神經(jīng)干細(xì)胞移植在神經(jīng)退行性疾病中的研究進(jìn)展

郭文文 趙亞 白敏 張延英 王穎花汪永鋒*師長宏*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),蘭州 730000;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,西安 710032;3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)/甘肅省道地藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)研究與推廣工程實驗室/甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室/甘肅省實驗動物行業(yè)技術(shù)中心,蘭州 730000;4.延安大學(xué),陜西 延安 716000)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell,NSC)能夠分化為多種細(xì)胞譜系,這些細(xì)胞譜系包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等,在神經(jīng)再生中起到重要的作用[1]。NSC 分布在整個發(fā)育中的大腦中,位于大腦中的兩個主要神經(jīng)源性生態(tài)位——側(cè)腦室的腦室下區(qū)(subventricular zone,SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下區(qū)(subgranular zone,SGZ)[2]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)發(fā)生急性損傷、慢性損傷或退行性變后,內(nèi)源性NSC 變得活躍并參與腦修復(fù)過程,但受傷的CNS 內(nèi)的NSC 被限制在分散的位置,數(shù)量很少且被不支持神經(jīng)元分化的微環(huán)境所包圍,從而導(dǎo)致CNS 內(nèi)在自我修復(fù)能力不足或無效[3]。

隨著生命科學(xué)領(lǐng)域各項研究技術(shù)的不斷成熟,對大腦進(jìn)行全面深層次研究已經(jīng)具備可能。其中,NSC 移植是近年來腦研究領(lǐng)域的重要熱點之一,該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種神經(jīng)性疾病的治療研究。有報道指出移植人神經(jīng)誘導(dǎo)性干細(xì)胞可用于治療大小鼠模型中包括創(chuàng)傷性腦損傷、脊髓損傷及中風(fēng)等在內(nèi)的多種神經(jīng)疾病[4]。當(dāng)前,大多數(shù)NSC 研究依賴于嚙齒動物模型。但是,人與嚙齒動物的NSC有很大不同,許多疾病風(fēng)險基因在二者之間表達(dá)存在較大差異。因此,基于人神經(jīng)細(xì)胞嵌合小鼠的模型制備可在動物水平實現(xiàn)對人腦的模擬,且相關(guān)神經(jīng)誘導(dǎo)性干細(xì)胞移植已應(yīng)用于各個領(lǐng)域,以便更加深入了解干細(xì)胞在受傷大腦中的治療作用的潛在機制。NSC 的體外分離分析已被證明是揭示神經(jīng)發(fā)生的細(xì)胞和分子機制的重要方法,能夠進(jìn)一步用于基于干細(xì)胞療法的神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷的治療[5]。因此,外源性NSC 移植是目前治療神經(jīng)退行性疾病及研究的熱點。本文就NSC 的來源及其在神經(jīng)退行性疾病治療研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為神經(jīng)退行性疾病的治療提供新的思路。

1 神經(jīng)干細(xì)胞來源

NSC 移植所需要的細(xì)胞量巨大,細(xì)胞來源已成為NSC 移植應(yīng)用于臨床治療及科學(xué)研究必須解決的首要問題[6]。研究表明,具有自我更新能力的NSC 能夠從嚙齒動物的胚胎組織和人腦組織中分離出來[7]。目前已明確可從3 種來源獲得NSC,包括從原代組織中直接提取、從多能干細(xì)胞中分化以及從體細(xì)胞中轉(zhuǎn)分化(見圖1)。

圖1 神經(jīng)干細(xì)胞的來源Figure 1 Source of neural stem cells

1.1 從原代組織中直接提取

從原代組織中直接提取的方法是直接從胎兒或成人的腦和脊髓組織中直接提取NSC,進(jìn)而進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化。NSC 位于成人大腦和胚胎的不同區(qū)域,它們有產(chǎn)生不同類型的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的趨勢。成年哺乳動物大腦中的腦室下區(qū)和胚胎腦中的神經(jīng)節(jié)隆起是富含NSC 的區(qū)域,為NSC 提供了良好的來源[8]。1992 年Reynolds 等[9]首次從成年哺乳動物腦室管膜下區(qū)分離鑒定出NSC;最近Farshad 等[10]通過改進(jìn)腦顯微切割技術(shù),縮短手術(shù)時間,在適宜的環(huán)境溫度和無菌條件下從胚胎小鼠顱骨中取出整個腦組織并分離出較高比例的NSC。而通過大腦紋狀體和胸脊髓的顯微解剖可獲得原始NSC,將分離出的原始NSC 在含有表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的單細(xì)胞懸浮液中進(jìn)行體外培養(yǎng),可形成稱為“神經(jīng)球”的非粘附性球形簇,也可以選擇性的在培養(yǎng)基中進(jìn)行單層貼壁培養(yǎng)。但是由于提供三維環(huán)境的胚狀體(embryoid body,EB)更有利于NSC 的分化和培養(yǎng),因此,EB 培養(yǎng)是目前分離和維持NSC 最流行和最可靠的方法[11]。

1.2 多能干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞的分化

多能干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs),兩者都可通過分化產(chǎn)生所需要的細(xì)胞[12]。ESC 源自植入前胚胎,具有多能性,可以分化為外胚層、內(nèi)胚層和中胚層[13]。有充分證據(jù)表明,ESC 可以分化為NSC,然后分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)[14]。誘導(dǎo)ESCs 向NSC 轉(zhuǎn)分化的實驗技術(shù)方法眾多,其中,通過采用全反式視黃酸(all-trans retinoic acid,RA)誘導(dǎo)NSC 的方法最為經(jīng)典。研究表明,RA 可以調(diào)節(jié)ESC 的生殖細(xì)胞分化和神經(jīng)分化,建立并改善ESC 分化為NSC 所依賴的微環(huán)境[15]。誘導(dǎo)分化過程中加入RA 的時間點及濃度的不同會導(dǎo)致細(xì)胞命運的不同。例如,高RA 濃度會增加神經(jīng)分化的速度,而低RA 濃度會誘導(dǎo)ESCs向心肌細(xì)胞分化;高RA 濃度誘導(dǎo)ESCs 為背側(cè)表型,低RA 濃度誘導(dǎo)ESCs 腹側(cè)表型[16]。然而這種方法分化效率低,可能導(dǎo)致組織移植物中神經(jīng)過度生長或形成腫瘤,同時也包括倫理安全等問題,因此,不適用于移植治療[17]。

2006 年,日本京都大學(xué)Takahashi 等[13]首次報道了有關(guān)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究,該研究使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染多能性基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc 和Klf4),通過適當(dāng)?shù)男盘栞斎胗行У貙⒊衫w維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為iPSCS。隨著技術(shù)發(fā)展,人類iPSCs(hiPSCs)可以通過使用一組相同的多能性相關(guān)基因獲得[18],從其他細(xì)胞類型如人角質(zhì)形成細(xì)胞、人外周血細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、胃細(xì)胞等獲得hiPSCs 也成為可能[19]。Kozhich 等[20]通過在無血清和缺乏營養(yǎng)的培養(yǎng)基單層培養(yǎng)中,使iPSCs 經(jīng)過神經(jīng)“玫瑰花結(jié)”階段直接分化為NSC[21],這種方法適用于從人類iPSCs 標(biāo)準(zhǔn)化分化和生成神經(jīng)細(xì)胞。在形態(tài)學(xué)、電生理特性和基因表達(dá)譜方面,iPSCs 衍生的神經(jīng)元與人類神經(jīng)元具有相似的特征。因此,iPSCs 衍生的NSC 已成為細(xì)胞療法的一個理想的來源[22]。

1.3 從體細(xì)胞中轉(zhuǎn)分化

隨著誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)技術(shù)的發(fā)展,使用來自胚胎或胎兒神經(jīng)組織的同種異體NSC 的研究方法正逐漸成為主流。通過重編程成體細(xì)胞獲得hiPSC 是研究疾病發(fā)生和發(fā)病機制的代表性方法系統(tǒng)[23],然而,這種方式需要較長時間才能將這些細(xì)胞分化為功能性神經(jīng)細(xì)胞,且在重編程過程中表觀出遺傳信息的重置。相反,將體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元細(xì)胞的速度更快、效率更高,細(xì)胞治療更安全,并且可以保留捐贈者的年齡特征[24]。

轉(zhuǎn)分化,也稱為譜系重編程,最初是由塞爾曼和卡法托斯在1974 年創(chuàng)造的[25]。在這個過程中,一種類型的成熟體細(xì)胞可不經(jīng)歷中間多能狀態(tài)直接轉(zhuǎn)化為另一種類型的成熟體細(xì)胞,其主要特征在于iPSC 階段的缺失或不明顯,以及通過重編程增殖細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞)直接獲得NSC[24]。

研究證明譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)的強制表達(dá)可以重新編程各種體細(xì)胞類型的發(fā)育潛力,將TF 與培養(yǎng)基補充劑(例如穩(wěn)定生成NSC 所需的小分子和生長因子)結(jié)合使用,可實現(xiàn)體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為NSC[26]。與iPSC 生成相比,能夠轉(zhuǎn)化為iNSC 的TF 的選擇非常多樣化。第一個直接轉(zhuǎn)化策略是通過在小鼠成纖維細(xì)胞中過表達(dá)三種TF,即Ascl1、Brn2 和Myt1l(BAM 因子),以將人類成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為NSC[27]。近年來,人們發(fā)現(xiàn)多種TF 組合可以用來從成纖維細(xì)胞產(chǎn)生亞型特異性蛋白,而在TF 篩選轉(zhuǎn)化研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了額外的促神經(jīng)元因子,如brn3a/b/c、brn4s 和ezh2[28]。此外,使用病毒載體將外源性基因引入細(xì)胞是目前NSC 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化中最突出的方法,其中慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒因其能夠有效地直接整合到宿主細(xì)胞的基因組中并賦予適當(dāng)水平的TF 表達(dá),是目前最常使用的病毒載體[29]。然而,TFs 的病毒傳遞具有不良副作用,可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及突變,影響其臨床應(yīng)用[30]。除了TF 外,在體外培養(yǎng)中,還可利用小分子調(diào)控特異性靶點和表觀遺傳機制來產(chǎn)生神經(jīng)祖細(xì)胞和神經(jīng)元[31]。小分子可以介導(dǎo)施加病毒劑的TF 輸送,以提高重編程效率。據(jù)報道,通過將細(xì)胞連續(xù)暴露于12 個小分子的組合中,可以有效且直接地將人類成纖維細(xì)胞重編程為谷氨酸能神經(jīng)元,這些化學(xué)誘導(dǎo)神經(jīng)元(ciN)顯示出神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)及成熟的放電模式,并形成功能性突觸[32]。

除此之外,通過向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加多種因子,特別是各種生長因子,如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、血小板源性生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF-2)和全反式視黃酸(RA),能夠?qū)⒐撬鑱碓吹娜祟愰g充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell,MSC)重編程為神經(jīng)干細(xì)胞[33]。

與多能干細(xì)胞誘導(dǎo)得到的神經(jīng)元相比,轉(zhuǎn)分化的NSC 具有明顯優(yōu)勢,它能夠在體外進(jìn)行擴增,并保留產(chǎn)生多種神經(jīng)元亞型和膠質(zhì)細(xì)胞的能力[34]。而這種來自體細(xì)胞如皮膚成纖維細(xì)胞、尿細(xì)胞和血細(xì)胞轉(zhuǎn)分化在臨床上容易實現(xiàn)[35]。

NSC 作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的儲備細(xì)胞,通過神經(jīng)祖細(xì)胞階段分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞,替代凋亡和死亡細(xì)胞進(jìn)行損傷后的修復(fù)。還可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子和細(xì)胞因子促進(jìn)突觸生長,保護(hù)現(xiàn)有神經(jīng)細(xì)胞免受原位損傷[36]。以上3 種來源特別是從iPSCs、ESCs 中獲得的NSC 和膠質(zhì)細(xì)胞可幫助急慢性損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù),用于神經(jīng)退行性疾病的治療[37]。

2 神經(jīng)干細(xì)胞在神經(jīng)退行性疾病治療中的作用

神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative diseases,ND)是一種因外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)元細(xì)胞丟失而引起的疾病狀態(tài),內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞的可修復(fù)性不足或治療失敗是治療該類疾病的重要障礙[38]。基于干細(xì)胞的移植,特別是使用來自iPSC、ESC 或NSC 的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,將成為神經(jīng)退行性疾病的常規(guī)治療方法,并且可能通過不同的機制,如神經(jīng)營養(yǎng)因子的產(chǎn)生、神經(jīng)炎癥的降低、突觸可塑性的增強和細(xì)胞的替代,對神經(jīng)退行性疾病產(chǎn)生有益的作用[39]。這一類疾病主要包括創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain Injury,TBI)、脊髓損傷(Spinal cord Injury,SCI)、中風(fēng)(Stroke)、阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD) 及帕金森綜合征(Parkinson,s disease,PD)等。

2.1 創(chuàng)傷性腦損傷

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是一種常見疾病,其主要損害是血腦屏障(BBB)破壞和神經(jīng)元壞死[40]。血腦屏障破壞導(dǎo)致缺氧增加,造成神經(jīng)損傷和死亡,損傷神經(jīng)元釋放異常神經(jīng)遞質(zhì)導(dǎo)致興奮性毒性細(xì)胞損傷和死亡,繼而出現(xiàn)慢性炎癥及進(jìn)一步的細(xì)胞損傷等病理表現(xiàn)[41]。

研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞治療已成為TBI 的一種新型治療方式,多種類型的細(xì)胞都可用于TBI 的治療,如NSC、ESC、NPC、MSCs、人源性畸胎瘤細(xì)胞(NTera2,NT2)、多能成體祖細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞等[42]。其中通過NSC 和MSCs 的分化促進(jìn)細(xì)胞置換是TBI 后的重要治療作用機制[43]。NSC 可通過“生物橋”在SVZ 和損傷部位之間形成通路,直接從SVZ 遷移到損傷部位并分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,從而增強宿主神經(jīng)源性細(xì)胞的遷移[44]。此外,內(nèi)皮細(xì)胞通過產(chǎn)生可溶性生長因子,如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)刺激NSC 的增殖和分化以及成神經(jīng)細(xì)胞的遷移[45]。

目前,由于NSC 和NPCs 難以大量產(chǎn)生,在臨床試驗中受到限制,而MSCs 由于易于分離、免疫抑制特性以及缺乏倫理爭議的特點,被認(rèn)為是具有臨床應(yīng)用前景的治療細(xì)胞[46]。相關(guān)研究證明TBI 后,MSC 移植細(xì)胞可以在損傷部位存活和遷移,有助于神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)修復(fù)和運動功能。在Mahmood等[47]的臨床前研究中,將MSC 直接遞送到大腦中的受損組織,或通過靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)注射間接遞送,可顯著改善TBI 引起的運動和認(rèn)知缺陷,并且輸注的MSC 能夠繞過血腦屏障提高TBI 后大腦中神經(jīng)保護(hù)因子的表達(dá)。Munoz 等[48]的研究表明,將MSCs 直接植入海馬體后,MSCs 促進(jìn)了內(nèi)源性NSC的增殖、遷移和分化。此外,MSC 的分泌組可以通過降低腦組織中細(xì)胞因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)TBI 后的炎癥反應(yīng)。Zhang 等[49]在TBI 患者的顱骨修復(fù)手術(shù)期間將MSCs 直接移植到受傷腦組織中未顯示出不良反應(yīng),表明MSCs 在臨床應(yīng)用中治療TBI 的安全性。

2.2 脊髓損傷

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)可破壞神經(jīng)脈沖傳導(dǎo)信號,導(dǎo)致脊髓的正常功能發(fā)生暫時或永久的變化,是最致殘的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一[50]。目前,SCI 的治療策略主要是促進(jìn)大腦和脊髓受損神經(jīng)元的神經(jīng)再生及突觸重塑以恢復(fù)神經(jīng)功能。Zhao等[51]研究證明,移植的NSC 可以在宿主脊髓中分化為神經(jīng)元,并向損傷部位遷移,促進(jìn)神經(jīng)纖維的修復(fù)和再生,使得脊髓神經(jīng)元的凋亡顯著減少。通過斜面測試、后肢運動功能評分(包括后肢運動的頻率和質(zhì)量)以及運用Mp150 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)評估運動神經(jīng)傳導(dǎo)等顯示,NSC 移植可顯著改善脊髓橫斷模型大鼠的運動功能。

Lu 等[52]的一項研究顯示,NSC 移植能夠特異性支持脊髓損傷后的軸突再生。這項研究中,用特異性ELISA 檢測發(fā)現(xiàn),移植前體外培養(yǎng)的NSC 能夠分泌大量神經(jīng)營養(yǎng)因子,移植2 周后在SCI 模型小鼠中觀察到,NSC 在脊髓損傷部位容易存活,有良好的血管形成,并能短距離遷移,最主要的是宿主中對NSC 所分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子敏感的軸突細(xì)胞得到顯著生長。

2.3 中風(fēng)

中風(fēng)(stroke)是一種急性腦血管疾病,包括缺血性和出血性中風(fēng)。已有報道發(fā)現(xiàn),人類iPSCs 或ESCs 衍生的NSC 系在缺血性和出血性中風(fēng)動物模型中提供神經(jīng)營養(yǎng)因子并促進(jìn)血管生成和神經(jīng)生成[53]。即移植的NSC 可以通過分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞類型并整合到宿主腦組織中充當(dāng)細(xì)胞替代療法,促進(jìn)血管生成并啟動神經(jīng)修復(fù)機制,包括突觸重組和神經(jīng)發(fā)生[54]。近年來,能夠產(chǎn)生成熟神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞類型的NSC 系得到發(fā)展,包括從胎兒組織、胚胎干細(xì)胞(ESCs) 和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)中分離出的NSC,都被證明能促進(jìn)中風(fēng)和類似神經(jīng)障礙后的恢復(fù)。胎兒來源的NSC 是通過在孕后7～21 d 分離人胎兒皮層、中腦或脊髓組織而產(chǎn)生的。當(dāng)這些細(xì)胞在有絲分裂原如表皮生長因子(EGF)和成纖維細(xì)胞生長因-2(FGF-2)中培養(yǎng)時,即使沒有遺傳修飾,也能長期擴增,同時保持其神經(jīng)源性和膠質(zhì)源性多分化潛能[55]。然而,也有研究表明,胎兒NSC 比其他NSC 系衰老速度更快,不利于大規(guī)模誘導(dǎo)分化[56]。胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞(ESC-NSC)的治療用途可能優(yōu)于胎兒來源的NSC,因為理論上有無限永生的ESC-NSC 來源,可以擴大細(xì)胞制造以滿足臨床需求[57]。

目前為止,還沒有臨床試驗測試ESC-NSC 用于中風(fēng),但是Daadi 等[58]在補充有EGF、bFGF 和白血病抑制因子的無血清培養(yǎng)基中,從hESCs 中分離出一種同質(zhì)的可自我更新的hNSC 系,并在大腦中動脈閉塞(MCAO)中風(fēng)模型大鼠中測試這些細(xì)胞的功效,結(jié)果顯示移植的細(xì)胞存活良好,并分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。行為學(xué)分析表明,與移植前組和載體治療組相比,移植NSC 顯著增強了受損對側(cè)前肢的獨立使用。該研究克服了倫理和監(jiān)管方面的挑戰(zhàn),解決了從ESCs 衍生治療性NSC 系的問題,為未來ESC-NSC 治療中風(fēng)的臨床試驗鋪平了道路。

2.4 阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種因大腦皮層和皮層下區(qū)域神經(jīng)元數(shù)量顯著減少導(dǎo)致的記憶喪失和認(rèn)知障礙疾病[59]。在病理學(xué)上,AD 的特征是突觸和神經(jīng)元的廣泛丟失、炎癥以及β-淀粉樣蛋白(Aβ)和過度磷酸化的tau 神經(jīng)原纖維纏結(jié)[60],且Poon 等[61]在AD 患者及動物模型中觀察到神經(jīng)營養(yǎng)素表達(dá)減少和神經(jīng)營養(yǎng)素軸突運輸受損。由于神經(jīng)營養(yǎng)因子在突觸可塑性、神經(jīng)元健康以及學(xué)習(xí)和記憶中發(fā)揮重要作用,因此恢復(fù)AD大腦中丟失的神經(jīng)營養(yǎng)因子是治療的關(guān)鍵所在。Marsh 等[62]的研究將正常小鼠NSC 移植到老年3xTg-AD 小鼠的海馬體中觀察到,NSC 移植可以改善海馬突觸密度,挽救海馬體依賴性學(xué)習(xí)和記憶,為改善認(rèn)知提供了潛在的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。但是NSC 移植后淀粉樣蛋白和tau 的水平?jīng)]有變化,而是由于NSC 產(chǎn)生高水平的神經(jīng)營養(yǎng)因子顯著影響了認(rèn)知和突觸可塑性。

早期研究表明,神經(jīng)生長因子可防止神經(jīng)元死亡,改善興奮性毒性和淀粉樣蛋白毒性動物模型的記憶功能[63],用于治療AD 腦中的神經(jīng)元變性和細(xì)胞死亡。然而,神經(jīng)生長因子不能穿過血腦屏障,通過外周給藥無法將神經(jīng)生長因子輸送到大腦。最新的技術(shù)方法采用生物基因治療方法(基因修飾細(xì)胞),神經(jīng)生長因子可直接插入大腦并擴散2～5 mm[64]。Tuszynski 等[65]在8 名輕度AD 患者中進(jìn)行了一項體外生物基因傳遞的Ⅰ期臨床試驗,將自體成纖維細(xì)胞經(jīng)基因修飾后表達(dá)人神經(jīng)生長因子植入大腦。經(jīng)過22 個月的隨訪,沒有發(fā)現(xiàn)副作用。最終研究顯示NSC 可以進(jìn)行遺傳修飾產(chǎn)生新基因,并且在移植后具有高遷移能力,可用來代替纖維母細(xì)胞,纖維母細(xì)胞在移植后主要用于遞送神經(jīng)生長因子以防止基底前腦膽堿能神經(jīng)元的退化[66]。

2.5 帕金森綜合征

帕金森綜合征(Parkinson’s disease,PD)是僅次于阿爾茨海默病的第2 種最常見的神經(jīng)退行性疾病,影響全球超過600 萬人,其臨床表現(xiàn)主要是是運動功能障礙,具體特征表現(xiàn)為運動遲緩、肌強直、靜止性震顫和姿勢不穩(wěn)[67]。大多數(shù)與PD 相關(guān)的神經(jīng)退行性過程是由病理性α-突觸核蛋白(α-syn)的積累驅(qū)動的,α-突觸核蛋白是一種突觸前神經(jīng)元蛋白,在神經(jīng)系統(tǒng)中聚集形成路易小體(Lewy bodies,LBs)和路易神經(jīng)突(Lewy neurites,LNs)[68]。此外,在病理學(xué)方面,中腦黑質(zhì)致密部(SNpc)中多巴胺能(DA)神經(jīng)元的缺失以及剩余DA 細(xì)胞中稱為LB 的細(xì)胞質(zhì)蛋白聚集體的存在是PD 的標(biāo)志[69]。因此SNpc 神經(jīng)元的缺失導(dǎo)致紋狀體多巴胺能(DA)神經(jīng)元的缺乏,是PD 發(fā)病的主要原因。

DA 細(xì)胞移植被認(rèn)為是最有前途的細(xì)胞替代療法,將中腦DA 神經(jīng)元移植到DA 耗竭的紋狀體中可以恢復(fù)DA 神經(jīng)傳遞以替代PD 患者丟失的神經(jīng)元。最近Zhang 等[70]的研究表明神經(jīng)干細(xì)胞體外分化過程中,使用二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside,TSG)(中藥何首烏的活性成分),能夠增加tuj-1 陽性神經(jīng)元的數(shù)量,提高酪氨酸羥化酶(th)陽性細(xì)胞及多巴胺轉(zhuǎn)運體陽性神經(jīng)元的比例,而后者是成熟DA 神經(jīng)元的晚期標(biāo)志。此外中腦DA 神經(jīng)元的紋狀體移植物可以從各種來源獲得,例如胎兒組織、頸動脈體細(xì)胞及未成熟的視網(wǎng)膜細(xì)胞[71]。而神經(jīng)干細(xì)胞能夠分化為支持性神經(jīng)膠質(zhì)亞型,如星形膠質(zhì)細(xì)胞,這些亞型可以產(chǎn)生關(guān)鍵的生長因子來影響突觸可塑性和神經(jīng)元功能,并調(diào)節(jié)腦血管形成,可能在功能恢復(fù)中發(fā)揮重要作用,因此許多人嘗試使用NSC 進(jìn)行神經(jīng)元置換,推測在神經(jīng)元分化后細(xì)胞將與宿主神經(jīng)元回路整合,以替換在PD中死亡的神經(jīng)元[72]。然而,這項工作具有挑戰(zhàn)性,且結(jié)果喜憂參半。相反,最近的研究表明[73],神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF、GDNF、IGF-1、NGF)的內(nèi)源性分泌或遺傳過度表達(dá)可能為基于NSC 的治療提供一種替代且可能更有前景的方法。移植NSC 分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠增加突觸可塑性,并促進(jìn)神經(jīng)元存活,從而改善認(rèn)知和運動表現(xiàn),增強長期治療作用。

3 總結(jié)與展望

將外源性NSC 通過不同的途徑移植到ND 模型動物體內(nèi)后可通過不同的機制,其發(fā)揮的作用可能有[74](見圖2):(1)NSC 再分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等,改善受損神經(jīng)元的存活情況;(2)促進(jìn)損傷部位的血管生成和神經(jīng)再生;(3)啟動小膠質(zhì)細(xì)胞或周圍造血細(xì)胞所介導(dǎo)的抗炎作用,保護(hù)新生血管;(4)促進(jìn)神經(jīng)纖維的修復(fù)和再生,恢復(fù)神經(jīng)動作電位。

圖2 神經(jīng)干細(xì)胞的治療作用Figure 2 Therapeutic effects of neural stem cells

對于大多數(shù)CNS 損傷,已經(jīng)提出應(yīng)用不同來源的干細(xì)胞來進(jìn)行自發(fā)恢復(fù),但大多只能產(chǎn)生出有限的細(xì)胞表型。最近研究建議將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)用于自體移植,但在應(yīng)用過程中,這些基因調(diào)控的細(xì)胞由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的不受控制整合和重組事件的發(fā)生將導(dǎo)致癌癥形成[75],因而目前臨床上用于神經(jīng)性疾病治療的最佳選擇還是NSC。NSC 與受損細(xì)胞具有相同的組織來源,通常被認(rèn)為是細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)疾病治療的最佳細(xì)胞類型[76]。

NSC 移植到哺乳動物CNS 的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用已經(jīng)進(jìn)行了幾十年,盡管神經(jīng)移植物可以促進(jìn)受損神經(jīng)元的再生與重建,恢復(fù)神經(jīng)功能缺陷,但目前要實現(xiàn)臨床應(yīng)用,仍存在一些關(guān)鍵障礙需要克服,其中包括[6-14]:(1)NSC 的誘導(dǎo)分化和增殖的機制尚不明確,在目前研究水平下尚不能精準(zhǔn)控制NSC 的定向分化,從而影響了NSC 移植的治療效果;(2)移植物與宿主之間的多種免疫學(xué)問題,鼠源性NSC 與人源性NSC 的種屬差異以及動物內(nèi)環(huán)境與人體內(nèi)環(huán)境的差異導(dǎo)致的移植后排斥反應(yīng);(3)移植的NSC 具有成瘤的高風(fēng)險以及倫理學(xué)問題等;(4)NSC 在活生物體內(nèi)生存率低和治療效果不佳。

即使有諸多障礙與困難存在,但是在干細(xì)胞治療和研究方面,NSC 科學(xué)為人們更好理解疾病打下了基礎(chǔ),NSC 移植的治療潛力已經(jīng)在不同的ND 動物模型中得到證實,這將是神經(jīng)退行性疾病最具前景的治療方法。目前,NSC 治療的潛在機制尚不清楚,還需要更多的基礎(chǔ)研究進(jìn)一步解決上述問題。但是當(dāng)前大多數(shù)NSCs 研究依賴于嚙齒動物模型,而人與嚙齒動物的NSCs 有很大不同,許多疾病風(fēng)險基因在二者之間表達(dá)存在較大差異。因此本文通過綜述NSCs 的基本特性、來源及目前細(xì)胞移植的技術(shù)手段在各種神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用進(jìn)展,以期為建立人神經(jīng)干細(xì)胞嵌合動物模型的成熟方法提供參考,從而在動物水平實現(xiàn)對人腦的模擬,更好地為神經(jīng)科學(xué)研究提供動物模型和研究基礎(chǔ)。