，本研究通過(guò)分子對(duì)接方法模擬PDCoV S1 RBD與hAPN的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)PDCoV S1 RBD能夠通過(guò)RBM1與hAPN結(jié)構(gòu)域Ⅱ結(jié)合。

4 結(jié) 論

PDCoV可以感染HEK293細(xì)胞，宿主細(xì)胞因子hAPN表達(dá)可促進(jìn)PDCoV復(fù)制。此外，PDCoV S1 RBD可通過(guò)RBM1氨基酸殘基TYR、THR、THR、PHE和MET與hAPN蛋白的氨基酸殘基PHE、GLN、ARG和SER結(jié)合，證實(shí)了hAPN是影響PDCoV復(fù)制的一個(gè)重要宿主細(xì)胞因子。