高原肺水腫動物模型研究進(jìn)展

向雪梅,郭鑫,曾佳容,劉倍余,張耀雷,孫紅玉

(西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,成都 610083)

高原肺水腫(high altitude pulmonary edema,HAPE)是一種危及生命的疾病,主要發(fā)生在迅速上升到高原但未適應(yīng)高海拔環(huán)境的個體[1-3]。HAPE的患病率約為1%～2%[4],通常隨著海拔的上升而增加[5]。HAPE 的早期體征表現(xiàn)為咳嗽、活動時呼吸困難、勞累、作業(yè)能力下降,然后逐漸發(fā)展為靜息時呼吸困難、端坐呼吸、紫紺、咳嗽,重者因呼吸衰竭而死亡[6]。臨床上將肺水腫分為肺泡性水腫和間質(zhì)性肺水腫,前者具有明顯癥狀和體征,易為臨床所發(fā)現(xiàn);后者發(fā)展隱匿緩慢,可無癥狀和體征,故易被臨床檢查所忽略,通常也稱為亞臨床肺水腫。HAPE 早期及恢復(fù)期多表現(xiàn)為間質(zhì)性肺水腫,肺紋理增粗;進(jìn)展期與穩(wěn)定期病變主要累及肺實(shí)質(zhì)[7-8]。

自從20 世紀(jì)60 年代HAPE 被認(rèn)為是非心源性肺水腫以來,已經(jīng)提出過許多病理生理學(xué)假說來解釋在年輕且健康的個體中突然出現(xiàn)肺水腫的現(xiàn)象。既往認(rèn)為,肺動脈高壓是HAPE 產(chǎn)生的主要機(jī)制,為HAPE 的形成提供了血液動力學(xué)基礎(chǔ)[9-10]。目前認(rèn)為,低氧引起的低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor,HIF-1α)等介導(dǎo)的多個基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變,進(jìn)而引起生化代謝、神經(jīng)調(diào)控、免疫應(yīng)答、血管功能、體液平衡等的異常改變。近日,格日力[11]、馬四清等[12]、吳剛等[13]提出HIF-1 或許將成為調(diào)控低氧肺動脈高壓的一個靶點(diǎn),HIF-1 是細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境調(diào)控基因表達(dá)最重要的轉(zhuǎn)錄因子。目前已證實(shí)HIF-1 可以控制人體內(nèi)多達(dá)數(shù)百種(占2%～5%基因組)低氧反應(yīng)基因[14]。HIF-1α 以氧依賴性方式降解,在正常氧時被降解,缺氧時HIF-1α 被保護(hù)免于降解,增加低氧靶基因表達(dá),增加對低氧的適應(yīng)性[15]。這些靶基因的表達(dá)能夠促進(jìn)紅細(xì)胞、毛細(xì)血管的生成以保持氧供,加速糖酵解、抑制線粒體的呼吸來維持ATP 供給、調(diào)節(jié)血紅蛋白水平和氧化還原酶類活性來調(diào)控免疫及體液平衡、一些能夠調(diào)節(jié)血管緊張度、細(xì)胞凋亡和存活基因轉(zhuǎn)錄因子的蛋白。最新研究表明表觀遺傳學(xué)與HIF 協(xié)同參與低氧轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[16]?？傊?所有細(xì)胞和分子防御的目的是為了恢復(fù)能量代謝和保持氧的穩(wěn)態(tài)。經(jīng)過近70 年的探索,HAPE 動物模型的制備方法及病理生理特點(diǎn)取得一些進(jìn)展[6,17-23]。本文梳理了相關(guān)進(jìn)展,綜述如下。

1 HAPE 模型的制備方法

根據(jù)低氧暴露方式分為缺氧暴露、轉(zhuǎn)基因動物模擬缺氧、缺氧暴露聯(lián)合其它方法3 種,具體制備如下。

1.1 缺氧暴露

低壓低氧是國內(nèi)外制備HAPE 模型最常用的方法,動物低氧方案各有利弊,尚無確切統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化方案。接下來分為大鼠和其它動物兩部分闡述。

1.1.1 大鼠

大鼠是最常用的動物,包括Sprague-Dawley 品系(SD)、Wistar 品系。早在1971 年就出現(xiàn)了用低壓低氧的方式制備HAPE 模型,Bartlett 等[24]將成年SD 雄性大鼠在低壓艙中暴露于4200 m(450 mmHg)21 d。結(jié)果表明,暴露在高海拔環(huán)境下的動物會經(jīng)歷1 個早期階段,此時,肺的重量增加,如果暴露持續(xù)足夠長的時間(在這些條件下為20～21 d),水腫消退,肺泡增生的速度加快,肺泡表面積增加,這一變化可能具有適應(yīng)性意義。雖然該研究并沒有獲得典型的HAPE 動物模型,可能是因?yàn)楹０尾粔蚋?但為早期的HAPE 模型研究提供了有益的參考。

1983 年,劉士群等[25]采用成年大白鼠,摸擬5000 m 高原。結(jié)果以斑塊狀分布的間質(zhì)性肺水腫為主,肺泡性肺水腫出現(xiàn)的數(shù)目少,且程度輕。實(shí)驗(yàn)證明了大白鼠在模擬5000 m下48～72 h 可發(fā)生間質(zhì)性肺水腫,也證明了高原缺氧所引起的肺動脈壓升高和局部肺血液灌流增加是產(chǎn)生HAPE 的主要機(jī)制。劉士群等[26]緊接著在1984 年模擬6000 m高原以觀察大、小鼠的缺氧反應(yīng),發(fā)現(xiàn)在低壓缺氧的24～72 h,大、小白鼠的肺含水量均趨向增高。劉士群的這兩項(xiàng)研究為國內(nèi)的HAPE 模型奠定了基礎(chǔ)。

隨后,不管是在模型制備上,還是機(jī)制探索上都取得了一定的進(jìn)展。首先,在模型制備上,Colice等[27]選用兩種SD 的變異品系,即Hilltop(H)和Madison(M)來探索HAPE 動物模型,得到的都是輕度間質(zhì)性HAPE,但M 比H 大鼠在24000 英尺模擬下暴露9～12 h 后會出現(xiàn)更嚴(yán)重的HAPE。其次,在HAPE 的發(fā)生機(jī)制上,到1999 年大多數(shù)研究低氧致水腫機(jī)制的工作都集中在在肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的改變和肺血管床張力改變的因素上。Tomlinson 等[28]將目光放到了氣道上皮功能上,發(fā)現(xiàn)像人類一樣,中度低壓缺氧的亞急性暴露(氣壓=0.5 atm,24 h)會抑制SD 大鼠氣道上皮的鈉轉(zhuǎn)運(yùn)。之后,在藥物預(yù)防和治療HAPE 上,Berg 等[29]假設(shè)銀杏葉提取物可以預(yù)防HAPE,將SD 大鼠置于高原艙(380 mmHg,10%氧濃度)24 h,但該模型無HAPE典型的組織病理表現(xiàn),猜測其原因可能是海拔不夠高,或者暴露時間不夠長。以上的這些研究以最終獲得間質(zhì)性HAPE 為主,少有肺泡性HAPE。

2015 年,王雷琛等[30]通過缺氧暴露的方法(模擬海拔6000 m,72 h),得到間質(zhì)性和肺泡性HAPE模型,猜測其原因可能是海拔較高、暴露時間較長。2020 年,林雪等[21]不僅重復(fù)了王雷琛等[30]的模型,同時還設(shè)置了實(shí)地低氧組(4200 m,28 d),比較這兩種不同低氧脅迫方式構(gòu)建HAPE 模型的效果。結(jié)果兩組SD 大鼠HAPE 模型構(gòu)建成功,且都得到肺泡性水腫。以上兩項(xiàng)研究提示6000 m 72 h 低壓低氧暴露可得到肺泡性HAPE 模型,未來需要更多的研究判斷其穩(wěn)定性。此外,這是初次在實(shí)地低氧環(huán)境中建立適合高海拔地區(qū)的、簡單有效且可復(fù)制的大鼠HAPE 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚21]。

綜上所述,SD 大鼠在低壓低氧條件下可誘導(dǎo)間質(zhì)性HAPE 模型,也可誘導(dǎo)肺泡性HAPE 模型,這主要取決于海拔高度、持續(xù)時間、上升速率等[31]。

除了常用的SD 大鼠,國內(nèi)外學(xué)者也選用Wistar大鼠,模擬海拔5000～6000 m,暴露24～72 h 制備HAPE 模型,鏡下可見明顯的肺泡隔增寬、毛細(xì)血管充血等間質(zhì)性肺水腫表現(xiàn),提示得到的HAPE模型以間質(zhì)性肺水腫表現(xiàn)為主,肺泡性肺水腫少見[32-34]。

1.1.2 其它動物

除了大鼠,人們嘗試用綿羊來制備HAPE 模型。Bland 等[35]和Landolt 等[36]未能檢測到成年綿羊在缺氧期間肺淋巴流量的增加。之后大量證據(jù)表明,綿羊?qū)θ毖醯姆窝芊磻?yīng)可能與其他哺乳動物不同[37-39],甚至有文獻(xiàn)報(bào)告缺氧會導(dǎo)致新生綿羊血管外肺水減少[40]。以上研究表明綿羊不適合制備HAPE 模型。

王雷琛等[41]采用小鼠(昆明種),雌雄各半,模擬6000 m 高原,共72 h,觀察到肺間質(zhì)性及肺泡性水腫。王雷琛2015 年發(fā)表的兩篇文章[30,41]所用的大鼠品系不同,但高原條件一致,均表現(xiàn)出間質(zhì)性和肺泡型水腫,并與林雪等[21]的報(bào)道一致,這是一項(xiàng)可喜的發(fā)現(xiàn),提示該條件下誘導(dǎo)的HAPE 模型的穩(wěn)定性較好。

2003 年,Kleinsasser 等[42]用豬制備HAPE 模型。豬的體積大,可以使用肺部X 射線來幫助診斷肺水腫。選用8～10 周齡的家養(yǎng)白豬在缺氧(18 468 英尺,10%氧濃度)下暴露1 周。只有1 頭豬X射線陽性,但是肺氣體交換障礙和支氣管肺泡灌洗液變化提示早期肺水腫。

常見的HAPE 高原模擬以6000 m 為主,暴露時長在24～72 h。2020 年,石繼鵬等[22]探索新的HAPE 模型,選用新的品系(BALB/c 小鼠),共暴露72 h,且模擬的海拔高達(dá)8000 m,此前最高的實(shí)驗(yàn)記錄為25 000 英尺[43](約7600 m),結(jié)果顯示,肺泡壁明顯增厚,肺泡間充血伴大量炎癥細(xì)胞浸潤,提示肺泡性HAPE 模型建立成功。

綜上所述,制備HAPE 模型建議選用大鼠,其病理生理表現(xiàn)與人類HAPE 病例相似[37,44-48]。海拔越高,病理生理表現(xiàn)越明顯,急性的暴露時長通常在1～3 d。

1.2 模擬缺氧-轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)

轉(zhuǎn)基因工程是當(dāng)今最先進(jìn)的技術(shù)之一,將此技術(shù)應(yīng)用在HAPE 模型領(lǐng)域的最新文獻(xiàn)發(fā)表在2020年,并立即引起眾多學(xué)者的關(guān)注。Gojkovic 等[49]條件性刪除小鼠骨髓細(xì)胞中的Von Hippel-Lindau 因子(VHL),研究低氧反應(yīng)對肺水腫的影響,該模型顯示出一些最重要的HAPE 癥狀,確定了髓系VHL缺失小鼠作為HAPE 模型的可能性。

隨后,Nikinmaa[50]對此進(jìn)行評論,指出Gojkovic的模型具備HAPE 的大多數(shù)的癥狀,并提出,這是一種有潛力、有希望的HAPE 動物模型。稍后,Swenson 等[51]也展開評論,提出Gojkovic 的小鼠炎癥性HAPE 模型是分子生物學(xué)和基因操作的一個杰作,是在無肺炎的情況下產(chǎn)生的炎性肺水腫,可能在HAPE 的晚期并依賴于HIF 的機(jī)制中發(fā)揮作用,但不能作為HAPE 的標(biāo)準(zhǔn)模型,對于研究和治療HAPE 的研究者而言,HAPE 的動物模型一直是像圣杯一樣的追求[52]。一個好的小型動物模型將允許進(jìn)行更廣泛和高通量的實(shí)驗(yàn),以更好地了解病理生理過程,并篩查預(yù)防和治療的藥物或非藥物策略,尚需更多的學(xué)者探索HAPE 模型,不能停止建立HAPE 標(biāo)準(zhǔn)模型的腳步[51]。

1.3 缺氧暴露聯(lián)合其它方法

1.3.1 缺氧暴露聯(lián)合疲勞誘導(dǎo)

缺氧和勞累已被確定為HAPE 發(fā)展的兩個主要因素[53],使動物產(chǎn)生勞累的方法包括跑臺力竭運(yùn)動、游泳、睡眠干擾等,其中使用得最多的是跑臺力竭運(yùn)動[54]。

自1937 年第1 例HAPE 病例報(bào)道后,到1968年僅有幾百例的臨床案例報(bào)道而無相關(guān)的機(jī)制報(bào)道。Whayne 等[48]人假設(shè)HAPE 可能與肺小動脈收縮、心輸出量增加等有關(guān),于是利用Long-Evans 大鼠(150～225 g)誘發(fā)了一種早期形式的肺水腫,即血管周圍水腫。模型的制備方式為低氧暴露聯(lián)合游泳運(yùn)動。結(jié)果表明,缺氧或小動脈阻斷后的肺動脈高壓均可引起幼鼠早期肺水腫。該研究奠定了大鼠作為研究HAPE 機(jī)制實(shí)驗(yàn)動物的基礎(chǔ)。

國內(nèi)學(xué)者模擬高原4000～6000 m,用游泳(每日游6 次,每次40 min)或跑臺力竭運(yùn)動(15～20 m/min,每次40 min)使動物勞累,用SD 大鼠來進(jìn)一步復(fù)制HAPE 動物模型,成功建立間質(zhì)性HAPE 模型[55]、低氧習(xí)服模型[56]、出血性HAPE 模型[23]。

在國外的報(bào)道中,2010 年,Bai 等[17]模擬高原4700 m,讓大鼠行走48 h,每4 h 停頓1 次,表現(xiàn)為典型的出血性肺水腫,與單純?nèi)毖趸騿渭冞\(yùn)動相比,缺氧和運(yùn)動相結(jié)合對肺泡-毛細(xì)血管屏障的損害更為嚴(yán)重,缺氧和勞累可以在不引起肺部炎癥的情況下出現(xiàn)HAPE 樣癥狀[17]。2012 年She 等[57]復(fù)制以上Bai 的模型研究了遠(yuǎn)端肺形態(tài)學(xué)的細(xì)節(jié)。肺片顯示肺間質(zhì)增厚和肺泡腔中紅細(xì)胞的腫脹。提示通過復(fù)制Bai 的模型,得到較好的重現(xiàn)效果。

2019 年,Paul 等[43]引入肺部chest X-ray 檢查更準(zhǔn)確地診斷HAPE,另外,模擬海拔高達(dá)25 000 英尺(約7620 m),雄性SD 大鼠游泳直到筋疲力盡,擦干后立即放置在缺氧模擬室內(nèi)18 h。經(jīng)X 射線檢測的該HAPE 模型得到證實(shí),大鼠死亡率很低,有望應(yīng)用于HAPE 模型的建立。Scott 等[45]還觀察到炎癥和HAPE 是協(xié)同事件,彼此之間沒有起因和影響。

綜上,低氧暴露聯(lián)合疲勞誘導(dǎo)似乎適合制備肺泡性、出血性等更為危重的HAPE 模型。

1.3.2 缺氧暴露聯(lián)合內(nèi)毒素感染

大鼠通常能很好地耐受高原,不容易發(fā)展成肺水腫。Ono 等[58]用腸炎沙門氏菌內(nèi)毒素預(yù)處理雄性SD 大鼠(重200～250 g),模擬高原4300 m,暴露24 h,組織學(xué)證據(jù)顯示,內(nèi)毒素預(yù)處理后低氧暴露的大鼠肺內(nèi)形成了斑塊狀分布的肺水腫,組織學(xué)形態(tài)與HAPE 患者類似。

1.3.3 缺氧暴露聯(lián)合病毒感染

正如Ono 等[58](1993 年)研究了內(nèi)毒素預(yù)處理增加了大鼠對HAPE 的易感性那樣,Carpenter 等[59]假設(shè)先前存在的病毒性呼吸道感染會增加幼小動物對低氧引起的肺水腫的敏感性。Carpenter 等[59]用鼠副流感病毒(仙臺病毒)感染幼鼠(22～24 d;50～60 g),然后將幼鼠暴露在缺氧環(huán)境下(常壓,10%氧濃度)24 h,結(jié)果表明,先前存在的病毒性呼吸道感染會使幼鼠對低氧環(huán)境下肺血管通透性的敏感性增強(qiáng)。這一發(fā)現(xiàn)與當(dāng)時發(fā)表的一些文獻(xiàn)相似,即被診斷出HAPE 的兒童往往在高海拔暴露之前就已患有呼吸道感染[60],提示早前的呼吸道感染可能增加了兒童患HAPE 的機(jī)率。

1.3.4 缺氧暴露聯(lián)合化學(xué)藥物誘導(dǎo)

2004 年,曾南陽[61]在5200 米高原實(shí)地,給Wistar 大白鼠注射腎上腺素(0.05 mg/100 g)。所有動物給藥后均出現(xiàn)心衰引起肺水腫最后死亡。鏡下見典型的肺泡性水腫病理特征。該研究指出腎上腺素誘發(fā)的大鼠高原性肺水腫均有心衰癥狀,且高原性肺水腫體征出現(xiàn)早、病情發(fā)展快。

2011 年,陳有等[62]也在高原實(shí)地(3700 m)展開研究,他們給雄性新西蘭大白兔注射生理鹽水(共400 mL)。該研究設(shè)計(jì)較全面,其一,輸入生理鹽水誘導(dǎo)間質(zhì)型HAPE 向肺泡型肺水腫轉(zhuǎn)變;其二,加以地塞米松來促進(jìn)肺水通道蛋白5 表達(dá),以減輕肺水腫;其三,使用心得安抑制肺水通道蛋白5 表達(dá),以降低重吸收功能,促進(jìn)建立肺泡性HAPE 模型。結(jié)果顯示,地塞米松組未出現(xiàn)肺泡型HAPE,而心得安組出現(xiàn)2 只肺泡型肺水腫動物,這與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。此外,該研究考慮到臨床上多數(shù)HAPE 患者發(fā)病前有夜間入睡困難的情況,設(shè)置睡眠干擾組,通過輸液加睡眠干擾方式,能使37.5%(3/8)動物誘導(dǎo)出肉眼可見的肺泡型HAPE 動物模型。

2 HAPE 動物模型評價(jià)指標(biāo)

動物暴露于低氧環(huán)境后,會引發(fā)一系列的缺氧應(yīng)激反應(yīng),主要表現(xiàn)為肺動脈壓升高、動脈血?dú)飧淖?、肺含水量增?支氣管肺泡灌洗液中的總蛋白及炎性細(xì)胞因子水平增加,肺泡毛細(xì)血管滲透率增加、肺泡液體清除能力下降、肺屏障通透性增加、生化及氧化應(yīng)激指標(biāo)改變、組織學(xué)表現(xiàn)異常等。HAPE 模型常用評價(jià)指標(biāo)見表1。

表1 高原肺水腫動物模型的評價(jià)指標(biāo)Table 1 Evaluation indicators of HAPE models

3 結(jié)語

在這篇綜述中,我們描述了HAPE 常用制備方法以及部分病理生理特點(diǎn)。由于高原低張性缺氧是引起HAPE 的根本原因[63],因此缺氧環(huán)境是制備HAPE 模型必不可少的。缺氧環(huán)境有2 種方式可以實(shí)現(xiàn),第1 種方式是在高原上進(jìn)行實(shí)地研究,但由于受到地理?xiàng)l件的限制,開展的并不多;第2 種,同時也是最常用的方式是進(jìn)行高原模擬,即使用高原艙,據(jù)報(bào)道已有復(fù)合低壓艙可模擬高原低氣壓,高溫、低溫、干熱、紫外線照射等環(huán)境因素,為HAPE動物模型研究提供了實(shí)驗(yàn)平臺[64]。有時只依靠缺氧暴露并不能得到滿意的模型,為了進(jìn)一步制備穩(wěn)定、可靠的HAPE 模型,部分研究會聯(lián)合其它方法,包括疲勞、內(nèi)毒素感染、病毒感染、藥物注射等。HAPE 模型最常用方法是缺氧暴露,其次是低氧暴露聯(lián)合疲勞,之后是低氧暴露聯(lián)合其它方法。

用于創(chuàng)建HAPE 的動物包括大鼠、小鼠、豬、兔、靈長類和綿羊[42,65-67]。國內(nèi)外常用雄性大鼠,因在臨床上男性患病率比女性高。不同于肺水腫動物模型,其制備方法多種多樣,包括化學(xué)藥物、高原暴露等[68]。HAPE 作為肺水腫的一部分,至今仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)、可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?隨著新技術(shù)的發(fā)展與普及,轉(zhuǎn)基因工程小鼠模型已經(jīng)出現(xiàn)并適用于炎性HAPE 研究[50]。另外,動物實(shí)驗(yàn)難以像臨床一樣通過肺部CT 或超聲[69]檢查診斷HAPE。因此,并沒有明確的評價(jià)指標(biāo)證實(shí)HAPE 動物模型建立成功,可通過完善CT 檢查以進(jìn)行優(yōu)化。

總的來說,標(biāo)準(zhǔn)的HAPE 動物模型的缺失仍然是阻礙HAPE 研究發(fā)展的關(guān)鍵原因之一。HAPE 動物模型發(fā)展至今,取得了可喜的成果,但仍然存在很多難題與痛點(diǎn),包括動物對高原的耐受性、高原條件限制、無明確的評價(jià)指標(biāo)、指向性不強(qiáng)、重現(xiàn)性不好等,有待進(jìn)行更多的基礎(chǔ)研究。