復(fù)合微生態(tài)制劑對小鼠腸道免疫功能的影響

白培鈿 ,裴婷 ,孔佳美,楊逢清,李濤,王海東,任玉紅

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山西 晉中 030801)

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展,抗生素作為飼料添加劑被大量用于畜禽疾病防治及促進(jìn)畜禽生長。然而,抗生素的濫用導(dǎo)致耐藥細(xì)菌大量產(chǎn)生,大大降低了藥物療效,同時藥物在畜禽產(chǎn)品中大量殘留,直接危害動物源性食品安全和人類健康。2017年6 月,我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《全國遏制動物源細(xì)菌耐藥行動計劃(2017～2020 年)》的通知,要求我國從2020 年起在動物養(yǎng)殖生產(chǎn)中全面禁止使用人獸共用或容易產(chǎn)生耐藥性的抗菌藥物作為動物促生長劑[1]。微生態(tài)制劑能夠改善動物腸道健康,提高生長性能,增強(qiáng)機(jī)體免疫力,但是微生態(tài)制劑存在活菌數(shù)低,不易保存等問題。酶制劑能夠補(bǔ)充動物體內(nèi)酶類的不足,消除抗?fàn)I養(yǎng)因子,增強(qiáng)機(jī)體免疫力,但是酶制劑也存在穩(wěn)定性差,不易保存等一系列的問題。近年來,研究者開始對益生菌和酶制劑的共同作用效果進(jìn)行研究,提高益生菌劑和酶制劑的質(zhì)量和作用效果。本課題組成功研制一種酶與微生態(tài)制劑復(fù)合組劑(申請公布號:CN113439798A)[2],以期應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中,為養(yǎng)殖業(yè)“減抗禁促”提供新的飼料添加劑。本研究通過對小鼠灌胃不同劑量復(fù)合微生態(tài)制劑,研究其對小鼠腸道黏膜免疫功能、免疫器官指數(shù)及血液溶菌酶含量的影響,旨在為復(fù)合微生態(tài)制劑在養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用提供理論依據(jù),同時為養(yǎng)殖業(yè)研制能替代抗生素的安全、高效及綠色的飼料添加劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物

80 只28 日齡清潔級BALB/C 小鼠,體重為(16 ±2)g,雌雄各半購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心【SCXK(晉)2019-0005】。飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實(shí)驗室【SYYK(晉)2020-0003】,維持飼料購自山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心。實(shí)驗期間同室分籠喂養(yǎng),飼養(yǎng)溫度為(22 ± 2)℃,濕度為40%～60%,自由采光和飲水。本實(shí)驗方案符合山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物護(hù)理與使用委員會的要求(SXAU-EAW-2020SD0201)。

1.1.2 主要試劑與儀器

復(fù)合微生態(tài)制劑:由枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、啤酒酵母菌、中性蛋白酶及纖維素酶所組成(總活菌數(shù)1.0×1011CFU/g),由微生態(tài)制劑研發(fā)課題組研制(專利申請?zhí)?20211059339 2.7)。IL-4、IL-10、IFN-γ、SIgA 檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;溶菌酶(LZM)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;實(shí)時熒光定量試劑盒諾購自唯贊生物科技有限公司;TRIzol(美國life);反轉(zhuǎn)錄試劑盒為TaKaRa 產(chǎn)品等。

SpectraMax M5 酶標(biāo)儀(Molecular Devices,美國);StepOnePlus 實(shí)時熒光定量PCR 儀(ABI,美國)等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗動物分組

小鼠正常飼喂飼養(yǎng)7 d 后,按照隨機(jī)分組原則分為4 組,每組雌雄各10 只,實(shí)驗組持續(xù)灌胃復(fù)合微生態(tài)制劑28 d,對照組灌胃生理鹽水。實(shí)驗動物分組及處理見表1。

表1 實(shí)驗動物分組Table 1 Groups of experimental animals

1.2.2 樣品采集

在第14 天和第28 天,從各組隨機(jī)選取10 只小鼠(雌雄各半),麻醉后采血,置于非抗凝采血管內(nèi),分離血清,用于溶菌酶含量的測定。采血后處死小鼠,取胸腺、脾和腸系膜淋巴結(jié)并稱重,用于免疫器官指數(shù)測定。小鼠空腸樣品的采集處理方法參照文獻(xiàn)[3],用于總RNA 的提取和免疫細(xì)胞因子含量的測定,小鼠空腸黏膜免疫細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、IFNγ)檢測方法參照文獻(xiàn)[4-5]。

1.2.3 生長性能的測定

在實(shí)驗期間0、7、14、21 和28 d 時,對每組小鼠進(jìn)行空腹稱重,計算平均體重。

敘府變電站500 kV 11回出線A相CVT的連續(xù)24個時刻的量測值如圖 1所示，其中，上半部分是原始數(shù)據(jù)，下半部分是利用基于經(jīng)驗?zāi)B(tài)分解的信號去噪法處理后的數(shù)據(jù)。

1.2.4 免疫器官指數(shù)的測定

免疫器官指數(shù)=免疫器官重量(mg)/體重(g)

1.2.5 溶菌酶的測定

按試劑盒說明測定各組小鼠血清溶菌酶濃度。計算數(shù)據(jù)以每毫升血清中所含微克溶菌酶表示,即μg/mL。嚴(yán)格按照試劑盒操作要求檢測溶菌酶的活力,按公式計算溶菌酶含量。

溶菌酶含量=(測定透光度-空白透光度)/(標(biāo)準(zhǔn)透光度-空白透光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣本測試前稀釋倍數(shù)

1.2.6 空腸黏膜細(xì)胞因子及SIgA 含量測定

空腸黏膜細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IFN-γ 以及SIgA含量測定參照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣本均設(shè)復(fù)孔。酶標(biāo)儀檢測各孔OD 值,計算腸道黏膜內(nèi)細(xì)胞各細(xì)胞因子的濃度。

根據(jù)NCBI 上基因數(shù)據(jù)庫查找目的基因IL-4、IL-10 和IFN-γ 以及內(nèi)參GAPDH 相對應(yīng)的基因序列,運(yùn)用Primer 5.0 軟件設(shè)計各基因的上下游引物(如表2 所示)。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min,95℃變性15 s,60℃退火30 s,65℃延伸30 s,40個循環(huán)。目的基因的相對表達(dá)水平用2-ΔΔCT表示。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,各組數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析(one-way ANOVA),實(shí)驗結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤差(ˉx)表示,用GraphPad Prism 5 繪制柱狀圖。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合微生態(tài)制劑對小鼠體重的影響

小鼠灌胃微生態(tài)復(fù)合制劑后,各階段體重變化如表3 所示。從表3 可知小鼠在灌胃不同劑量的復(fù)合微生態(tài)制劑第7 天和第14 天,各組小鼠體重均有所增加,但無顯著差異性(P＞0.05);在第21 天和第28 天,中劑量組和高劑量組的小鼠體重增加明顯,差異具有顯著性(P＜0.05),低劑量組的小鼠體重?zé)o顯著性差異(P＞0.05)。

表3 各組小鼠體重變化情況(g)Table 3 Changes of mice body weight in different groups(g)

2.2 復(fù)合微生態(tài)制劑對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

由表4 可以看出,灌胃復(fù)合微生態(tài)制劑第14天,不同劑量的復(fù)合微生態(tài)制劑均能不同程度提高小鼠的免疫器官指數(shù),且中劑量組差異具有顯著性(P＜0.05)。第28 天,低劑量組和高劑量組小鼠的脾指數(shù)和胸腺明顯高于對照組,且差異具有顯著性(P＜0.05);中劑量組免疫器官指數(shù)極顯著高于對照組(P＜0.01)。

表4 復(fù)合微生態(tài)制劑對免疫器官指數(shù)的影響Table 4 Effect of the compound probiotics on immune organ index

2.3 復(fù)合微生態(tài)制劑對血清溶菌酶含量的影響

由圖1 可知,在灌胃復(fù)合微生態(tài)制劑第14 天和第28 天,不同劑量的復(fù)合微生態(tài)制劑均能不同程度的提高小鼠血清中溶菌酶的含量。第14 天,低劑量組和中劑量組小鼠的溶菌酶含量均明顯高于對照組,且差異極具顯著性(P＜0.01);高劑量組小鼠的溶菌酶含量增加,差異具有顯著性(P＜0.05)。第28 天,各實(shí)驗組溶菌酶含量均明顯高于對照組,差異極具顯著性(P＜0.01)。

圖1 復(fù)合微生態(tài)制劑對小鼠血清溶菌酶含量的影響Note.Compared with control group,#P ＜0.05,##P ＜0.01.Figure 1 Effect of the compound probiotics on lysozyme in serum

2.4 復(fù)合微生態(tài)制劑對空腸黏膜免疫細(xì)胞因子含量的影響

由圖2 可知,小鼠灌胃復(fù)合微生態(tài)制劑第14 天和第28 天,低劑量組空腸黏膜的IL-4 含量均呈不同程度高于對照組(P＜0.05 或P＜0.01);中劑量組空腸黏膜IL-4 含量顯著高于對照組(P＜0.01);高劑量組空腸黏膜IL-4 含量均無顯著性差異(P＞0.05)。第14 天,中劑量組空腸黏膜IL-10 含量高于對照組,差異具有顯著性(P＜0.05)。低劑量組和高劑量組空腸黏膜IL-10 含量與對照組無顯著性差異(P＞0.05);第28 天,各實(shí)驗組小鼠空腸黏膜IL-10 含量呈不同程度高于對照組,其中,低劑量組和高劑量組顯著高于對照組(P＜0.05),中劑量組空腸黏膜IL-10 含量極顯著增加(P＜0.01)。小鼠在灌胃復(fù)合微生態(tài)制劑第14 天和第28 天,各實(shí)驗組小鼠腸道黏膜IFN-γ 含量呈不同程度高于對照組。與對照組相比,中劑量組空腸黏膜IFN-γ 含量明顯增加,差異極顯著(P＜0.01);低劑量組和高劑量組空腸黏膜IFN-γ 含量明顯增加,差異顯著(P＞0.05)。

圖2 微生態(tài)復(fù)合制劑對IL-4、IL-10 和IFN-γ 含量的影響Figure 2 Effect of the compound probiotics on IL-4,IL-10 and IFN-γ content

2.5 復(fù)合微生態(tài)制劑對空腸黏膜免疫細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)水平的影響

由圖3 可知,小鼠灌胃復(fù)合微生態(tài)制劑第14 天和第28 天,低劑量組空腸黏膜IL-4、IL-10 mRNA 表達(dá)量與對照組無顯著性差異(P＞0.05),IFN-γ mRNA 表達(dá)水平顯著高于對照組(P＜0.05)。中劑量組空腸黏膜IL-4、IL-10 和IFN-γ mRNA 表達(dá)量增加,差異極具顯著性(P＜0.01)。高劑量組空腸黏膜IL-4、IL-10 和IFN-γ mRNA 表達(dá)量不同程度高于對照組(P＜0.01 或P＜0.05)。

圖3 復(fù)合微生態(tài)制劑對IL-4、IL-10 及IFN-γ mRNA 表達(dá)水平的影響Figure 3 Effect of the compound probiotics on the relative expression of IL-4,IL-10 and IFN-γ mRNA

2.6 復(fù)合微生態(tài)制劑對空腸黏膜SIgA 含量的影響

由圖4 可知,小鼠灌胃復(fù)合微生態(tài)制劑第14天,低劑量組SIgA 含量顯著高于對照組(P＜0.05),中劑量組SIgA 含量明顯高于對照組,且差異極具顯著性(P＜0.01);高劑量組的含量無顯著性差異(P＞0.05)。第28 天,各實(shí)驗組小鼠空腸黏膜SIgA 含量均明顯高于對照組,其中,中劑量組的SIgA 含量顯著高于對照組,差異極具顯著性(P＜0.01);低劑量組和高劑量組SIgA 含量增加,差異均具有顯著性(P＜0.05)。

圖4 復(fù)合微生態(tài)制劑對空腸黏膜SIgA 含量的影響Figure 4 Effect of the compound probiotics on SIgA content in jejunal mucosa

3 討論

免疫器官指數(shù)是評價機(jī)體免疫力的一項重要指標(biāo)[6],能反映身體免疫反應(yīng)的水平,免疫器官指數(shù)升高代表機(jī)體免疫力提高,免疫器官指數(shù)降低則為機(jī)體免疫能力降低[7-8]。脾、胸腺和淋巴結(jié)是機(jī)體的免疫器官,具有免疫功能,其中脾是免疫細(xì)胞儲存的場所,能清除血液中異物、抗原及衰老死亡的紅細(xì)胞[9];胸腺是T 細(xì)胞成熟的場所,參與機(jī)體細(xì)胞免疫[10]。淋巴結(jié)具有濾過淋巴、產(chǎn)生淋巴細(xì)胞的作用,還能進(jìn)行免疫應(yīng)答。張雷等[11]研究發(fā)現(xiàn)微生態(tài)制劑能夠使雛雞的免疫器官指數(shù)的增加,提高免疫力。本實(shí)驗結(jié)果表明,不同劑量復(fù)合微生態(tài)制劑均可不同程度提高小鼠胸腺、淋巴結(jié)和脾的免疫器官指數(shù),且中劑量組免疫器官指數(shù)高于其它兩組,此結(jié)果與胡影等[12]的研究結(jié)果一致。這說明復(fù)合微生態(tài)制劑在一定程度上促進(jìn)小鼠免疫器官的生長、發(fā)育,可增強(qiáng)小鼠機(jī)體的免疫力。

溶菌酶作為一種體內(nèi)堿性小分子量的蛋白水解酶,是單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的產(chǎn)物,對革蘭氏陽性菌有顯著的抑菌效果[13]。在動物體正常的防御、非特異性免疫和免疫反應(yīng)中起著重要的作用,是構(gòu)成機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)的重要因子之一。通過測定溶菌酶的活力,可估測機(jī)體的非特異性免疫的能力[14]。本研究中,灌胃不同劑量復(fù)合微生態(tài)制劑均可以增加小鼠血清中溶菌酶的含量,此結(jié)果與劉宇等[15]的研究一致。由此可見,復(fù)合微生態(tài)制劑作用于小鼠后,可促進(jìn)小鼠產(chǎn)生并釋放出溶菌酶,從而增加機(jī)體殺菌、抗感染的能力。

腸道黏膜免疫系統(tǒng)是腸道屏障的重要組成部分,與腸道上皮細(xì)胞相互作用、相互影響,保護(hù)腸道免受細(xì)菌、病毒等微生物的粘附和入侵及防止異物的吸收,起到機(jī)體第一道防線的作用。復(fù)合微生態(tài)制劑是由酶制劑和益生菌復(fù)合制成的復(fù)合組劑,其中的益生菌能夠在腸道內(nèi)定殖并改善菌群平衡,對宿主健康有益。益生菌進(jìn)入機(jī)體后可參與活化腸道相關(guān)淋巴組織,誘導(dǎo)T、B 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,也可作用于腸道黏膜上皮細(xì)胞使黏膜局部T 細(xì)胞增殖和活化產(chǎn)生白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)和干擾素-γ(IFN-γ)等細(xì)胞因子以及使B 細(xì)胞產(chǎn)生Ig,直接或者間接調(diào)控腸道黏膜免疫[16-18]。其中IL-4 能夠促進(jìn)Th0 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞分化,促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞增殖分化,誘導(dǎo)IgE 和IgG 產(chǎn)生,也可促進(jìn)NK 細(xì)胞的增殖、分化使產(chǎn)生IFN-γ 的能力增強(qiáng),調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)應(yīng)答[19-20]。IL-10 屬于Th2型細(xì)胞因子,主要由Treg 細(xì)胞分泌,有抑制Th1 細(xì)胞分泌IL-2、IL-3、集落刺激因子和腫瘤壞死因子-α的作用而發(fā)揮抗感染作用。同時,也可刺激B 細(xì)胞分化增生,促進(jìn)抗體生成[21]。IFN-γ 主要由活化的Th1 細(xì)胞和NK 細(xì)胞產(chǎn)生,可刺激巨噬細(xì)胞活化的作用,促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)MHCⅡ類分子,提高抗原遞呈能力,增強(qiáng)NK 細(xì)胞和CTL 細(xì)胞的殺傷活性,促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞分化、增殖;抗病毒感染和抗腫瘤作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合微生態(tài)制劑可增加空場粘膜IL-4、IL-10 和IFN-γ 的含量及mRNA 表達(dá)水平,其結(jié)果與崔暢婉等[23]的研究結(jié)果一致。低劑量組和中劑量組可促進(jìn)小鼠腸道黏膜分泌IL-4 和IL-10,這可能是由于益生菌在黏膜表面和黏膜下層被腸黏膜淋巴樣組織中的巨噬細(xì)胞吞噬并提取特征抗原傳遞給T、B 淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞。適量的益生菌可刺激調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞分化,使Th0 細(xì)胞分化為Th2 細(xì)胞,增加IL-4、IL-10 的含量[24-25]。復(fù)合微生態(tài)制劑可能通過不同途徑來改善小鼠免疫功能。Rizzello 等[26]認(rèn)為,乳酸菌的免疫調(diào)節(jié)功能主要體現(xiàn)在刺激NK 細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其細(xì)胞功能,從而增強(qiáng)動物機(jī)體的抵抗力。Fink 等[27]報道嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌顯著提高NK 細(xì)胞的活力和殺菌能力。本研究中,灌服復(fù)合微生態(tài)制劑可以提高小鼠空腸黏膜IFN-γ mRNA 表達(dá)水平及含量,這可能是由于嗜酸乳桿菌可通過Toll 樣受體9 傳導(dǎo)信號,增加小鼠派爾集合淋巴結(jié)中INF-γ 陽性細(xì)胞的數(shù)量[28-29],且添加適量復(fù)合微生態(tài)制劑可以促進(jìn)樹突狀(DC)細(xì)胞分泌白介素-12,白介素-12 可以激活NK 細(xì)胞并促使其合成、分泌INF-γ[27,30]從而抑制病毒的復(fù)制,起到免疫調(diào)節(jié)作用和增強(qiáng)抗病毒能力。

腸道黏膜免疫系統(tǒng)由多種免疫成分組成,分泌性免疫球蛋白A(SIgA)是腸道黏膜免疫的主要保護(hù)效應(yīng),是防御病原菌在腸道粘附和定植的第一道防線。SIgA 通過結(jié)合聚合免疫球蛋白受體(pIgR)[31],從基底外側(cè)表面?zhèn)鬏數(shù)金つけ砻?用于保護(hù)腸黏膜上皮細(xì)胞,提升消化道黏膜防御功能[32]。有研究表明微生物種群的變化會影響固有免疫的激活,以維持黏膜穩(wěn)態(tài)。Nagayama 等[33]給小鼠灌胃酵母補(bǔ)充物后,小鼠的空腸的SIgA 含量增加。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合微生態(tài)制劑能夠增加腸道黏膜SIgA 的分泌,這可能是益生菌在腸道定植后,自身及代謝產(chǎn)物作為抗原物質(zhì)被M 細(xì)胞吞噬或內(nèi)化形成內(nèi)體,M 細(xì)胞內(nèi)的抗原快速釋放并被樹狀突細(xì)胞攝取,后者隨之遷移至派爾集合淋巴結(jié)的T 淋巴細(xì)胞區(qū)或系膜淋巴結(jié),將抗原提呈給初始T 淋巴細(xì)胞,激活Th2 細(xì)胞,產(chǎn)生大量白介素-5,活化派爾集合淋巴結(jié)生發(fā)中心的B 淋巴細(xì)胞,使其轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞分泌IgA,提高SIgA 的含量水平[34]。表明復(fù)合微生態(tài)制劑可促進(jìn)小鼠空腸粘膜IgA 漿細(xì)胞分泌SIgA,提高SIgA 在空腸黏膜的含量,增強(qiáng)小鼠空腸黏膜的免疫功能,減少腸道病原微生物的感染。

4 結(jié)論

復(fù)合微生態(tài)制劑能促進(jìn)小鼠的生長,提高小鼠免疫器官指數(shù)及血液中溶菌酶的含量,增強(qiáng)小鼠抗感染的能力;復(fù)合微生態(tài)制劑能提高腸道黏膜免疫細(xì)胞因子的表達(dá)水平,促進(jìn)腸道粘膜分泌免疫球蛋白,進(jìn)而增強(qiáng)腸道黏膜免疫功能,減少腸道感染性疾病的發(fā)生。