沉默SMAD4降低MIA PaCa-2細(xì)胞對吉西他濱的敏感性

安倩 曹雪婷 吳博雅 陳靜

摘要：目的探究SMAD4基因缺失后對胰腺癌MIA PaCa-2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響。方法應(yīng)用實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡實驗檢測SMAD4基因的mRNA和蛋白水平的表達(dá)。CCK8方法檢測不同濃度吉西他濱對MIA PaCa-2細(xì)胞的毒性作用，進(jìn)而選取最佳作用濃度。同時，臺盼藍(lán)實驗檢測吉西他濱在不同時間作用下對MIA PaCa-2細(xì)胞存活率的影響，進(jìn)而選取最佳作用時間。最后，通過Transwell實驗檢測基因沉默與藥物共同作用下對細(xì)胞遷移和侵襲的影響。結(jié)果吉西他濱作用MIA PaCa-2細(xì)胞最佳濃度為10-7 M、最佳時間是48 h。與對照組相比，敲除SMAD4基因后吉西他濱作用的MIA PaCa-2細(xì)胞的存活率有所上升，且通過小室的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)明顯高于無轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)。結(jié)論吉西他濱能抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，且SMAD4基因敲除后使胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增加，以及敲除后能部分抑制吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用。

關(guān)鍵詞：SMAD4;胰腺癌;吉西他濱

【中圖分類號】 F763 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）10--02

胰腺癌（PC）是當(dāng)前惡性程度相當(dāng)高并迅速致命的難治性胃腸道癌癥之一，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)也呈現(xiàn)出增加的態(tài)勢，但在我國患者中出現(xiàn)時多數(shù)已是為晚期，死亡率幾乎100%。最新的檢測結(jié)果、流行病學(xué)和最終結(jié)論估計，在胰腺癌所有階段的總體五年生存率僅為10%（2010-2016年）[1]。自1997年，吉西他濱（GEM）首次被證實其對胰腺癌的化療效果較之以前一直應(yīng)用的氟尿嘧啶有優(yōu)越性以來，在針對胰腺癌的化療中，無論是單獨應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用，吉西他病一直作為一線首選用藥[2]。

SMAD4基因最初是基于胰腺腫瘤中頻繁的18q21.1純合缺失和突變而被發(fā)現(xiàn)的，并被發(fā)現(xiàn)參與了TGF-β的信號通路。SMAD4基因在多種惡性腫瘤種類中缺失或突變，如胰腺癌、結(jié)腸癌、食管癌、胃癌和肝癌，特別是消化系統(tǒng)腫瘤。因此，它被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因[3]。目前的文獻(xiàn)中對于SMAD4的缺失是否與胰腺癌的對吉西他濱的敏感性相關(guān)，缺乏一定的數(shù)據(jù)支持和研究。所以，本研究旨在探討SMAD4基因缺失后吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2細(xì)胞（購自武漢普諾賽生命科技有限公司）。用含10%胎牛血清（Gibco），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)融合度達(dá)到80～90%時，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2 CCK8實驗

本研究使用CCK8法測定抑制率。細(xì)胞接種于96孔板（8000個細(xì)胞/孔），每孔100μL，培養(yǎng)24 h后，分別加入含有10-11 M～10-3 M的GEM的無血清培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，在450 nm波長測定OD值。并計算IC50值（50%抑制濃度，也稱半抑制濃度），從而選出最佳濃度。

1.3臺盼藍(lán)排斥實驗

使用臺盼藍(lán)排斥實驗篩選出最佳作用時間。細(xì)胞以20×105個/孔均勻鋪在六孔板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，加入10-7 M的GEM無血清培養(yǎng)基，每個藥物濃度設(shè)3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，制成50 uL的細(xì)胞懸液，加入50 uL 0.5%臺盼藍(lán)染液，染色3 min，再用倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞著色情況，將死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞不染色，計算不同時間的存活率。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染

SMAD4基因的siRNA（陰性對照、、陽性對照、三組siRNA）從吉瑪基因購買。引物序列分別為：

陰性對照（F：5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，

R：5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3），

2140（F：5-GCUCCUAGACGAAGUACUUTT-3，R：5-AAGUACUUCGUCUAGGAGCTT-3）、

1045（F：5-GCCAUCGUUGUCCACUGAATT-3，R：5-UUCAGUGGACAACGAUGGCTT-3）、

1306（F：5-GCCAGCUACUUACCAUCAUTT-3，R：5-AUGAUGGUAAGUAGCUGGCTT-3）。

將MIA PaCa-2細(xì)胞接種于6孔板（5.0x105個/孔）中24 h后，使第二天細(xì)胞密度高達(dá)到70%～90%。MIA PaCa-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h分為兩組：i）陰性對照亞組、1306亞組、2140亞組、1045亞組;ii）陰性對照（0.1%PBS）亞組、陰性對照+GEM（10-7M）亞組、si-SMAD4亞組、si-SMAD4+GEM（10-7M）亞組。每組設(shè)置三個復(fù)孔。HighGene轉(zhuǎn)染試劑（ABclonal）瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，進(jìn)行qPCR實驗，轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行Western blot實驗。

1.5實時熒光定量PCR（qPCR）分析

用成都福際RNA提取試劑盒（RE-03012）在細(xì)胞中分離總RNA。使用莊盟公司提供的第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ZR102-1），得到cDNA。使用以下參數(shù)在ABI PRISM 7500FAST PCR序列檢測系統(tǒng)上進(jìn)行qPCR測定：95℃3min，95℃5s，60℃34s，共40個循環(huán)。靶基因倍數(shù)變化用2-ΔΔCt法計算。用于qPCR的引物如下：

SMAD4（F：5-CTCCCATCCAATGTTCTCTGTA-3，

R：5-ACAAGTAATGATGCCTGTCTGA-3;

GAPDH：F：5-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3，

R：5-AGGAAAAGCATCACCCGGAG-3。

1.6 Western blot分析

用細(xì)胞裂解液（每1 mL RIPA裂解液加入2 uL的蛋白酶抑制劑）從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總蛋白。4℃下12000 rpm離心10 min。BCA蛋白定量試劑盒（美侖生物）檢測蛋白濃度。用10%的SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再用配好的5%脫脂牛奶封閉2 h，使用兔抗SMAD4孵育一抗（1：2，000，ThermoFisher），再移至4℃冰箱過夜。膜用TBST清洗3次。然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（1：10，000;ABclonal）作為二次抗體孵育。通過增強化學(xué)發(fā)光（ECL;Thermo Fisher Science）對斑點進(jìn)行可視化。ECL系統(tǒng)（amersham;GE Healthcare）用于檢測條帶，最后用Image J軟件分析。

1.7 Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實驗

24孔板下室加入600?L含20%FBS的完全培養(yǎng)基，取100?L細(xì)胞密度為2×105/mL的懸液加入transwell小室上室（注意：侵襲實驗的小室需用50?L matrigel膠稀釋液包被transwell小室底部膜的上室，37℃，1 h）。37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后加入10-7 M濃度的吉西他濱，每組設(shè)三個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，Gimsa染色，顯微鏡下觀察，拍照，取五個視野計算平均數(shù)。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗均獨立重復(fù)3次，分析結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差顯示。數(shù)據(jù)結(jié)果通過單因素方差分析、t檢驗完成，各數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件，并通過Graphpad prism 8.0和Image J軟件處理分析。P<0.05時，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2實驗結(jié)果

2.1吉西他濱對MIA PaCa-2細(xì)胞的毒性作用

CCK8法檢測藥物對細(xì)胞的毒性作用，以便篩選出最佳作用濃度。MIA PaCa-2細(xì)胞中加入不同濃度的GEM作用48 h后，GEM以濃度依賴性降低胰腺癌細(xì)胞的存活率。進(jìn)而得出IC50為-7.07±0.38，故選擇GEM作用MIA PaCa-2細(xì)胞的最佳濃度為10-7 M。同時，進(jìn)行臺盼藍(lán)實驗測定10-7 M濃度的GEM對MIA PaCa-2細(xì)胞在0 h、24 h、48 h、72 h的抑制作用，從而選擇出最佳的作用時間。得出結(jié)果為細(xì)胞存活率分別為96.40±0.75、71.45±3.00、36.69±3.67、21.69±2.04，GEM以時間依懶性降低MIA PaCa-2細(xì)胞的存活率，根據(jù)存活率結(jié)果選取48 h為GEM作用細(xì)胞的最佳時間。

2.2敲低SMAD4基因降低吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞的作用

2.2.1沉默SMAD4基因抑制吉西他濱對細(xì)胞的毒性作用

首先，通過吉瑪基因設(shè)計了SMAD4基因的三個不重疊siRNA，被命名為：“2140”、“1045”和“1306”。qPCR和Western Blot實驗分析“1306”的轉(zhuǎn)染效率最高，可達(dá)到70%以上（圖1）。故以下實驗使用“1306”這一siRNA轉(zhuǎn)染。

用10-9 M～10-5 M濃度的GEM作用細(xì)胞48 h，進(jìn)行CCK8細(xì)胞毒性檢測。從圖2看出，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率比對照組明顯上調(diào)（P<0.05），說明較高濃度的GEM和siRNA聯(lián)合使用比只使用GEM對細(xì)胞殺傷作用有所減弱，進(jìn)一步說明敲低SMAD4的胰腺癌細(xì)胞下調(diào)GEM的敏感性。

2.2.2轉(zhuǎn)染siRNA降低吉西他濱抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲

為進(jìn)一步驗證SMAD4基因與GEM對胰腺癌細(xì)胞遷移侵襲的影響，用10-7 M濃度的GEM對轉(zhuǎn)染和不轉(zhuǎn)染siRNA的MIA PaCa-2細(xì)胞作用48 h，進(jìn)行Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實驗。由表1可看出，與PBS組相比，加藥組細(xì)胞遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯降低，但轉(zhuǎn)染組相較于無轉(zhuǎn)染組的遷移侵襲細(xì)胞數(shù)是上調(diào)的。說明GEM能抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲作用，同時轉(zhuǎn)染siRNA后，GEM的抑制作用明顯下調(diào)。綜上所述，沉默SMAD4基因后，GEM的治療作用受到抑制，且明顯降低了GEM對胰腺癌細(xì)胞的遷移侵襲的抑制作用。

3. 討論

胰腺癌是人類惡性癌癥中高致死性的病變，它起病隱匿，發(fā)展較快，治療效果和預(yù)后都很差，預(yù)測到2030年，居人類惡性腫瘤死亡率第二[4]。胰腺癌的致死數(shù)與發(fā)病人數(shù)都呈上升趨勢，是兩性癌癥死亡的第七大原因素。因此，識別生物標(biāo)志物對早期診斷和基因靶向治療的發(fā)展至關(guān)重要。

SMAD4基因位于18號染色體上，由12個外顯子構(gòu)成，編碼552個氨基酸序列。在大約30%的胰腺癌中，SMAD4純合缺失。同時，SMAD4在胰腺導(dǎo)管腺癌中，約55%-60%表現(xiàn)出SMAD4的突變失活。核苷類似物吉西他濱通過將脫氧胞苷的20個碳原子替換為氟原子來抑制DNA復(fù)制。由于化療耐藥性的產(chǎn)生，它對人胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性是有限的。GEM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與癌細(xì)胞中的DNA損傷有關(guān)，抑制或修復(fù)GEM誘導(dǎo)的DNA損傷可以顯著減少癌細(xì)胞的凋亡[5]。在這項研究中，我們首先檢測吉西他濱對細(xì)胞的敏感性，篩選出吉西他濱作用胰腺癌細(xì)胞的最佳作用濃度和時間。通過靶向siRNA敲除SMAD4，能夠顯著增強胰腺癌的惡性腫瘤進(jìn)展，從而提高細(xì)胞遷移侵襲能力，并明顯抑制了GEM對胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用。

參考文獻(xiàn)：

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