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    化學(xué)發(fā)光免疫檢驗應(yīng)用進展以及在腫瘤標志物檢測中的應(yīng)用

    2022-05-29 14:34:35韋桂海
    中國藥學(xué)藥品知識倉庫 2022年10期
    關(guān)鍵詞:應(yīng)用

    韋桂海

    摘要:化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)具有靈敏度高、特異性強、分析速度快、線性范圍寬、操作簡便、不需要十分昂貴的儀器設(shè)備等特點。廣泛運用于醫(yī)療臨床診斷和食品安全檢測等不同方面,既可檢測不同分子大小的抗原、半抗原和抗體,又可用于核酸探針的檢測。根據(jù)放射免疫分析的基本原理,將高靈敏的化學(xué)發(fā)光技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)結(jié)合起來,該文綜述了化學(xué)發(fā)光免疫分析法的發(fā)展以及在腫瘤標志物檢測中的應(yīng)用的現(xiàn)狀,并展望了化學(xué)發(fā)光免疫分析法的研究前景。

    關(guān)鍵詞:化學(xué)發(fā)光免疫分析;發(fā)光體系;應(yīng)用

    【中圖分類號】 R73 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306(2022)10--02

    化學(xué)發(fā)光免疫分析法是一種結(jié)合化學(xué)發(fā)光和免疫分析的檢測方法,不僅操作簡單、檢測速度快,而且具備較高的檢測靈敏度與特異度。且在各領(lǐng)域均取得了較好的應(yīng)用效果?;瘜W(xué)發(fā)光免疫分析檢測體系目前已趨于成熟[1]。但在實際臨床應(yīng)用過程中,傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光免疫分析法往往無法達到大量復(fù)雜樣品和低分子量毒性樣品的測定分析工作,故目前急需對化學(xué)發(fā)光免疫分析法進行優(yōu)化,以提升其檢測效果。本文旨在綜述新型化學(xué)發(fā)光免疫分析法以及在腫瘤標志物檢測中的應(yīng)用的現(xiàn)狀,并展望了化學(xué)發(fā)光免疫分析法的研究前景。

    1.化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的基本原理

    化學(xué)發(fā)光免疫分析含有免疫分析和化學(xué)發(fā)光分析兩個系統(tǒng)部分[2]。免疫分析技術(shù)就是使用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)對分析的抗原抗體復(fù)合物進行標記,而化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)是指使用氧化劑或酶的發(fā)光底物使化學(xué)發(fā)光物質(zhì)氧化從而形成一個處于激發(fā)態(tài)的中間體,根據(jù)發(fā)光強度使用發(fā)光信號測量儀器進行檢測。根據(jù)化學(xué)發(fā)光標記物與發(fā)光強度的關(guān)系,便可以知道內(nèi)部所發(fā)生的化學(xué)變化,可利用標準曲線計算出被測物的含量[3]。

    CLIA 所使用的標記物可分為三類 :① 發(fā)光免疫分析反應(yīng)中直接參與發(fā)光反應(yīng)的標記物;② 以能量傳遞或催化作用參與發(fā)光反應(yīng)的酶標記物;③以能量傳遞參與氧化反應(yīng)的非酶標記物。其常用的標記酶主要為堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶(HRP),這兩種標記酶都具有自身相應(yīng)的化學(xué)發(fā)光底物,在實際臨床工作中得到了非常廣泛的應(yīng)用[4]。目前的研究方向毫無疑問必然是向穩(wěn)定性更好、催化活性更強、發(fā)光動力學(xué)曲線更符合免疫分析的底物和酶進行開發(fā),必將是化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的一個研究重點。目前科學(xué)家通過大量實驗得到luminol—H2O2在HRP2A的催化下可以發(fā)出強度和持續(xù)時間較長的光,而且發(fā)光的穩(wěn)定性非常好[5]。納米粒子對不同種生物的排斥性較低,同時具有信號放大作用,在生物標記中納米技術(shù)的應(yīng)用范圍廣泛。利用金納米粒子對抗體進行標記,能讓luminol—H2O2體系的化學(xué)發(fā)光強度增強。

    2.化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的分類

    2.1磁性納米粒子(MPS)

    在化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的免疫分析過程中,分離抗原-抗體免疫復(fù)合物較為困難,通常需耗費較長的時間,且操作步驟煩瑣,導(dǎo)致其本身費時費力因此性價比較低[6]。該方法通過將磁性微粒引入化學(xué)發(fā)光免疫分析法中,使其成為免疫反應(yīng)和分離的固相載體,從而起到減少抗原-抗體免疫復(fù)合物分離時間的目的。當磁性微粒與抗體相連后,通過免疫反應(yīng)即可捕獲靶物質(zhì),由此形成免疫復(fù)合物,受外加磁場作用后,免疫復(fù)合物便會發(fā)生滯留,進而達到分離的效果,同時,還可降低樣品中基質(zhì)對檢測產(chǎn)生的干擾[7]。目前,基于磁性微粒的化學(xué)發(fā)光免疫分析法在癌胚抗原、甲胎蛋白、皮質(zhì)醇等物質(zhì)的檢測中已得到了廣泛的應(yīng)用。相關(guān)研究表明,相較于化學(xué)發(fā)光免疫分析法,應(yīng)用基于磁性微粒的化學(xué)發(fā)光免疫分析法,不但能減少反應(yīng)試劑用量,還可縮短反應(yīng)時間,降低背景值,提高靈敏度[8]。在基于磁性微粒的化學(xué)發(fā)光免疫分析法中,磁性微粒的表面修飾有利于提高檢測效率,其不僅可直接修飾抗體,還可應(yīng)用于鏈霉親和素放大體系、異硫氰酸熒光素的異硫氰酸熒光素-抗異硫氰酸熒光素體系[9]。

    2.2金納米粒子

    在實施化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測時,金納米粒子可對luminol—H2O2發(fā)光體系內(nèi)自由基的產(chǎn)生與電子轉(zhuǎn)移起到較為強力的催化作用,增強化學(xué)發(fā)光反應(yīng),從而進一步提高檢測靈敏度。有學(xué)者分析了金納米粒子在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中的作用,發(fā)現(xiàn)金納米粒子的引入可使luminol—H2O2發(fā)光體系內(nèi)發(fā)光反應(yīng)的信號強度提升4倍以上,表明金納米粒子可催化luminol—H2O2發(fā)光反應(yīng)[10]。有研究指出,應(yīng)用酶標記抗體修飾金納米粒子后,將其用作反應(yīng)抗體來檢測癌胚抗原,其靈敏度較常規(guī)化學(xué)發(fā)光免疫分析法提升了1000倍以上[11]。由此可知,金納米粒子的應(yīng)用不僅可促進自由基的產(chǎn)生及電子轉(zhuǎn)移,而且可作為信號放大載體,增強發(fā)光信號,對于增強化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的靈敏度具有直接的促進作用[12]。

    2.3與微陣列芯片技術(shù)的聯(lián)合

    化學(xué)發(fā)光免疫分析將靈敏的化學(xué)發(fā)光測量技術(shù)與高度特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合,用于檢測和分析檢測到的各種物質(zhì)。微陣列芯片利用光導(dǎo)原位合成或微點樣方法,將核酸片段、肽分子,甚至組織切片、細胞等生物樣品等大量生物聚合物有序固化在由高密度二維分子排列組成的載體表面,與標記生物樣品中的目標分子發(fā)生反應(yīng)。它通過特定設(shè)備實現(xiàn)快速、并行和高效地檢測并分析相應(yīng)信號的強度,以確定樣品中目標分子的數(shù)量。一些學(xué)者對硅烷處理過的玻璃微陣列芯片進行了化學(xué)發(fā)光免疫分析。在每個檢測孔中放置與待測物對應(yīng)的抗體,引入金納米粒子實現(xiàn)催化作用,同時檢測甲胎蛋白和癌胚抗原,CA125 和CA153蛋白質(zhì),結(jié)果顯示在48分鐘內(nèi)測試了48個樣品,并改善了金納米粒子的干預(yù)[13]。提高信號強度,實現(xiàn)高靈敏度、高通量檢測。一些研究人員使用化學(xué)發(fā)光免疫測定法檢測硅烷處理過的玻璃芯片上的CA199蛋白,結(jié)果良好[14]。微陣列芯片技術(shù)被證明是實現(xiàn)化學(xué)發(fā)光免疫測定高通量檢測的重要技術(shù)。

    2.4與免疫層析技術(shù)的聯(lián)合

    免疫層析的原理是將特異性抗體固定在硝酸纖維素膜的某一區(qū)域。當干燥的硝化纖維一端浸入樣品(尿液或血清)中時,基于毛細現(xiàn)象,樣品會沿著膜向前移動,當它移動到固定抗體的區(qū)域時,相應(yīng)的抗原在樣品與抗體特異性結(jié)合。如果使用免疫金或免疫酶染色,該區(qū)域可以顯示一定的顏色以達到特異性免疫診斷。有學(xué)者將化學(xué)發(fā)光免疫分析與免疫層析技術(shù)相結(jié)合,定量檢測沙丁胺醇和萊克多巴胺[15]。首先將酶標萊克多巴胺抗體和沙丁胺醇抗體固定在層析膜的結(jié)合區(qū),然后將沙丁胺醇固定在兩個檢測區(qū)-牛血清白蛋白上,然后用萊克多巴胺-牛血清白蛋白固定將樣品滴在硝酸纖維素膜的一端,樣品流入固定抗體的結(jié)合區(qū),使樣品中的抗原與抗體結(jié)合,多余的未結(jié)合的酶標抗體會繼續(xù)流動并進入檢測區(qū)域分別結(jié)合沙丁胺醇-牛血清白蛋白和萊克多巴胺-牛血清白蛋白。上述整個檢測過程不超過20分鐘,操作簡單,檢測速度比較快。

    3.化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)在腫瘤標記物檢測中的應(yīng)用

    惡性腫瘤對人類健康的威脅日益增強,腫瘤生物標志物的檢驗對于惡性腫瘤篩查、早期診斷、預(yù)后、療效評估具有重要意義。目前化學(xué)發(fā)光免疫法廣泛應(yīng)用于腫瘤生物標志物檢驗。隨著納米金粒子、石墨烯和多碳納米管等納米材料,核酸適配體,磁性微球,脂質(zhì)體,人工模擬酶等的應(yīng)用,腫瘤生物標志物化學(xué)發(fā)光免疫法檢驗取得了較大的進步[16]。

    胚胎抗原的表達往往在正常人體內(nèi)及其微量的存在甚至不存在,而使用CLIA對其進行檢測,往往能得到較高的精確度和靈敏度;人絨毛膜促性腺激素作為睪丸癌和絨毛膜上皮癌的標志物,往往高表達于腫瘤個體,而臨床研究表明,CLIA在進行該物質(zhì)的檢測時具有較高的精確度和靈敏度。通過使用CLIA來檢測tPSA(總前列腺特異性抗原)和fPSA(游離前列腺特異性抗原)可用于區(qū)分前列腺癌和良性前列腺增生。糖類抗原(CA)常見類型有CA125,CA199,CA153,分別是卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌的標志物。大量研究表明在診斷卵巢癌時,CLIA是檢測CA125較好的方法,可用于區(qū)分良性和惡性上皮卵巢腫瘤,有助于疾病的診斷。

    此外,隨著腫瘤研究的進展,同一腫瘤已發(fā)現(xiàn)一種或者多種腫瘤標志物,不同種類或者相同腫瘤的不同組織類型可有共同或者不同的腫瘤標志物,而且由于腫瘤標志物的靈敏度和腫瘤的專一性有限,單純的檢測一項腫瘤標志物有可能造成腫瘤標記物含量低的患者發(fā)生錯誤或者漏檢。因此選擇特異性高的腫瘤標志物聯(lián)合檢測,可提高診斷的陽性率。

    4.結(jié)語

    化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用已非常成熟,有取代放射免疫分析技術(shù)和酶聯(lián)免疫分析技術(shù)而成為診斷市場上的主流產(chǎn)品的趨勢。其能夠快速、準確地檢測腫瘤標志物的能力有重要的臨床應(yīng)用價值。目前國內(nèi)用CLIA方法研究腫瘤標志物的相關(guān)研究較少。同一個標志物可用不同的方法檢測,同一方法可分析不同的腫瘤標志物。CLIA以其高的靈敏度和簡便的儀器操作占據(jù)優(yōu)勢。

    CLIA分析方法靈敏度高,特異性強,方法多樣,廣泛地用于抗原、抗體和半抗原的免疫測定,其線性范圍也較寬,符合生物醫(yī)學(xué)和食品安全快速檢測的需要,為生物醫(yī)學(xué)和食品安全提供了一種超微量的無輻射免疫檢測手段。隨著納米磁性粒子技術(shù)、新型免疫反應(yīng)增強劑和發(fā)光劑的不斷研究開發(fā),流動注射化學(xué)發(fā)光免疫分析法、毛細管電泳化學(xué)發(fā)光免疫分析法、高效液相色譜化學(xué)發(fā)光免疫分析法不斷開發(fā)和完善,化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)在醫(yī)學(xué)方面將會有更廣闊的應(yīng)用前景。

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